Summary
Axonal transport er en afgørende mekanisme for motor neuron sundhed. I denne protokol giver vi en detaljeret metode til sporing af aksonal transport af sure rum og mitokondrier i motorneuronaxoner ved hjælp af mikrofluidiske kamre.
Abstract
Motor neuroner (MNs) er stærkt polariserede celler med meget lange axoner. Axonal transport er en afgørende mekanisme for MN sundhed, der bidrager til neuronal vækst, udvikling og overlevelse. Vi beskriver en detaljeret metode til brug af mikrofluidiske kamre (MCC' er) til sporing af axonal transport af fluorescerende mærkede organeller i MN axoner. Denne metode er hurtig, relativt billig, og giver mulighed for overvågning af intracellulære signaler i tid og rum. Vi beskriver en trinvis protokol for: 1) Fremstilling af polydimethylsiloxan (PPC'er) MPC'er; 2) Plating af ventralrygmarvexplanter og MN dissocieret kultur i MPC'er; 3) Mærkning af mitokondrier og sure rum efterfulgt af levende konfokal fantasi; 4) Manuel og halvautomatisk axonal transport analyse. Endelig viser vi en forskel i transporten af mitokondrier og sure rum i HB9::GFP ventral rygmarvexplantaxoner som bevis for systemets gyldighed. Alt i alt er denne protokol et effektivt værktøj til at studere aksonal transport af forskellige aksonale komponenter, samt en forenklet manual for MFC brug for at hjælpe med at opdage rumlige eksperimentelle muligheder.
Introduction
N'er er stærkt polariserede celler med lange axoner og når op til en meter lang hos voksne mennesker. Dette fænomen skaber en kritisk udfordring for vedligeholdelsen af MN-forbindelse og -funktion. Derfor, Ncs afhænger af korrekt transport af information, organeller, og materialer langs axoner fra deres celle krop til synapsen og tilbage. Forskellige cellulære komponenter, såsom proteiner, RNA, og organeller er shuttled regelmæssigt gennem axoner. Mitokondrier er vigtige organeller, der rutinemæssigt transporteres i Menneskers Grænser. Mitokondrier er afgørende for korrekt aktivitet og funktion af Menneskers tandområder, der er ansvarlige for ATP bestemmelse, calcium buffering, og signalering processer1,2. Den axonale transport af mitokondrier er en velstuderet proces3,4. Interessant, defekter i mitokondriel transport blev rapporteret at være involveret i flere neurodegenerative sygdomme og specifikt i MN sygdomme5. Sure rum tjener som et andet eksempel for iboende organeller, der bevæger sig langs MN axoner. Sure rum omfatter lysosomer, endosomer, trans-Golgi apparater, og visse sekretoriske vesikler6. Fejl i aksonal transport af sure rum blev fundet i flere neurodegenerative sygdomme samt7, og de seneste papirer fremhæve deres betydning i MN sygdomme8.
For effektivt at kunne studere axonal transport anvendes mikrofluidiske kamre, der adskiller somatiske og axonalerum,ofte9,10. De to betydelige fordele ved mikrofluidic system, og segmentering og isolering af axoner, gør det ideelt til undersøgelse af subcellulære processer11. Den rumlige adskillelse mellem de neuronale cellelegemer og axoner kan bruges til at manipulere de ekstracellulære miljøer i forskellige neuronale rum (f.eks. axoner vs. soma). Biokemiske, neuronal vækst /degeneration, og immunofluorescens analyser alle drage fordel af denne platform. MCC'er kan også hjælpe med at studere celle-til-celle kommunikation ved at coculturing neuroner med andre celletyper, såsom skeletmuskulatur12,13,14.
Her beskriver vi en enkel, men præcis protokol til overvågning af mitokondrier og sure rumtransport er i motoriske neuroner. Vi viser endvidere brugen af denne metode ved at sammenligne den relative procentdel af retrograd og anterograd bevægelige organeller, samt fordelingen af transporthastighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pasning og behandling af dyr i denne protokol blev udført under tilsyn og godkendelse af Tel Aviv University Committee for Animal Ethics.
1. MFC-forberedelse
- PDMS støbning i primære forme (Figur 1)
- Køb eller skabe primære forme (vafler) efter en detaljeret protokol9.
- Brug trykluft til at fjerne enhver form for snavs fra waferplatformen, før du fortsætter til belægningstrinnet. Overfladen af vafler skal se glat og klar.
- Fyld en beholder med 50 ml flydende nitrogen. Klargør en 10 ml sprøjte og 23 G nål.
BEMÆRK: Alle procedurer fra dette trin skal udføres i en kemisk hætte. - I den kemiske hætte skal du bruge sprøjten og nålen til at samle 2 ml flydende nitrogen. Selvom det kan virke som om der er trukket luft, fyldes sprøjten med nitrogen (figur 1A). Anbring den waferholdige plade i en beholder, der kan forsegles.
- Skru en chlorotrimethylsilane flaske, gennembore gummihætte ved hjælp af kvælstof-fyldte sprøjte, og injicere hele indholdet af sprøjten i flasken. Uden at trække nålen ud, drej flasken på hovedet og trække tilbage 2 ml chlorotrimethylsilane.
BEMÆRK: På grund af sprøjtens tryk sprøjtes en lille mængde chlorotrimethylsilane ud af nålen. For at undgå fare skal nålen vende mod emhættens indervæg (Figur 1B). - Spred chlorotrimethylsilane ensartet i beholderen (fra trin 1.1.4), men ikke direkte på wafer- eller waferholdige plader. Luk beholderen og inkuber i 5 min pr. wafer.
BEMÆRK: Hvis det er første gang, waferen er belagt med chlorotrimethylsilane, skal der tillades en 1 h inkubation for hver wafer. - Tag ikke vafler og beholderen ud af den kemiske hætte i 30 min.
FORSIGTIG: Chlorotrimethylsilane er meget flygtig. - PDMS-basen (se Materialetabel ) vejesi et 50 ml rør, og PDMS hærdningsmiddel tilsættes i forholdet 16:1 (f.eks. 47,05 g base og 2,95 g hærdningsmiddel). Bland i 10 min ved hjælp af en lav hastighed rotator.
- PdMS hældes i hver waferholdig plade i den ønskede højde (Figur 1C).
BEMÆRK: Brug af tynde mikrofluidiske kamre (op til 3-4 mm) forbedrer overholdelsen af dyrkningsskålen og forhindrer lækage. - Anbring alle plader ne i en vakuumekssikkator i 2 timer (Figur 1E). Denne proces fjerner luften fanget i PDMS, og dermed fjerne luftbobler og danner en klar, ensartet skimmel.
- Pladerne anbringes i en ovn i 3 timer (eller natten over) ved 70 °C (figur 1E).
BEMÆRK: Pladerne skal være plan, når de placeres i ovnen.
- PDMS støbning i epoxy forme
BEMÆRK: Fordi wafer forberedelse er dyrt, kræver særligt udstyr, og kan beskadige de skrøbelige vafler, er det muligt at generere epoxy replikaer af vafler. Replikaerne er billigere, mere holdbare, og kan bruges til masseproduktion af mikrofluidiske kamre.- Cast og hærd PDMS (som beskrevet i 1.1.8-1.1.11) i den oprindelige wafer.
- Fjern og afskær overskydende dele af PDMS, så kun de mikrofluidiske elementer og det funktionelle område, der er nødvendigt for at behandle dem, fjernes til mikrofluidiske kamre.
- Pak straks PDMS med tykt tape for at forhindre, at det akkumulerer støv.
- Vælg en vævskultur kvalitet plast skål, der passer til hele PDMS inde og give plads til epoxy omkring det. Afstanden fra PDMS til plastskålen skal være mindre end 5 mm.
- Forbered en lille mængde PDMS blandet i et forhold på 10:1 (base:hærdningsmiddel). Den friske flydende PDMS vil blive brugt til at lime den faste PDMS på bunden af plastpladen.
- Påfør en minimal mængde af den flydende PDMS til midten bunden af plastpladen og fjern derefter tape fra PDMS og holde det til plast parabol bunden. Sørg for, at de mikrofluidiske elementer vender opad.
- Lad PDMS hærde i 30 min i en 70 °C ovn.
- Epoxyharpiksen fremstilles ved at blande basen og hærdningsmidlet i et forhold på henholdsvis 100:45 i et reagensglas. Forskellige epoxy harpikser kan have forskellige blanding nøgletal. Det nødvendige volumen for en almindelig 100 mm plade er ca. 40 ml.
- Lad epoxyblandes godt i 10 min i en rotator, indtil blandingen bliver synligt homogen (dvs. der er ingen synlige fiber-lignende artefakter i væsken).
- Epoxyblandingen centrifugeres ved 400 x g i 5 min for at fjerne luftbobler, der er fanget indeni.
- Under centrifugering spredes et tyndt lag silikonefedt rundt om væggene og alle andre udsatte plastdele af dyrkningsskålen. Dette vil forhindre epoxy fra polymerisering med fad plast og vil gøre det muligt at fjerne den hærdede epoxy let i slutningen af protokollen.
- Epoxyen hældes langsomt i skålen, indtil den dækker PDMS helt og går ud over den med mindst 5 mm. Undgå dannelse af bobler i epoxyen ved at holde nul afstand mellem røret og pladen. Placer pladen på et sikkert sted, så den ikke flyttes de næste 48 timer.
- Efter 48 timer skal epoxyen være fuldstændig hærdet. Pladen sættes i en forvarmet ovn ved 80 °C i 3 timer til endelig hærdning.
- Fjern den hærdede epoxy fra pladen og den oprindelige PDMS formen ved forsigtigt at hive plastvæggen af pladen, indtil den går i stykker. Det bør derefter let adskille fra epoxy og skalle af.
- Når ekstraheret, tør det resterende fedt af den nye epoxy replika og indsætte det på hovedet (dvs. med de replikerede mikrofluidiske elementer vender op) i en ny kultur parabol. Epoxy replika er nu klar til PDMS støbning.
- Brug trykluft eller N2 til at blæse eventuelle rester af PDMS eller snavs fra epoxy formen og skyl det 2x med isopropanol. Fyld det en tredje gang og inkuber i 10 min på en orbital shaker plade. Skyl formen igen 3x med isopropanol og kassér den resterende væske. Føntør med luft eller N2 eller sted i en 70 °C ovn, indtil tør.
BEMÆRK: Følg sikkerhedsprocedurerne, når du arbejder med og kasserer isopropanol. - Hold formen plader lukket indtil støbning. Følg trin 1.1.8.-1.1.11.
- Stansning og skulptur af PDMS i en MFC (Figur 2)
- Skær og fjern PDMS formen fra pladen ved at følge (+) mærker på vafler ved hjælp af en skalpel. Brug ikke magt, da formene er skrøbelige (Figur 2A).
- Følg anvisningerne på skitsen for at stanse og skære kamrene afhængigt af den eksperimentelle opsætning (Figur 2B-F).
- For rygmarvseksplantekultur (Figur 2C,E) punch to 7 mm brønde i den distale side af en den store MFC. Find brøndene på en måde, som de overlapper med kanalkanterne. På den proksimale side, punch en 7 mm godt i midten af kanalen, med minimal overlapning, således at tilstrækkelig plads vil være tilbage til explants. Punch to yderligere 1 mm huller i de to kanter af den proksimale kanal. Drej MFC med mikrofluidiske elementer opad, og ved hjælp af en 20 G nål, skære tre små explant huler på den udstansede 7 mm godt.
- For dissocieret MN kultur (Figur 2D,F), punch fire 6 mm brønde i kanterne af de to kanaler i en lille MFC.
- Sterilisering af MFC til brug af vævskultur
- Spred 50 cm lange tapebånd på bænken. Tryk på og træk kammeret tilbage for at vende tape (både øvre og nedre ansigter) og fjerne rå snavs. Placer de rene kamre i en ny 15 cm plade.
BEMÆRK: Tryk ikke direkte på de mikrofluidiske elementer, når de vender opad. - Inkuberkamrene i analytisk kvalitet 70% ethanol i 10 min på en orbital shaker.
- Ethanolen bortskaffes, og kamrene tørres i en vævskulturhætte eller i en ovn ved 70 °C.
- Spred 50 cm lange tapebånd på bænken. Tryk på og træk kammeret tilbage for at vende tape (både øvre og nedre ansigter) og fjerne rå snavs. Placer de rene kamre i en ny 15 cm plade.
- Placering af MFC på en glasbundskål
- Placer kammeret i midten af en vævkultur kvalitet 35 mm /50 mm glas bund fad og anvende mindre kraft på kanterne for at gøre PDMS og parabol bund binde. For at undgå at knække glasbunden skal du altid påføre kraft oven på en fast overflade.
- Inkuber 10 min i 70 °C. Tryk på kamrene for at styrke overholdelsen af pladen.
- Inkuber under UV-lys i 10 min.
- Belægning og dyrkning
- Der tilsættes 1,5 ng/ml poly-L-ornithin (PLO) til begge rum. Sørg for, at PLO løber gennem kanalerne ved at pipettere overfladebehandlingsmediet et par gange direkte i kanalindgangen.
- Undersøg mikrofluidic kammeret under et let mikroskop med 10x forstørrelse for at kontrollere for tilstedeværelsen af luftbobler. Hvis luftboblerne blokerer mikrorillerne, skal MFC'en placeres i en vakuumekssikkator i 2 min. Senere, fjerne den overskydende luft, der fik fanget i kanalerne ved pipettere belægning medier gennem dem. Inkuber natten over.
- Udskift PLO med laminin (3 μg/ml i DDW) til nattens inkubation på samme måde.
- Før plating, vaskes laminin med neuronal kultur medium.
2. Neuronal kultur plating
- Dissocieret motor neuron kultur
- Brug lige saks og fine pincet, dissekere en rygmarv ud af en E12.5 ICR-HB9::GFP mus embryo. Arbejd i en 1X HBSS-opløsning med 1% penicillin-streptomycin (P/S) (figur 3A-C).
- Brug mikrodissektionssaks til at fjerne meninges og ryghorn (Figur 3D).
- Rygmarvsstykkerne samles og overføres til røret (#1) med 1 ml HBSS + 1% P/S.
- Skær rygmarven til små stykker ved hjælp af buet saks og vente på stykkerne til at bosætte sig.
- Der tilsættes 10 μL trypsin 2,5% og anbringes i et 37 °C vandbad i 10 min. Efter 5 min blandes ved at trykke på røret. Stykkerne skal danne en helix-lignende klump.
- Klumpen overføres til et nyt rør (#2) indeholdende 800 μL fordannet L-15, 100 μL bsa 4% og 100 μL på 10 mg/ml DNase. Grind 2x, så vent i 2 minutter for at lade uissociere stykker bosætte sig. Overfør supernatanten til et nyt rør (#3).
- Der tilsættes 100 μL BSA 4%, 20 μL på 10 mg/ml DNase og 900 μL komplet neurobasalt medium (CNB, se Tabel over materialer og Tabel 1). Grind 8x og vent 2 min. Saml supernatant til rør #3.
- Gentag trin 2.1.7 og male 10x. Saml supernatant til rør #3. En lille mængde væv bør efterlades i bunden af røret.
BEMÆRK: Hvis der stadig er en stor klump i bunden af røret #2, gentages trin 2.1.8. - Tilsæt 1 ml BSA 4% pude til bunden af rør #3.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 5 min. Supernatanten afsmids.
- Resuspender cellepelletved forsigtigt at banke på røret, og tilsæt derefter 1 ml CNB-medium. Pipette 6x og tilsættes 20 μL på 10 mg/ml DNase.
- Suppleres med yderligere 5 ml CNB-medium og overfør 3 ml til et nyt rør (#4).
- Der tilsættes 1 ml 10,4 % massefyldesgradientmedium (se tabel 2)til bunden af hvert rør (#3 og #4). Der skal vises en skarp faseadskillelse mellem de to grænseflader.
- Centrifugeres ved 775 x g i 20 min ved stuetemperatur (RT). Centrifugedecelerationen skal indstilles til et lavt niveau for at undgå nedbrydning af faseseparationen.
- Celler skal være flydende og fremstå som en uklar indfaset mellem mediet. Cellerne opsamles fra begge rør i et nyt rør (#5),der allerede indeholder forvarmet 1 ml CNB-medium.
- Tilsæt yderligere 4-6 ml CNB-medium.
- Tilsæt 1 ml BSA 4% pude til bunden af røret.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 5 min ved RT. Supernatanten afser den, og pelleten suspenderes forsigtigt med 1 ml CNB-medium.
- Tæl cellerne. Der forventes et udbytte på 0,75-1 x 106 MN pr. rygmarv.
BEMÆRK: Ventral rygmarv indeholder også andre neuronale undertyper udover motoriske neuroner (f.eks. interneuroner). MN renhed afhænger for det meste af fjernelse af dorsale områder under dissektion og evnen til at nå MN beriget rostral områder. For at sikre, at de afbildede neuroner er MN'er, anbefales det at bruge en musstamme med en endogen MN-markør, såsom HB9::GFP-mus. For at opnå ren MN-kultur (men med nedsat celleudbytte) er det muligt at anvende FACS rensning15. - Plating dissocieret MN kultur i MFC
- Koncentrer 150.000 MN pr. kammer ved centrifugering ved 400 x g i 5 min.
- Aspirer er supernatanten, og resuspender forsigtigt cellerne i det rige neurobasale medium (RNB) ved 4 μL pr. MFC. RNB suppleres med yderligere 2% B27 og 25 ng/mL BDNF.
- Fjern mediet fra begge rum, så der efterlades et lavt volumen, der svarer til ~10 μL i det distale rums brønde. Det fremstår som en tynd ring af medium i brønden omkredsen.
- Indlæs langsomt 4 μL celler i kanalen. Tag 4 μL af brønden i den anden side af kanalen ud, og læg dem langsomt direkte ind i kanalen for at vende det aktuelle flow og maksimere celletætheden i kanalen.
- Kontroller, at cellerne er kommet ind i kanalen ved hjælp af et 10x lysmikroskop, og placer kammeret i kuvøsen i 30 minutter uden at tilføje flere medier.
- Tilsæt langsomt ~ 10-15 μL RNB i de proksimale og distale brønde og læg kamrene i rugemaskinen i yderligere 15 min.
- Efter denne inkubation tilsættes langsomt ~ 75-80 μL RNB i hver brønd.
- Dissocieret MN kultur vedligeholdelse
- En dag efter plating (DIV1), erstatte medium med RNB suppleret med 1 μM cytosin arabinoside (Ara-C) for at hæmme glial vækst.
- To dage efter Ara-C-applikationen (DIV3) udskiftes mediet med frisk CNB-medium i det proksimale rum (uden Ara-C).
- For at forbedre krydsningen af axoner gennem mikrogrooves, anvende RNB suppleret med 25 ng/ml af glial celle-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) og 25 ng/ml af hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF) kun til det distale rum. Der opretholdes en volumengradient på mindst 10 μL pr. brønd mellem de ekstitale akstalbrønde (højere volumen) og de proksimale brønde.
- Opdater mediet hver anden dag. Det kan tage axoner op til 4-6 dage til at krydse distally.
- Rygmarvexplant kultur
- Brug lige saks og fine pincet, dissekere en rygmarv ud af en E12.5 ICR-HB9::GFP mus embryo. Arbejd i en 1X HBSS-opløsning med 1% penicillin-streptomycin (P/S) (figur 3A-C).
- Brug mikrodissektionssaks til at fjerne meninges og ryghorn (Figur 3D).
- Skær rygmarven i 1 mm tykke tværgående sektioner (Figur 3E). Bortskaf alt medium fra mfc'ens proksimale rum.
- Opsaml en enkelt rygmarvseksplante med en pipette i et samlet volumen på 4 μL. Injicer eksplanten så tæt som muligt på hulen, og træk eventuel kraftig væske ud af den proksimale brønd via de laterale udtag (1 mm slag). Eksplanterne skal suges ind i den proksimale kanal.
- Der tilsættes langsomt 150 μL af spinalnavets explant-medium (SCEX, se Materialetabel og Tabel 3) til den proksimale brønd.
- Rygmarvexplant kultur vedligeholdelse
- Tilføj SCEX-mediet i det proksimale rum og det fyldige SCEX-medie (SCEX med 50 ng/ml BDNF og GDNF) i det distale rum. Der opretholdes en volumengradient på mindst 15 μL pr. brønd mellem de distale brønde (højere volumen) og den proksimale brønd.
- Opdater mediet hver anden dag. Det kan tage axoner op til 3-5 dage til at krydse distally.
3. Aksonal transport (figur 4A)
- Mærkning af mitokondrier og sure rum
- Forbered frisk SCEX medium (eller CNB for dissocieret MN) indeholdende 100 nM Mitotracker Deep Red FM og 100 nM LysoTracker Red. Inkuber i 30-60 min. ved 37 °C. Andre farver kan bruges, så længe deres fluorophores ikke overlapper hinanden.
- 3x vaskes med varmt CNB/SCEX-medium. Pladerne er klar til billeddannelse.
- Live-billedbehandling
- Anskaf 100 time-lapse billedserie af aksonal transport med 3 s intervaller, med i alt 5 min pr. film.
BEMÆRK: Det billedbehandlingssystem, der blev anvendt i denne undersøgelse, omfattede et omvendt mikroskop udstyret med roterende diskkonfokal, kontrolleret via propriety celle imaging software, 60x olie linse, NA = 1,4, og en EMCCD kamera. Film blev erhvervet i et kontrolleret miljø ved 37 °C og 5% CO2.
BEMÆRK: Længere eller kortere time-lapse film kan afbildes, afhængig af eksperimentet. Selv natten film kan optages, hvis det er nødvendigt. Men det er afgørende at forsøge at reducere eksponeringstiden og lasermagt, samt antallet af samlede billeder, for at reducere fototoksicitet og blegning under film erhvervelse.
- Anskaf 100 time-lapse billedserie af aksonal transport med 3 s intervaller, med i alt 5 min pr. film.
4. Billedanalyse (figur 4-5)
- Analyse af partikeltransportfordeling og massefylde ved hjælp af kymografanalyse
- Åbn filen i FIJI. Separate kanaler, der trykker på Billede | Stakke | Værktøj | Deinterleave.
- Angiv billedegenskaber ved at trykke på Billede | Egenskaber.
- Vælg værktøjet Segmenteret streg ved at højreklikke på stregikonet. Angiv Bredde til 8-10 ved at dobbeltklikke på stregikonet. Vær i overensstemmelse med den samme stregbredde i hele analysen.
- Marker en segmenteret linje efter axonstien fra distalt til proksimale. Dobbeltklik for at stoppe linjemarkeringen.
- Klik på t for at føje et nyt linjeområde (ROI) til ROI-chef. Føj dette til en regnearksanalysetabel.
- Klik på m for at måle øksens område og længde. Føj dette til analysetabellen.
- Generer en kymograph ved at klikke plugins | KymoToolBox | Tegn Kymo. Alternativt kan andre kymograph generation plugins til rådighed.
- Tæl manuelt bevægelige (retrograd eller anterograde) og ikkebevægelige partikler og læg dem til bordet i den korrekte kolonne.
BEMÆRK: Partikler klassificeres som bevægelige anterograde (dvs. bevæger sig til venstre i kymografen) eller tilbageskridt (dvs. bevæger sig til højre), hvis deres forskydning er højere end 10 μm i den specifikke retning. Det er muligt at måle forskydningen blot ved at markere en vandret linje med linjeikonet og trykke på m. Immobile partikler eller partikler, der ikke opfylder forskydningskriterierne, defineres som ikke-bevægelige (figur 4B).
- Sporing af enkelt partikel: Manuel sporing
- Download det manuelle sporingsplugin til FIJI-software (udviklet af Fabrice P. Cordelière) fra http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
- Åbn filen i FIJI/ImageJ. Brug indstillingen Roter til at justere MFC-rillerne vandret.
- Hvis du vil forbedre signal-støj-forholdet, hvis det er nødvendigt, skal du klikke på Proces | Træk baggrund fra.
- Åbn plugin'et Manuel sporing. Angiv parametrene (f.eks. pixelstørrelse, tidsinterval osv.) i henhold til det specifikke mikroskop, der bruges til billeddannelse. For de viste resultater her var mikroskopet og objektivet 0,239 μm/pixel, og rammeintervallet var 3 s.
- Hent sporene X- og Y-koordinater, og gem resultaterne ved at kopiere teksten til regnearket.
- Analysere film med flere kanaler ved at klikke på Billede | Farve | Flet kanaler for at flette kanalerne og derefter kun spore samlokaliserede puncta.
- Enkelt partikelsporing: Semi-automatiseret sporing (Figur 5)
- Åbn analysesoftwaren. Denne undersøgelse brugte Bitplane Imaris software version 8.4.1.
- Skift til Overdel i den øverste menu.
- Klik på Billedbehandling | Swap tid og Z | Ok.
- Klik på Rediger | Egenskaber for billede (Ctrl+I) | Geometri | Række i Voxel-størrelse. Angiv egenskaber for billede i henhold til den anvendte mikrokopiopsætning.
BEMÆRK: For de data, der vises her, var mikroskop- og linseforholdet 0,239 μm/pixel. - Klik på Alle lige fjerne, og rediger tidsintervallet. Brug f.eks. Klik på knappen Nulstil nederst , eller klik på Ctrl+B.
- Tilføj et lag af pletter øverst til venstre ved at klikke på et ikon med små gule pletter. Nederst til venstre åbnes en ny menu til redigering af spots.
- Tryk på højre blå pil, indtil staffageregistreringen starter.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bortfiltrere nogle af punkterne ved hjælp af filteret nederst til venstre i vinduet. Kontroller filmen et par gange for at se, at der er valgt et tilstrækkeligt antal prikker. - Kontroller eller konfigurer parametrene, så de passer til de eksperimentelle behov. For eksempel, Max Afstand = 12 μm (Den maksimalt tilladte afstand mellem to forskellige steder til stadig at medtage dem i samme enkelt spor); Max Gap Size = 1 (Antallet af rammer, som et spor har lov til at gå glip af og stadig betragtes som ét spor).
- Klik på Indstillinger, og klik derefter på Spor typografi = Fra, Punkter = Kugle.
- Brug filterlinjentil at vælge forskellige filtre til justering. I de data, der er angivet her, fjernede Spor varighed = 9 f.eks. Når alle parametre er angivet, skal du klikke på højre grønne pil. Yderligere redigering er ikke mulig efter dette trin.
- Klik på Den lille blyant med prikker for at redigere alle sporene manuelt.
- Se filmen (Figur 5B). Hvis der opstår en fejl, er der flere mulige muligheder:
- Hvis du vil afbryde forbindelsen til et spor, skal du klikke på indstillingen Objekt og vælge de to steder, der skal afbrydes med Ctrl, og vælge Afbryd forbindelsen.
- Hvis du vil oprette forbindelse til et spor, skal du klikke på indstillingen Objekt, vælge de to steder, der skal forbindes med Ctrl, og vælge Opret forbindelse.
- Hvis du vil slette et sporTrack/Objecteller et punkt, skal du skifte til skærmen med ikonet Almindelig blyantog vælge Slet.
- Hvis du vil tilføje pletter manuelt, skal du skifte til skærmen Almindeligt blyantikon. Nederst på skærmen er der et manuelt sporingsmærke. Sørg for, at afkrydsningsfeltet Opret automatisk forbindelse er V. På selve filmen, for at tilføje et sted, holde Shift-knappen og Venstre-Klik.
- Hvis du vil føje et sted til et eksisterende spor, skal du vælge et ønsket spor (gult) og en ramme, skifte til skærmen Med ikon for almindelig blyant og tilføje et punkt manuelt. Når hele filmen er færdig, skal du skifte til ikonet, der ligner en rød graf (Statistik). Det er muligt at redigere de analyserede parametre senere. Hvis du vil redigere, skal du trykke på det svenske tasteikonnederst til venstre på skærmen . For eksempel: Position X, Position Y.
- Tryk på ikonet, der ligner flere disketter, Eksporter alle statistikker.
BEMÆRK: Regnearksoutputtet kan enten håndteres direkte eller analyseres yderligere ved hjælp af den offentliggjorte kode9, der bruges til denne analyse, som vil blive delt efter behov. Følgende parametre udtrækkes fra analysen: Hastighed, sporforskydning, Kørselslængde, Hastighed (herunder retningsbestemthed), Stopantal, Gennemsnitlig stopvarighed, Alpha, Retningsændringer og Øjeblikkelig hastighed. En detaljeret forklaring af hver parameter er beskrevet i Gluska et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den beskrevne protokol blev museembryonale HB9::GFP rygmarvseksplanter dyrket i MFC (Figur 4A). Explants blev dyrket i 7 dage, når axoner helt krydsede ind i det distale rum. Mitotracker Deep Red og Lysotracker Røde farvestoffer blev tilsat de distale og proksimale rum for at mærke mitokondrier og sure rum (Figur 4C). Axoner i de distale riller blev afbildet, og filmene blev analyseret som følger: For det første sammenlignede vi den generelle bevægelsesfordeling ved hjælp af kymografanalyse (Figur 4B,D). Denne analyse viste kun en skævhed i retrogradretningen i sure rum (ikke-bevægelige = 77,1 ± 9,5%; retrograd = 16,9 ± 8,3%, anterograd = 6 ± 5%; Figur 4E), men ikke i mitokondriel transport (nonmoving = 83,4 ± 6,8%; retrograd = 10,5 ± 6,9%; anterograd = 6,8 ± 5,1%; Figur 4F). Kymograph analyse blev anvendt til at kvantificere partikeltætheden, afslører et højere antal mitokondrielle partikler sammenlignet med sure rum i HB9::GFP rygmarvexplantaxoner (Mitokondrier = 0,46 ± 0,13; Sure rum = 0,3 ± 0,07 partikler/μm axon, figur 4G).
Dernæst blev enkeltpartikeltransportanalyse udført ved hjælp af halvautomatisk software efterfulgt af intern kode (Figur 5A-B). Denne analyse viste, at selv om der generelt har samme partikelhastighed (figur 5C), viste kun sure rum, men ikke mitokondrier, en skævhed i retning af retrogradbevægelse, når man observerede hastighedsfordelingen (figur 5D).
Figur 1: Silikone skimmel forberedelse. Skematisk tegning, der beskriver proceduren for chlorotrimethylsilane wafer udrensning. (A) For det første blev der tilsat 50 ml flydende nitrogen til en passende beholder. Arbejde i en kemisk hætte, en sprøjte og nål blev brugt til at trække 8 ml flydende nitrogen. Hele indholdet af sprøjten blev sprøjtet ind i chlorotrimethylsilane flasken. Flasken blev vendt med hætten nedad og 8 ml chlorotrimethylsilane blev trukket tilbage. BB) Chlorotrimethylsilane spredes i beholderen (ikke direkte på waferen). Beholderen skal lukkes, efterfulgt af 5 min inkubation for hver støbeform. (C) Flydende PDMS blev hældt i hver wafer op til den ønskede højde. (D) Alle plader blev anbragt sammen i en vakuumekssikkator i 2 timer efterfulgt af 3 timer i natten over i en 70 °C ovn. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: MFC specialiseret design. (A) Polymeriseret PDMS skabelon taget ud af formen ved hjælp af en metal skalpel. (B) Afhængigt af forsøgsopstillingen blev der anvendt enten 6 mm, 7 mm eller 1 mm punchers til stansning af PDMS-skabelonerne. (C) For explant kultur i MFC, 7 mm og 1 mm punchers blev brugt, og en 20 G sprøjte blev brugt til at gøre "huler" for nem explant indsættelse. (D) For dissocieret MN kultur MFC, en 6 mm puncher blev brugt til at skabe fire brønde på kanalen kanter. (E-F) Illustrationer af de endelige MFC-figurer, der er beskrevet i henholdsvis C og D. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Neuronal kultur. (A) E12.5 mus embryo blev placeret på plads efter hoved, hale, og hud blev fjernet for at eksponere neuralrør. bB) Dissektion af hele rygmarven. (C) Ved hjælp af blide pincet, blev meninges skrællet væk fra rygmarven. (D) Venstre panel: Fjernelse af rygmarven laterale segmenter fra ventral rygmarv til at give bedre MN rensning. Højre panel: Repræsentant billede af adskillede MN kultur i MFC. HB9::GFP-axoner, der krydses til det distale rum (grønt). Hoechst farvning indikerer neuronal kerner (blå). (E) Rygmarvseksiplanter genereret ved at dissekere 1 mm tykke tværgående dele af ventralrygmarven. Repræsentativt billede af HB9::GFP (grøn) rygmarvseksplantoner i en MFC. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Aksonal transport af mitokondrier og sure rum i MN. (A) Illustration af axonal transport essay. Lysotracker Red og Mitotracker Deep Red blev tilføjet til både de proksimale og distale rum i MFC, indeholdende HB9::GFP ventral rygmarvseksplante. BB) Kymograph-analyse. Bevægelige partikler blev defineret som bevægelige anterograd eller retrograd efter forskydning på mere end 10 μm i den retning. Roterende eller immobile partikler blev talt som ikke-bevægelige. Scale bar = 10 μm. (C) Første ramme af en time-lapse film, der viser primær HB9::GFP mus rygmarv explant axoner dyed med Lysotracker rød til tag sure rum og Mitotracker Deep Red til tag mitokondrier. Skalabar = 10 μm. (D) Repræsentative kymografer med en typisk akonal bevægelse af sure rum og mitokondrier. Skalabar = 10 μm. (E) Kymograph analyse af mitokondriel axonal transport, ****p < 0,0001, Anova med Holm-Sidak korrektion (n = 77 axoner). Scale bar = 10 μm (F) Kymograph analyse af sure rum axonal transport, ** p < 0,01, **** p < 0,0001, Anova med Holm-Sidak korrektion (n = 77 axoner). (G) Axonal partikeltæthed analyse af mitokondrier og sure rum, **** p < 0,0001, Student's t-test (n = 77 axoner). Fejllinjer repræsenterer værdier med SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Semiautomatiseret enkeltpartikelanalyse til måling af organellehastighed. (A) Skematisk arbejdsgang for halvautomatisk enkeltpartikeltransportanalyse. (B) Ventral rygmarvexplant axoner blev analyseret for enkelt partikel sporing. Analysen software er i stand til at spore enkelt axonale partikler i time-lapse film, som angivet for mitokondrier (gule prikker, øvre panel) og sure rum (grønne prikker, nederste panel). (C) Gennemsnitshastigheden ændrede sig ikke mellem mitokondrier og sure rum, Mann Whitney-test (n = 417 mitokondrier, n = 371 sure rum). Fejlstænger repræsenterer værdier med SD. (D) Fordeling af mitokondrielle og sure rum retrograd og anterograd hastigheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Komplet Neurobasal Medium – til 50 ml | ||
| Ingrediens | Volumen | Koncentration |
| Neurobasal | 47 ml | |
| B27 (B27) | 1 ml | 2% |
| Hesteserum | 1 ml | 2% |
| P/S | 0,5 ml | 1% |
| L-glutamin (glutamax) | 0,5 ml | 1% |
| Beta-Mercaptoethanol (50mM) | 25 μL | 25 μM |
| BDNF (10ug/ml) | 5 μL | 1ng/ml |
| GDNF (10ug/ml) | 5 μL | 1ng/ml |
| CNTF (10ug/ml) | 2,5 μL | 0.5ng/mL |
Tabel 1: Opskrift på fremstilling af komplet neurobasal (CNB) opløsning.
| Optiprep-løsning – til 10 ml | ||
| Ingrediens | Volumen | Koncentration |
| DDW (DDW) | 5,27 ml | |
| Tæthedsforløbsmedium (Optiprep) 60 % | 1,73 ml | 10,4% (m/v) |
| Tricine 100mM | 1 ml | 2% |
| Glucose 20% (w/v) | 2 ml | 2% |
Tabel 2: Opskrift på fremstilling af densitetsgradientmediumopløsning.
| Rygmarvexplantmedium (SCX) – til 20 ml | ||
| Ingrediens | Volumen | Koncentration |
| Neurobasal | 19,5 ml | |
| B27 (B27) | 200 μL | 2% |
| P/S | 100 μL | 1% |
| L-glutamin (glutamax) | 100 μL | 1% |
| BDNF | 50 μL | 25ng/ml |
Tabel 3: Opskrift på fremstilling af spinalnavets eksplanten (SCEX) opløsning.
| MN Kultur | Rygmarv explants |
| Længere procedure før plating | Kort procedure – dissekering og plade |
| Ekstra forsigtighed nødvendig for plating i MFC | Nemmere at pladei mfc |
| Høj koncentration af motoriske neuroner uden gliaceller – mere præcis | Tilstedeværelse af gliaceller og andre neuronale typer – mere fysiologiske |
| Ubegrænsede manipulationsmuligheder på både Soma og axoner | Begrænsede manipulationsmuligheder på cellelegemer |
| Nem immunfarvning til både cellelegemer og axoner | Lav effektivitet under immunfarvning af cellelegemer i eksplanten. |
| Høj effektivitet af virusinfektion | Meget lav effektivitet af virusinfektion |
Tabel 4: Sammenligning mellem rygmarvseksplanter og dissocieret MN-kultur baseret på afspærringer af hastighed, gennemførlighed, glial tilstedeværelse, manipulationsmuligheder, immunfarvning og virusinfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskriver vi et system til at spore axonal transport af mitokondrier og sure rum i motoriske neuroner. Denne forenklede in vitro-platform giver mulighed for præcis kontrol, overvågning og manipulation af subcellulære neuronale rum, hvilket muliggør eksperimentel analyse af motorneuronlokale funktioner. Denne protokol kan være nyttig til at studere MN sygdomme som ALS, at fokusere på at forstå den underliggende mekanisme af axonal transport dysfunktion i sygdommen10,16. Desuden kan dette system også anvendes til at studere transport af trofiske faktorer9,16, microRNA10, mRNA8, og mærkede proteiner i sunde og syge N'er eller i andre neuroner, såsom sensoriske9 eller sympatiske axoner14. En lignende metode kan også anvendes til at studere organelle transport i et kokultursystem, såsom Mf'er dyrkes med skeletmuskulatur celler12 eller sympatiske neuroner cocultured med kardiomyocytter14. MFC-systemet kan anvendes til at generere aktive NMJs17,18 og undersøge effekten af synapsedannelse på axonal transport16.
Denne protokol har flere fordele i forhold til andre protokoller for dyrkning af neuroner i MFC og ved hjælp af levende billedbehandling til at analysere axonal transport: 1) MPC'er er kommercielt tilgængelige af flere producenter. Men selvfremstilling af MCC'er er yderst omkostningseffektiv i forhold til det kommercielle alternativ. En enkelt PDMS wafer giver fire store MPC'er eller ni små på den minimale bekostning af flere amerikanske dollars for PDMS harpiks selv. 2) De selvfremstillede MCC'er kan ændres for at imødekomme specifikke eksperimentelle behov (f.eks. ændring af brøndenes størrelse og placering, hvilket øger tykkelsen af MFC PDMS). 3) MCC'erne kan uigenkaldeligt fastgøres til en plade (via plasmabinding), men kan også genbruges flere gange for at reducere risikoen for kontaminering. 4) PPMMS-MCC'erne er gennemsigtige, hvilket gør dem ideelle til levende billeddannelse ved at have reduceret baggrund, hvilket er afgørende for axonale transportanalyser, hvor skelnen mellem signal og støj kan være en begrænsende faktor. 5) Rygmarvexplant kultur er meget effektiv og hurtig. En embryonal rygmarv kan give op til 30 explants, nok til 10 MPC'er. Dette kan hjælpe med at spare tid og materialer, og sikrer, at selv en gravid mus med få embryoner kan producere et vellykket eksperiment. Se en detaljeret sammenligning af rygmarvseksplanten og dissocieret MN-kultur i tabel 4.
Denne protokol er relativt enkel og billig. Men det kræver ekspertise på flere tekniske områder. Fremstilling og håndtering af MFC skal være nøjagtig og skånsom, for at undgå strukturelle fejl og skabelse af luftbobler i det obligatoriske vakuumtrin (1.1.10), f.eks. Under det valgfrivakuumtrin (1.6.2) er det vigtigt at rense al luften, eller det blokerer aksonalkrydsning, men også holder vakuumet kort for at undgå løsrivelse af MFC'en fra glasset. Vær meget opmærksom på dissektion protokol trin, da det er vigtigt at korrekt fjerne meninges og ryghorn, samt at forsøge at skære brikkerne til den rigtige størrelse for at indsætte dem til MFC's hule uden at bruge fysisk kraft. Enhver overdreven fysisk kraft, der påføres MFC, kan nemt løsne rillerne eller hele MFC'en, og derfor bør proceduren udføres forsigtigt. Dyrkning af mn'er og plettering dem i MFC skal være relativt hurtig, som MNs tendens til at samle og miste levedygtighed hurtigt under stressforhold såsom den lave medium volumen af plating trin. Pletteringen i MFC bør ske i lav volumen for at muliggøre korrekt fastgørelse af neuronerne i MFC-kanalen, og efter ikke mere end 30 min varmemedium bør tilføjes meget forsigtigt for at forhindre løsrivelse af MN'erne.
Efter flere dage i kulturen, og når axoner har udvidet til den distale rum, kulturerne er klar til at gennemgå organelle farvning efterfulgt af erhvervelse af axonal transport film og endelig en særlig procedure for billedanalyse. Analysen kan udføres enten ved en enkelt partikelsporing over tid eller ved hjælp af en automatiseret eller halvautomatisk sporingsalgoritme. Det er vores erfaring, at automatiserede metoder er mindre tidskrævende, men har flere ulemper. Hovedsageligt, automatiseret sporing pålidelighed er faldet, med overfyldte axoner, der krydser stier. Desuden har automatiserede algoritmer en nedsat evne til at skelne mellem overlappende partikler. Derfor anbefales det at udføre manuel eller halvautomatisk sporing. Generelt er semiautomatiseret sporing at foretrække, da det er mindre tidskrævende, men manuel sporing kan være en god mulighed, når der ikke er tilgængelig betalt software. En grundig sammenligning mellem manuel og automatisk analyse findes i Gluska et al.9.
Afslutningsvis kan vedtagelsen af denne enkle protokol give vigtige data til undersøgelse af axonal transport af forskellige cellulære komponenter. Det kan tilpasses til at passe til en mangfoldighed af billeddannelse opsætninger og neuronal undertyper, samt til cocultures af neuroner med andre celler. Det giver også mulighed for særskilt rumlig farmakologisk manipulation af enten cellelegemer eller axoner for at forstå grundlæggende mekanismer for neuronal sundhed og for at forbedre udviklingen af lægemidler for sygdomme med ændret axonal transport.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (ISF, 561/11) og Det Europæiske Forskningsråd (EF, 309377).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software - version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium - Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
