Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60993
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2
1Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Sagol School of Neuroscience, Tel Aviv University
* These authors contributed equally

Summary

הובלה axonal היא מנגנון מכריע. לבריאות תא העצב המוטורי בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה מפורטת למעקב אחר התחבורה סיבי של תאים חומצי והמיטו, בתאי עצב מוטוריים באמצעות מיקרופלואידיג צ'יימברס.

Abstract

מוטוריים נוירונים (MNs) הם תאים מקוטב מאוד עם axons ארוכים מאוד. הובלה axonal היא מנגנון מכריע עבור בריאות MN, לתרום צמיחה עצבית, פיתוח, והישרדות. אנו מתארים שיטה מפורטת לשימוש בתאי מיקרו-פלואידים (mfcs) למעקב אחר העברת אקונאליות של אורגלים בעלי תווית של מוצרים בעלי מחשב בצורת סיבי MN. שיטה זו היא מהירה, זולה יחסית, ומאפשרת ניטור של רמזים תאיים בחלל ובזמן. אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול עבור: 1) ייצור של polydiמתיל siloxane (PDMS) MFCs; 2) ציפוי של הרחבות בחוט השדרה והתרבות המונתק של MN ב-MFCs; 3) הוספת תוויות לתאי המיטומטר וחומציים בעקבות הדמיון הישיר; 4) ניתוח הובלה באופן ידני וחצי אוטומטי. לבסוף, אנו להפגין הבדל בהובלה של תאים חומציים וחומצי של HB9:: gfp ובעל חוט השדרה לחקור אקסונים כהוכחה של תוקף המערכת. לגמרי, פרוטוקול זה מספק כלי יעיל ללימוד התחבורה סיבי של רכיבי סיבי שונים, כמו גם מדריך פשוט עבור שימוש MFC כדי לעזור לגלות אפשרויות ניסיוני מרחבי.

Introduction

MNs הם תאים מקוטנים מאוד עם axons ארוכים, מגיע עד מטר אחד באורך של בני אדם למבוגרים. תופעה זו יוצרת אתגר קריטי לשמירה על קישוריות ותפקוד של MN. כתוצאה מכך, MNs תלויה בהובלה תקינה של מידע, אורגלים וחומרים לאורך האקסונים מהגוף הסלולארי שלהם אל הסינפסה וחזרה. רכיבים סלולאריים שונים, כגון חלבונים, RNA ואורגלים, מדילג באופן סדיר דרך האקסונים. מיטוכונמיטויום הם אורגלים חשובים אשר מועברים באופן שגרתי ב-MNs. מיטוגרם הם חיוניים לפעילות תקינה ולתפקוד של MNs, האחראי על הוראת ATP, אגירת סידן ותהליכי איתות1,2. התחבורה האקונלית של המיטו, היא תהליך לומד היטב3,4. מעניין, פגמים בתחבורה מיטוכונדריאלי דווחו להיות מעורבים במספר מחלות ניווניות ובמיוחד במחלות MN5. התאים החומציים משמשים כדוגמה נוספת לאורגלים פנימיים הזזים לאורך MN axons. תאי חומציים כוללים ליזוזומים, אנזומים, מכשירי טרנס-גולג'י ושלפוחיות מסוימות. פגמים בתחבורה סיבי של תאים חומציים נמצאו במספר מחלות ניווניות כמו גם7, העיתונים האחרונים להדגיש את חשיבותם במחלות MN8.

כדי לחקור ביעילות את התחבורה סיבי, מיקרופלואידיג צ'יימברס המפרידים בין התאים הסומונטיים והאקאליות משמשים לעתים קרובות9,10. שני היתרונות המשמעותיים של מערכת המיקרופלואידיג, והתקשורת והבידוד של האקסונים, מעבדים אותו באופן אידיאלי ללימוד תהליכים תת-תאיים11. ניתן להשתמש בהפרדה המרחבית בין גופי התאים העצביים לבין האקסונים כדי לתמרן את סביבות החילוץ של התאים העצביים השונים (לדוגמה, אקסונים vs. סומה). , והתנוונות שהכל מהווה תועלת. מפלטפורמה זו Mfcs יכול גם לסייע ללמוד תקשורת תא לתאים על ידי הנוירונים coculturing עם סוגי תאים אחרים, כגון שרירי השלד12,13,14.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט אך מדויק עבור ניטור המיטו, התחבורה תא חומצי בתוך נוירונים מוטוריים. אנו מציגים את השימוש בשיטה זו על-ידי השוואת האחוז היחסי של מארגני נסיגה וכיתות מעבר, כמו גם הפצת מהירות התחבורה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

טיפול בבעלי חיים בפרוטוקול זה בוצע בפיקוח ובאישור הוועדה לאתיקה בעלי חיים באוניברסיטת תל אביב.

1. הכנה MFC

  1. הליהוק של PDMS בתבניות ראשיות (איור 1)
    1. לרכוש או ליצור תבניות ראשיות (וופלים) בעקבות פרוטוקול מפורט9.
    2. השתמש באוויר בלחץ כדי להסיר כל סוג של לכלוך מפלטפורמת וופל לפני שתמשיך לשלב הציפוי. המשטח של הופלים צריך להיראות חלק וברור.
    3. מלא מיכל עם 50 מ ל של חנקן נוזלי. להכין מזרק 10 מ ל ו-23 מחט G.
      הערה: יש לבצע את כל ההליכים מצעד זה קדימה במכסה כימי.
    4. בכיפה הכימית, השתמשו במזרק ובמחט לבריכת 2 מ ל של חנקן נוזלי. למרות שזה נראה כמו אוויר נמשך, המזרק הוא מלא חנקן (איור 1א). מניחים את הלוחית המכילה וופל במיכל שניתן לאיטום.
    5. בורג לפתוח בקבוק כלורוטריתיל silane, לנקב את כובע גומי באמצעות מזרק חנקן ממולא, ולהזריק את כל התוכן של המזרק לתוך הבקבוק. מבלי למשוך את המחט, להפוך את הבקבוק הפוך ולצייר בחזרה 2 מ ל של כלורוטרימתיל silane.
      הערה: בגלל לחץ המזרק, כמות קטנה של כלורוטרימתילציאן מותז מתוך המחט. כדי למנוע סכנה, הצבע את המחט לכיוון הקיר הפנימי של המכסה (איור 1ב).
    6. התפשטות כלורוהטרימתיל בצורה אחידה במכולה (משלב 1.1.4), אך לא ישירות על הלוחית המכילה וופל או וופל. סגור את המיכל ואת הדגירה עבור 5 דקות לכל וופל.
      הערה: אם זו הפעם הראשונה שהופל מצופה בכלורוטריתיל, יש להתיר הדגירה של 1 h עבור כל וופל.
    7. אל תקחו את המיכל והמכולה מחוץ למכסה הכימי במשך 30 דקות.
      התראה: כלורוטרימתיתיל סילאנה הוא מאוד נדיף.
    8. שוקלים בסיס PDMS (ראה טבלת חומרים) בתוך שפופרת 50 mL ולהוסיף pdms ריפוי סוכן ביחס של 16:1 בהתאמה (למשל, 47.05 g של בסיס, 2.95 g של ריפוי הסוכן). מערבבים עבור 10 דקות באמצעות מסובבי מהירות נמוכה.
    9. יוצקים PDMS לתוך כל צלחת המכיל וופל לגובה הרצוי (איור 1ג).
      הערה: שימוש בתאי מיקרופלואידיג דקים (עד 3-4 מ"מ) משפר את הדבקות בצלחת התרבות ומונע דליפה.
    10. מניחים את כל הצלחות יחד בתוך desiccator ואקום עבור 2 h (איור 1E). תהליך זה מסיר את האוויר לכוד בתוך ה-PDMS, ובכך מסלק בועות אוויר ויוצרים עובש אחיד וברור.
    11. מניחים את הצלחות בתוך תנור במשך 3 שעות (או לילה) ב 70 ° צ' (איור 1E).
      הערה: הלוחות צריך להיות ברמה כאשר מניחים בתנור.
  2. הליהוק של PDMS בתבניות אפוקסי
    הערה: מכיוון שהכנה של וופל היא יקרה, יש צורך בציוד מיוחד, ועלולה לגרום נזק לסוגי הסיליקון השבריריים, ניתן ליצור עותקים משוכפלים של אפוקסי. העותקים המשוכפלים זולים יותר, עמידים יותר, וניתן להשתמש בהם לייצור המוני של תאי מיקרופלואידיג.
    1. להטיל ולרפא PDMS (כפי שמתואר 1.1.8-1.1.11) לתוך וופל המקורי.
    2. הסר וגזור חלקים עודפים של PDMS להשאיר רק את האלמנטים microflu, ואת האזור הפונקציונלי הנדרש לעיבוד אותם לתאי microfluidic.
    3. עטוף מיד את PDMS עם נייר עבה, דביק כדי למנוע ממנו לצבור אבק.
    4. לבחור את התרבות רקמה כיתה פלסטיק המתאים לשלם PDMS בתוך ולהשאיר מקום לאפוקסי סביבו. המרחק מ-PDMS לצלחת הפלסטיק צריך להיות פחות מ 5 מ"מ.
    5. הכן כמות קטנה של PDMS מעורב ביחס של 10:1 (בסיס: ריפוי סוכן). הנוזל הטרי PDMS ישמש כדי להדביק את PDMS מוצק על החלק התחתון של צלחת פלסטיק.
    6. החל כמות מינימלית של PDMS הנוזלי לתחתית צלחת הפלסטיק ולאחר מכן הסר את הקלטת הדביקה מ-PDMS והדבק אותו לתחתית צלחת הפלסטיק. ודא שהרכיבים המיקרופלואידים פונים כלפי מעלה.
    7. תן ל-PDMS לרפא 30 דקות בתנור של 70 ° c.
    8. הכינו את שרף האפוקסי על ידי ערבוב הבסיס וריפוי הסוכן ביחס של 100:45 בהתאמה במבחנה. שרפים אפוקסי שונים עשויים להיות יחסי ערבוב שונים. אמצעי האחסון הנדרש לצלחת 100 מילימטר רגיל הוא כ-40 mL.
    9. הוסיפו את האפוקסי לתערובת היטב במשך 10 דקות בתוך מסובבי עד שהיא הופכת להיות הומוגנית בעליל (כלומר, אין ממצאים גלויים כמו סיבים בנוזל).
    10. צנטריפוגה את תערובת אפוקסי ב 400 x g עבור 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר נתפס בתוך.
    11. במהלך הצנטריפוגה, הפיצו שכבה דקה של סיליקון שומן סביב הקירות וכל חלקי הפלסטיק החשופים האחרים בצלחת התרבות. זה ימנע את האפוקסי מן פולימריזציה עם פלסטיק הכלים ויאפשר הסרת האפוקסי הנרפא בקלות בסוף הפרוטוקול.
    12. יוצקים את האפוקסי לאט לתוך המנה עד שהוא מכסה לחלוטין את ה-PDMS ועובר מעבר לו על-ידי לפחות 5 מ"מ. מניעת היווצרות בועות בתוך האפוקסי על-ידי שמירה על מרחק של אפס בין הצינורית לצלחת. מניחים את הצלחת במקום מאובטח, כך שהוא לא יועבר עבור 48 h הבא.
    13. לאחר 48 h האפוקסי צריך להירפא לחלוטין. הכנס את הצלחת לתוך תנור מחומם ב 80 ° c עבור 3 h עבור הריפוי הסופי.
    14. הסר את אפוקסי נרפא מן הצלחת ואת העובש PDMS המקורי על ידי מושך בעדינות את קיר הפלסטיק של הצלחת עד שהוא נשבר. הדבר אמור להיות מופרד בקלות מהאפוקסי ומתקלף.
    15. לאחר שחולצו, לנגב את השומן הנותרים את העותק המשוכפל החדש האפוקסי והכניסה אותו הפוך (כלומר, עם האלמנטים microflu, המשוכפלת הפנים למעלה) לתוך צלחת תרבות חדשה. העותק המשוכפל של האפוקסי מוכן כעת ליציקה של PDMS.
    16. השתמש באוויר לחצים או N2 לפוצץ כל שרידים של pdms או לכלוך מתוך עובש אפוקסי ולשטוף אותו 2x עם איזופנול. למלא אותו בפעם השלישית, הדגירה עבור 10 דקות על צלחת שייקר מסלולית. לשטוף את העובש שוב 3x עם איזופנול ולהשליך את הנוזל הנותר. להתייבש עם אוויר או N2 או מקום בתנור 70 ° c עד יבש.
      הערה: בצע את הליכי הבטיחות בעת עבודה עם השמטה של איזופנול.
    17. השאר את צלחות העובש. סגורות עד הליהוק בצע את השלבים 1.1.8.-1.1.11.
  3. ניקוב ופיסול של PDMS לתוך MFC (איור 2)
    1. גזור והסר את תבנית PDMS מהצלחת על-ידי ביצוע הסימנים (+) על הוופלים באמצעות אזמל. אין להשתמש בכח, כאשר התבניות הן שבירות (איור 2א).
    2. בצע את ההוראות שצוירו על הסקיצה כדי להכות ולחתוך את התאים בהתאם ההתקנה ניסיוני (איור 2B-F).
      1. כדי לחקור את התרבות בחוט השדרה (איור 2ג, E), פונץ ' 2 7 מ"מ בארות בצד המרוחק של שהמכשיר הגדול. אתר את הבארות בדרך שהם יחפפו עם קצות הערוץ. בצד האבובי, פונץ ' אחד 7 מ"מ היטב באמצע הערוץ, עם חפיפה מינימלית כך ששטח מספיק יישאר עבור explants. חבוט שני חורים נוספים בשני הקצוות של התעלה האבובת. הפוך את ה-MFC עם האלמנטים המיקרופלואידים הפונים כלפי מעלה, ושימוש במחט של 20 גר', גלף שלוש מערות בהסבר קטן על הבאר המנוקב 7 מ"מ.
      2. עבור תרבות MN המונתק (איור 2D, F), אגרוף ארבע 6 מ"מ בארות בקצות שני הערוצים של MFC קטן.
  4. עיקור הMFC לשימוש בתרבית רקמות
    1. התפשט 50 ס מ להקות דביק לאורך הספסל. לחץ ומשוך בחזרה את התא כדי להתמודד עם הסרט הדביק (העליון והתחתון הפנים) ולהסיר לכלוך גולמי. מניחים את התאים הנקיים בצלחת חדשה של 15 ס מ.
      הערה: אל תלחצו ישירות על האלמנטים המיקרופלואידים כאשר אלה פונים כלפי מעלה.
    2. דגירה התאים בכיתה אנליטית 70% אתנול עבור 10 דקות על שייקר מסלולית.
    3. היפטר מאתנול וייבש את התאים במכסה של תרבות הרקמה או בתנור ב-70 ° c.
  5. הצבת הMFC על צלחת תחתית זכוכית
    1. מניחים את החדר במרכז של תרבות רקמת כיתה 35 mm/50 מ"מ זכוכית מאכל ולהחיל כוח מינורי על הקצוות כדי להפוך את PDMS ו התחתון צלחת לאגד. כדי למנוע שבירת תחתית הזכוכית, תמיד להחיל כוח על גבי משטח מוצק.
    2. דגירה 10 דקות ב 70 ° c. לחצו על התאים כדי לחזק את הדבקות בצלחת.
    3. דגירה תחת אור UV עבור 10 דקות.
  6. ציפוי ותפירה
    1. הוסף 1.5 ng/mL פולי-L-אורתך (אש ף) לשני התאים. ודא כי אש ף פועלת דרך הערוצים על ידי ליטוף מדיית הציפוי כמה פעמים ישירות בכניסה לערוץ.
    2. בחנו את החדר המיקרופלואידיג תחת מיקרוסקופ קל עם הגדלה של 10x כדי לבדוק את הנוכחות של בועות אוויר. אם בועות האוויר חוסמים את המיקרוחריצים, מניחים את ה-MFC ב-desiccator ואקום עבור 2 דקות. מאוחר יותר, להסיר את האוויר העודף שנתפסו בערוצים על ידי ליטוף את מדיית הציפוי דרכם. . מכאן בלילה
    3. החליפו את אש ף באמצעות למינציה (3 μg/mL ב-DDW) לדגירה של לילה באותו אופן.
    4. לפני הציפוי, לשטוף את הלמינציה עם מדיום התרבות העצבית.

2. ציפוי התרבות העצבי

  1. תרבות תא מנוע
    1. באמצעות מספריים ישרים מלקחיים עדינים, מנתח חוט השדרה מתוך E 12.5 ICR-HB9:: העובר העכבר GFP. עבודה בפתרון HBSS 1X עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (איור 3A-C).
    2. שימוש במספריים לחיתוך והסרת קרומי הקרום והקרניים (איור 3ד).
    3. לאסוף את חתיכות חוט השדרה ולהעביר לצינור(#1) עם 1 ML HBSS + 1% P/S.
    4. חותכים את חוטי השדרה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מעוקלים ולחכות פיסות להתיישב.
    5. הוסף 10 μL של טריפסין 2.5% והמקום באמבט מים של 37 ° c במשך 10 דקות. לאחר 5 דקות, לערבב על ידי הקשה על השפופרת. החלקים צריכים ליצור. גוש כמו סליל
    6. העבר את הגוש לתוך צינור חדש(#2) המכיל 800 μl של prewarmed l-15, 100 ΜL של bsa 4%, ו 100 μl של 10 מ"ג/ML DNase. לטחון 2x, ולאחר מכן להמתין 2 דקות כדי לאפשר לחלקים בלתי מנוכה להתיישב. העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש(#3).
    7. הוסף 100 μL של BSA 4%, 20 μL של 10 מ"ג/mL DNase, ו 900 μL של מדיום מלאה neurobasal סיס (CNB, ראה טבלת חומרים ושולחן 1). לטחון 8x ולחכות 2 דקות. לאסוף סופרנטאנט כדי צינור #3.
    8. חזור על השלב 2.1.7 ולטחון 10x. . תאסוף את ה#3מצינור הקירור יש להשאיר כמות קטנה של רקמה בתחתית הצינור.
      הערה: אם גוש גדול עדיין נשאר בתחתית הצינור #2, חזור על שלב 2.1.8.
    9. הוסף 1 מ"ל של BSA 4% כרית לתחתית #3הצינור.
    10. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
    11. להשעות מחדש את הגלולה על ידי הקשה בעדינות על השפופרת, ולאחר מכן להוסיף 1 mL של מדיום CNB. פיפטה 6x ולהוסיף 20 μL של 10 מ"ג/mL DNase.
    12. תוספת עם תוספת של 5 מ ל של CNB בינונית והעברה 3 מ ל לצינור חדש(#4).
    13. הוסף 1 מ ל של 10.4% בינונית של צפיפות מעבר הצבע (ראה טבלה 2) לתחתית כל צינורית(#3 ו#4). הפרדת פאזה חדה בין שני הממשקים אמורה להופיע.
    14. צנטריפוגה ב 775 x g עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT). יש להגדיר את האטה הצנטריפוגה ברמה נמוכה כדי למנוע פירוק של הפרדת הפאזה.
    15. תאים אמורים להיות צפים, המופיעים כשלב מעונן בין המדיה. לאסוף את התאים משני הצינורות לתוך צינור חדש(#5) כבר מכיל prewarmed 1 ML cnb מדיום.
    16. הוסף תוספת של 4-6 mL של מדיום CNB.
    17. הוסף 1 מ ל של BSA 4% כרית לתחתית הצינור.
    18. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב RT. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה בעדינות עם 1 מ ל של cnb בינונית.
    19. . תספור את התאים תשואה של 0.75-1 x 106 MN לחוט השדרה צפוי.
      הערה: חוט השדרה הגחוני מכיל גם תת עצבי אחרים מלבד נוירונים מוטוריים (למשל, interneurons). טוהר MN תלוי בעיקר על הסרת האזורים האלה במהלך הניתוח והיכולת להגיע לאזורים rostral מועשר. כדי להבטיח את הנוירונים התמונה הם MNs, השימוש במתח של עכברים עם סמן מסוג MN אנדוגניים, כגון HB9:: עכברים GFP, מומלץ. כדי להשיג תרבות MN טהורה (אך עם תפוקת התאים ירד), השימוש ב-FACS טיהור15 אפשרי.
    20. תרבות MN המונתק ב-MFC
      1. להתרכז 150,000 MNs לכל חדר על ידי תפרידו ב 400 x g עבור 5 דקות.
      2. מזף את הסופרנטאנט ומחדש בעדינות את התאים במדיום נוירובסיס עשיר (RNB) ב -4 μL לכל MFC. RNB הוא CNB עם תוספת 2% B27 ו 25 ng/mL BDNF.
      3. הסר את המדיום משני התאים, השארת נפח נמוך שווה ערך ל ~ 10 μL בבארות של התא המרוחק. היא מופיעה כטבעת דקה. של בינונית במתחם הבאר
      4. טען לאט את 4 μL של תאים לתוך הערוץ. להוציא 4 μL של הבאר בצד השני של הערוץ, ולטעון אותם לאט בחזרה ישירות לתוך הערוץ כדי להפוך את הזרימה הנוכחית למקסם את צפיפות התא בערוץ.
      5. ודא כי התאים נכנסו לערוץ באמצעות מיקרוסקופ אור 10x ומניחים את התא בחממה עבור 30 דקות ללא הוספת מדיה נוספת.
      6. לאט להוסיף ~ 10-15 μL של RNB לתוך הבית הנמצא והמרוחק ולמקם את התאים בחממה לעוד 15 דקות.
      7. בעקבות דגירה זו, לאט להוסיף ~ 75-80 μL של RNB לתוך כל טוב.
    21. תחזוקת תרבות MN
      1. יום אחד לאחר ציפוי (DIV1), להחליף בינוני עם rnb שיושלם עם 1 μm ציטוסינוס הערנוסייד (Ara-C) כדי לעכב את הצמיחה גליה.
      2. יומיים לאחר היישום Ara-C (DIV3) להחליף בינוני עם מדיום חדש CNB בתוך התא האבובי (ללא Ara-C).
      3. על מנת לשפר את המעבר של אקסונים דרך מיקרוחריצים, להחיל rnb בתוספת 25 ng/ml של התאים גליה נגזר neurotrophic פקטור (gdnf) ו -25 ng/ml של המוח נגזר neurotrophic פקטור (bdnf) רק אל התא המרוחק. שמור על הדרגה של עוצמת הצבע של לפחות 10 μL לכל היותר בין הבארות (נפח גבוה יותר) והבארות האבובית.
      4. . תרענן את המדיום כל יומיים זה יכול לקחת את אקסונים עד 4-6 ימים כדי לחצות distally.
  2. תרבות של חוט השדרה
    1. באמצעות מספריים ישרים מלקחיים עדינים, מנתח חוט השדרה מתוך E 12.5 ICR-HB9:: העובר העכבר GFP. עבודה בפתרון HBSS 1X עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (איור 3A-C).
    2. שימוש במספריים לחיתוך והסרת קרומי הקרום והקרניים (איור 3ד).
    3. חותכים את חוט השדרה לתוך 1 מ"מ עובי רוחבי מקטעים (איור 3E). היפטר מכל המדיום מהתא החלק היותר של ה-MFC.
    4. להרים את חוט השדרה בודד לחקור עם פיפטה בנפח כולל של 4 μL. הכנס את ההסבר קרוב ככל האפשר למערה ולמשוך את כל נוזל מוגזם מן הבית הקרוב ביותר דרך השקעים לרוחב (1 מ"מ אגרופים). האקכורים צריכים להישאב. לתוך התעלה האבובה
    5. לאט להוסיף 150 μL של חוט השדרה לחקור בינונית (SCEX, ראה טבלה של חומרים ושולחן 3) לבאר האבותית.
    6. חוט שדרה לחקור את תחזוקת התרבות
      1. הוסף מדיום SCEX בתא האבובי, ועשיר SCEX בינונית (SCEX עם 50 ng/mL של BDNF ו GDNF) בתא המרוחק. שמור על הדרגה של עוצמת הצבע של לפחות 15 μL לכל היותר בין הבארות (נפח גבוה יותר) ואת הבאר האבובית.
      2. . תרענן את המדיום כל יומיים זה יכול לקחת את אקסונים עד 3-5 ימים כדי לחצות distally.

3.הובלהאקונלית (איור 4א)

  1. הוספת תוויות לתאי המיטובית וחומציים
    1. להכין בינונית SCEX טרי (או CNB עבור הנתק MN) המכיל 100 nM מיטואומעקב האדום בעומק FM ו 100 ננומטר LysoTracker אדום. מודטה עבור 30-60 דקות ב 37 ° c. צבעים אחרים ניתן להשתמש כל עוד fluorophores להם לא חופפים.
    2. שטוף 3x עם מדיום CNB/SCEX חם. . הצלחות מוכנות להדמיה
  2. הדמיה חיה
    1. לרכוש 100 זמן לפקיעה תמונה סדרה של הובלה סיבי במרווחי זמן של 3, עם סך של 5 דקות לכל סרט.
      הערה: מערכת הדמיה המשמשת במחקר זה כללה מיקרוסקופ הפוך מצויד בחיבור הדיסק מסתובב, נשלט באמצעות תוכנה ההגינות הדמיה תא, 60x עדשה שמן, NA = 1.4, ו מצלמת EMCCD. סרטים נרכשו בסביבה מבוקרת ב 37 ° c ו 5% CO2.
      הערה: ניתן לבצע דימות של סרטים ארוכים או קצרים יותר בזמן, בהתאם לניסוי. במקרה הצורך, ניתן להקליט גם סרטי לילה. עם זאת, חיוני לנסות להקטין את זמן החשיפה ואת כוח הלייזר, כמו גם את מספר התמונות הכוללות, כדי להקטין את הרעילות והלבנה במהלך רכישת הסרט.

4. ניתוח תמונה (דמויות 4-5)

  1. ניתוח הפצת ודחיסות של תעבורת חלקיקים באמצעות ניתוח kymograph
    1. פתח את הקובץ בפיג. ערוצים נפרדים הקשה על התמונה | ערימות | כלים | . הוראות הביטול
    2. הגדרת מאפייני תמונה על-ידי הקשה על תמונה | . מאפייניםכאלה
    3. בחרו בכלי קו מקוטע בלחיצה ימנית על סמל הקו. הגדר את רוחב ל 8-10 על-ידי לחיצה כפולה על סמל הקו. הקפד על עקביות באותו רוחב קו בכל הניתוח.
    4. סמן קו מקוטע אחרי נתיב האקסון מהמרוחק עד הבית. לחץ פעמיים כדי לעצור את סימון הקו.
    5. לחץ על t כדי להוסיף אזור שורה חדש של ריבית (roi) למנהל הroi. הוסף זאת לטבלת ניתוח גיליון אלקטרוני.
    6. לחץ על m כדי למדוד את האזור ואת אורך האקסון. הוסף את זה לטבלת הניתוח.
    7. צור kymograph על ידי לחיצה על תוספים | קימובוקס | . שלפו את קומו לחילופין, ניתן להשתמש בתוספים אחרים בייצור kymograph.
    8. ספירה ידנית של הזזה (נסיגה או כיתה) וחלקיקים שאינם נעים והוספתם לטבלה בעמודה הנכונה.
      הערה: החלקיקים מסווגים כדרך מעבר (כלומר, מעבר שמאלה ב-kymograph) או בנסיגה (כלומר, תנועה מימין) אם העקירה שלהם גבוהה מ-10 יקרומטר בכיוון הספציפי. ניתן למדוד את העקירה פשוט על ידי סימון קו אופקי עם סמל הקו ולחיצה על m. חלקיקי מנוע או אלה שאינם עומדים בקריטריוני העקירה מוגדרים כאינם מעבירים (איור 4ב').
  2. מעקב אחר חלקיק בודד: מעקב ידני
    1. הורד את תוסף המעקב הידני עבור תוכנת פיג'י (שפותחה על ידי Fabrice P. Cordelière) מ http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
    2. פתח את הקובץ ב- פיג'י/ImageJ. השתמש באפשרות ' סיבוב ' כדי ליישר את החריצים של MFC באופן אופקי.
    3. כדי לשפר את היחס בין אות לרעש במידת הצורך, לחץ על תהליך | הפחת רקע.
    4. פתח את תוסף המעקב הידני . קבעו את הפרמטרים (לדוגמה, גודל הפיקסל, מרווח זמן וכו ') בהתאם למיקרוסקופ הספציפי המשמש לדימות. עבור התוצאות המוצגות כאן, המיקרוסקופ והעדשה היחס היה 0.239 μm/פיקסל ומרווח המסגרת היה 3 s.
    5. השג את הרצועות X ו-Y קואורדינטות ושמור את התוצאות על-ידי העתקת הטקסט לגיליון אלקטרוני.
    6. ניתוח סרטים מרובי ערוצים על-ידי לחיצה על תמונה | צבע | מזג ערוצים כדי למזג את הערוצים ולאחר מכן עקוב אחר מקומי בלבד.
  3. מעקב אחר חלקיקים בודדים: מעקב חצי אוטומטי (איור 5)
    1. פתח את תוכנת הניתוח. מחקר זה השתמש בגירסת התוכנה Bitplane טוס Imaris אריס 8.4.1.
    2. עבור לעלות למעלה בתפריט העליון.
    3. לחץ על עיבוד תמונה | החלף זמן ו Z | . אנימבין.
    4. לחץ על עריכה | מאפייני תמונה (Ctrl + I) | גאומטריה | שורה בגודל voxel. הגדרת מאפייני תמונה בהתאם לכיוונון המיקרוסקופיה שבשימוש.
      הערה: עבור הנתונים המוצגים כאן, המיקרוסקופ ויחס העדשה היה 0.239 μm/פיקסל.
    5. לחץ על כל Equidistant ושנה את מרווח הזמן. לדוגמה, השתמש ב-3 s כמרווח. לחץ על לחצן האיפוס בתחתית הימנית או לחץ על Ctrl + B.
    6. הוסף שכבת כתמים בחלק העליון שמאלה על-ידי לחיצה על סמל של כתמים צהובים קטנים. בתחתית השמאלית נפתח תפריט חדש לעריכת הנקודות .
    7. לחץ על החץ הכחול הימני עד להתחלת זיהוי הספוט.
      הערה: חשוב לסנן חלק מהנקודות המשתמשות במסנן שבצד השמאלי התחתון של החלון. בדוק את הסרט כמה פעמים כדי לראות שנבחר מספר נקודות מספיק.
    8. ודא או קבע את תצורת הפרמטרים כך שיתאימו לצרכים הניסיוניים. לדוגמה, Max מרחק = 12 יקרומטר (המרחק המקסימלי המותר בין שני כתמים שונים כדי לכלול עדיין אותם באותו רצועה אחת); גודל הרווח המירבי = 1 (מספר המסגרות שמסלול מורשה להחמיץ ועדיין נחשב לרצועה אחת).
    9. לחץ על הגדרות ולאחר מכן מעקב אחר סגנון = כבוי, נקודות = כדור.
    10. בעזרת סרגל הסינון, בחרו מסננים שונים להתאמה. לדוגמה, בנתונים שסופקו כאן, מעקב אחר משך זמן = 9 הסיר את כל הרצועות בפחות מ-3 מסגרות. כאשר כל הפרמטרים מוגדרים, לחץ על החץ הירוק הימני. עריכה נוספת אינה אפשרית לאחר שלב זה.
    11. לחץ על עיפרון קטן עם נקודות כדי לערוך באופן ידני את כל הרצועות.
    12. הצג את הסרט (איור 5ב). אם מתרחשת שגיאה, קיימות מספר אפשרויות אפשריות:
      1. כדי לנתק רצועה, לחץ על אפשרות האובייקט ובחר את שני המקומות שיש לנתק בהם החזקת Ctrl, ובחר באפשרות ' התנתק'.
      2. לחיבור רצועה, לחצו על האפשרות ' אובייקט ', בחרו בשני המקומות הנחוצים לחיבור Ctrl ובחרו ' התחבר'.
      3. כדי למחוק רצועה או נקודה, באמצעות האפשרות המתאימה (מעקב/אובייקט), עבור למסך באמצעות סמל העיפרון הרגילובחר ' מחק'.
      4. כדי להוסיף מקומות באופן ידני, עבור למסך סמל העיפרון הרגיל. בתחתית המסך יש סימן מעקב ידני. ודא שתיבת הסימון התחבר אוטומטית היא V. בסרט עצמו, כדי להוסיף נקודה, החזק את לחצן Shift ולחץ לחיצה שמאלה.
    13. כדי להוסיף נקודה לרצועה קיימת, בחר את הרצועה הרצויה (צהוב) ומסגרת, עבור למסך התצוגה הרגיל של סמל העיפרון והוסף נקודה באופן ידני. עם סיום הסרט כולו, עבור לסמל שנראה כמו גרף אדום (סטטיסטיקה). ניתן לערוך את הפרמטרים שנותחו מאוחר יותר. כדי לערוך, בחלק הימני התחתון של המסך, לחץ על סמל המפתח השוודי. לדוגמה: מיקום X, מיקום Y.
    14. לחץ על הסמל שנראה כמו מספר תקליטונים, יצא את כל הסטטיסטיקות.
      הערה: ניתן לטפל בפלט הגיליון האלקטרוני באופן ישיר או מנותח נוסף באמצעות הקוד9 המשמש לניתוח זה, שישותף לפי דרישה. הפרמטרים הבאים מופקים מהניתוח: מהירות, מעקב אחר הזחה, אורך הפעלה, מהירות (כולל כיווניות), הספירה לעצור, משך עצירה ממוצעת, אלפא, שינויי כיוון ומהירות מיידית. הסבר מפורט על כל פרמטר מתואר בגלאוסקה ואח '9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול המתואר, עכבר עובריים HB9:: GFP בחוט השדרה האקסוצמחים היו מתורבתים ב-MFC (איור 4א). , האקסוצמחים גדלו במשך 7 ימים. כשהאקטונים הצטלבו לתוך התא המרוחק Mitotracker עמוק אדום ו Lysotracker צבעים אדום נוספו לתאי הבית הרחוק ביותר כדי לתייג את המיטוa ו חומצי תאים (איור 4ג). האקסונים בחריצים הדידיתיים, והסרטים נותחו כדלקמן: ראשית, השוונו את התפלגות התנועה הכללית באמצעות ניתוח kymograph (איורים 4ב, D). ניתוח זה חשף הטיה בכיוון הנסיגה רק בתאי חומצי (שאינם מעבירים = 77.1 ± 9.5%; רטרוגרדי = 16.9 ± 8.3%, כיתה = 6 ± 5%; איור 4E) אבל לא בתחבורה מיטוכונדריאלי (לא מעביר = 83.4 ± 6.8%; נסיגה = 10.5 ± 6.9%; בכיוון = 6.8 ± 5.1%; איור 4F). הניתוח kymograph שימש לכמת את צפיפות החלקיקים, חשיפת מספר גבוה יותר של חלקיקים מיטוכונדריאלי בהשוואה לתאי חומצי ב HB9:: שעמוד השדרה gfp לחקור אקסונים (המיטוa = 0.46 ± 0.13; תאים חומצי = 0.3 ± 0.07 חלקיקים/μm axon, איור 4G).

לאחר מכן, התבצע ניתוח של תעבורת חלקיקים בודדת באמצעות תוכנה חצי-אוטומטית ואחריו קוד בתוך הבית (איור 5א-ב). ניתוח זה חשף כי למרות שיש מהירות חלקיק דומה בכלל (איור 5ג), כאשר התבוננות התפלגות המהירויות (איור 5ד) רק תאים חומצי אבל לא המיטו, הציג הטיה לכיוון התנועה נסיגה.

Figure 1
איור 1: הכנת עובש סיליקון. רישום סכמטי המתאר את ההליך של ניקוי וופל כלורוטרימתיל. (א) הראשון, 50 מ ל של חנקן נוזלי נוספו למיכל המתאים. עבודה בשכונה כימית, מזרק ומחט שימשו כדי לצייר 8 מ ל חנקן נוזלי. כל התוכן של המזרק הוזרק. לתוך בקבוק הטרימתיתיל הכלור הבקבוק הסתובב עם הכובע הפונה כלפי מטה ו-8 מ ל של כלורוטרימתילסילאן נמשכו לאחור. (ב) כלורוטרימתיל סילאן התפשטה במיכל (לא ישירות על הפרוסת). המיכל צריך להיות סגור, ואחריו 5 דקות דגירה עבור כל תבנית. (ג) הנוזל pdms נשפך לתוך כל וופל עד הגובה הרצוי. (ד) כל הלוחות הוצבו יחד בתוך ואקום desiccator עבור 2 h, ואחריו 3 h-לילה בתנור 70 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עיצוב מיוחד MFC. (א) משתמש באזמל מתכת בתבנית של PDMS,שנלקחמהתבנית. (ב) בהתאם לכיוונון הניסיוני של 6 מ"מ, 7 מ"מ או מקדחים 1 מ"מ שימשו לניקוב תבניות pdms. (ג) עבור תרבות ההסבר ב-MFC, שימשו 7 מ"מ ומקדחים 1 מ"מ, ומזרק 20 גרם היה מנוצל לעשיית "מערות" לצורך החדרת מיכל קלה. (ד) עבור תרבות MN שאינה מונתק, השתמש באגרופן בגובה 6 מ"מ כדי ליצור ארבע בארות בקצות הערוץ. (E-F) איורים של צורות ה-MFC הסופיות המתוארות ב- C ו -D, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תרבות כפתונלית. (א) e 12.5 עובר העכבר הוצב בעמדה לאחר הראש, זנב, והעור הוסרו כדי לחשוף את הצינור העצבי. (ב) חיתוך של חוט השדרה כולו. (ג) באמצעות מלקחיים עדינים, הקרום היה מקולף הרחק מחוט השדרה. (ד) הפאנל השמאלי: הסרת מקטעים לרוחב חוט השדרה מחוט השדרה הגחוני כדי להניב טוב יותר MN בטיהור. לוח ימני: תמונת נציג של תרבות MN המונתק ב-MFC. HB9:: GFP מצטלבים לעבר התא המרוחק (ירוק). הצבע הופסט מצביע על גרעין עצבי (כחול). (ה) חוט השדרה explants שנוצר על ידי מבתר 1 מ"מ חלקים רוחבי עובי של חוט השדרה הגחוני. הדמות המייצגת של HB9:: gfp (ירוק) בחוט השדרה לחקור אקסונים ב-MFC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תחבורה Axonal של המיטו, תא חומצי ב MNs. (א) איור של חיבור התעבורה האקאליות. ליסוגשש אדום ומיטאוגשש אדום עמוק נוספו הן התאים האבובי המרוחק של MFC, המכיל HB9:: GFP בחוט השדרה לחקור. (ב) האנליזה של kymograph. החלקיקים הנעים הוגדרו ככיוון המעבר או נסיגה בעקבות עקירה של יותר מ 10 יקרומטר בכיוון זה. חלקיקים מסתובבים או לא מיוצאים. נספרו כאלה שאינם זזים סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ג) המסגרת הראשונה של הסרט בזמן פקיעה הצגת HB9 הראשי:: שעון השדרה gfp לחקור אקסונים צבוע עם lysotracker אדום כדי לתייג תאים חומצי ו מיטלגשש עמוק אדום לתייג המיטומטר. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (D) נציג מציג תנועה סיבי טיפוסית של תאים חומציים ו המיטומטר. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ה) kymograph ניתוח של הובלה מיטוכונדרילית, * * * * p < 0.0001, Anova עם תיקון הולם-sidak (n = 77 סיבי). סרגל בקנה מידה = 10 יקרומטר (F) הניתוח kymograph של התחבורה האקאליות של תא חומצי, * * p < 0.01, * * * * p < 0.0001, Anova עם תיקון הולם-sidak (n = 77 סיבי). (G) מנתח צפיפות חלקיקים axonal של תאי המיטוגרם וחומצי, * * * * p < 0.0001, מבחן t של הסטודנט (n = 77 axonal). קווי שגיאה מייצגים ערכים עם SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח חלקיקים יחיד למחצה אוטומטי למדידת מהירות ארגונית. (א) העבודה הסכמטית לניתוח הובלה בודדת למחצה אוטומטית. (ב) הבדיקה הגקית בחוט השדרה נותחו לאיתור חלקיקים בודדים. התוכנה ניתוח מסוגל לעקוב אחר חלקיקי סיבי יחיד בסרטים הזמן פקיעה, כפי שצוין עבור המיטוטור (נקודות צהובות, הפאנל העליון) ותאי חומצי (נקודות ירוקות, פאנל תחתון). (ג) מהירות ממוצעת לא השתנה בין תאי המיטוסים ו חומצי, מבחן מאן ויטני (n = 417 המיטו, n = 371 תאים חומצי). קווי שגיאה מייצגים ערכים עם SD. (ד) הפצת מיטוכונדריאלי ותאי חומציים ומהירויות כיתה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מדיום נוירו-בסיס מלא – עבור 50mL
מרכיב אמצעי אחסון ריכוז
נוירובסיס 47 מל '
B27 1 מ ל 2
נסיוב סוסים 1 מ ל 2
P/S 0.5 מ ל 1
ל-גלוטמין (גלוטמקס) 0.5 מ ל 1
בטא מרקוטואתנול (50 מ"מ) 25 μL 25μM
BDNF (בגודל 10/mL) 5 מיקרומטר 1ng/mL
GDNF (10 שרוג/mL) 5 מיקרומטר 1ng/mL
CNTF (10 לסרוג/mL) 2.5 מיקרומטר 0.5 ng/mL

טבלה 1: מתכון להכנת הפתרון המלא נוירובסיס (CNB).

אופטימנה פתרון – עבור 10mL
מרכיב אמצעי אחסון ריכוז
DDW 5.27 מ ל
בינוני מעבר צבע בצפיפות (אופטימנה) 60% 1.73 מ ל 10.4% (w/v)
טריצין 100 מ"מ 1 מ ל 2
גלוקוז 20% (w/v) 2 מ ל 2

שולחן 2: מתכון להכנת הצפיפות של פתרון בינוני הדרגתי.

חוט השדרה לחקור בינונית (SCX) – עבור 20mL
מרכיב אמצעי אחסון ריכוז
נוירובסיס 19.5 מ ל
B27 200 מיקרומטר 2
P/S 100 מיקרומטר 1
ל-גלוטמין (גלוטמקס) 100 מיקרומטר 1
מיכל בע 50 מיקרומטר 25ng/mL

שולחן 3: מתכון להכנת הפתרון לחקור את חוט השדרה (SCEX).

התרבות של MN הרחבות חוט השדרה
הליך ארוך יותר לפני ציפוי הליך קצר – נתח & הלוח
זהירות נוספת הדרושה לציפוי ב-MFC קל יותר לצלחת ב-MFC
ריכוז גבוה של נוירונים מוטוריים ללא תאים גליה – מדויק יותר נוכחות של תאים גליאל וסוגים עצביים אחרים – פיסיולוגיים יותר
אפשרויות מניפולציה ללא הגבלה על סומה ואקסונים אפשרויות מניפולציה מוגבלות על גופי התא
חיסוני קל עבור גופי תא ואקסונים יעילות נמוכה במהלך כתמים של גופי תא בתוך ההסבר.
יעילות גבוהה של זיהום נגיפי יעילות נמוכה מאוד של זיהום נגיפי

שולחן 4: השוואה בין הרחבות חוט השדרה ותרבות MN המונתק מבוסס על הפרימטרים של מהירות, היתכנות, נוכחות גליה, אפשרויות מניפולציה, חיסוני, ו זיהום נגיפי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת כדי לעקוב אחר התחבורה סיבי של תאי המיטויונים ו חומצי ב נוירונים מוטוריים. זה פשוט בפלטפורמת מבחנה מאפשר שליטה מדויקת, ניטור, ומניפולציה של תאים עצביים תת-תאית, המאפשר ניתוח ניסיוני של התפקוד המקומי בתאי עצב. פרוטוקול זה יכול להועיל ללימוד מחלות MN כגון ALS, כדי להתמקד בהבנת המנגנון הבסיסי של תפקוד התעבורה סיבי במחלה10,16. יתר על כן, מערכת זו יכולה גם להיות מיושם עבור לימוד הובלה של גורמים הזנה9,16, מיקרוארנה10, mrna8, ו התווית חלבונים בריאים וחולים MNs או בנוירונים אחרים, כגון חושי9 או אקסונים אוהדים14. שיטה דומה יכול להיות גם להחיל על התחבורה ארגונית מערכת במערכת התרבות, כגון MNs תרבותי עם שריר השלד תאים12 או הנוירונים הסימפתטית מתורבת עם קרדיומיקוציטים14. מערכת MFC יכולה להיות מנוצל כדי ליצור active NMJs17,18 וללמוד את ההשפעה של היווצרות סינפסה על תחבורה סיבי16.

פרוטוקול זה יש מספר יתרונות לעומת פרוטוקולים אחרים עבור culturing של נוירונים ב-MFC ושימוש בהדמיה חיה לנתח הובלה סיבי: 1) mfcs הם זמינים מסחרית על ידי יצרנים מספר. עם זאת, ייצור עצמי של MFCs הוא חסכוני מאוד בהשוואה לחלופה המסחרית. וופל אחד PDMS מניב ארבעה MFCs גדולים או תשעה קטנים על חשבון מינימלי של מספר דולרים בארה ב. שרף PDMS עצמו. 2) ניתן לשנות את MFCs מתוצרת עצמית כדי לענות על הצרכים הניסיוניים הספציפיים (למשל, שינוי הגודל והמיקום של הבארות, הגדלת העובי של PDMS MFC). 3) ה-MFCs יכול להיות מחובר בהפיך לצלחת (דרך התחברות פלזמה) אבל יכול להיות גם ממוחזר פעמים מרובות כדי להפחית את האפשרות של זיהום. 4) pdms mfcs הם שקופים, מה שהופך אותם אידיאלי עבור הדמיה חיה על ידי בעל רקע מופחת, אשר קריטי עבור התחבורה סיבי אומר איפה ההבחנה האות לרעש יכול להיות גורם מגביל. 5) בחוט השדרה התרבות ההסבר הוא מאוד יעיל ומהיר. חוט השדרה אחד מתחלקים יכול להניב עד 30 explants, מספיק עבור 10 MFCs. זה יכול לעזור לחסוך זמן וחומרים, ומבטיח כי אפילו עכבר בהריון עם עוברים מעטים יכולים לייצר ניסוי מוצלח. לראות השוואה מפורטת של לחקור את חוט השדרה התרבות MN בטבלה 4.

פרוטוקול זה הוא יחסית פשוט וזול. עם זאת, היא דורשת מומחיות במספר עניינים טכניים. הייצור והטיפול של הMFC צריכים להיות מדויקים ועדינים, כדי למנוע פגמים מבניים ויצירת בועות אוויר בשלב ואקום החובה (1.1.10), למשל. במהלך שלב ואקום אופציונלי (1.6.2) חשוב לנקות את כל האוויר, או שזה יחסום המעבר סיבי, אבל גם לשמור על ואקום קצר כדי למנוע התנתקות של MFC מן הזכוכית. שימו לב לשלבי פרוטוקול הניתוח, מכיוון שחשוב להסיר כראוי את הקרום והקרניים, כמו גם לנסות לחתוך את החלקים לגודל הנכון כדי להוסיפו למערת הMFC מבלי להשתמש בכוח פיזי. כל כוח פיזי מופרז המוחל על הMFC יכול לנתק בקלות את החריצים או את הMFC כולו, ולכן יש לבצע את ההליך בעדינות. Culturing של MNs וציפוי אותם הMFC צריך להיות מהיר יחסית, כמו MNs נוטים לצבור ולאבד את הכדאיות במהירות תחת תנאי לחץ כגון נפח בינוני נמוך של שלב הציפוי. הציפוי ב-MFC צריך להיעשות בנפח נמוך כדי לאפשר החזקה הנכונה של הנוירונים בערוץ MFC, ולאחר לא יותר מ 30 דקות בינונית מחומם להתווסף בעדינות מאוד כדי למנוע התנתקות של MNs.

לאחר מספר ימים בתרבות, ופעם אקסונים האריכו את התא המרוחק, התרבויות מוכנים לעבור כתמים ארגונית ואחריו רכישת סרטי הובלה אקסונים ולבסוף הליך ספציפי ניתוח תמונה. ניתן לבצע את הניתוח על-ידי מעקב אחר חלקיק בודד לאורך זמן, או על-ידי שימוש באלגוריתם מעקב אוטומטי או חצי אוטומטי. בניסיון שלנו, שיטות אוטומטיות פחות גוזלת זמן, אבל יש כמה חסרונות. בעיקר, המהימנות מעקב אוטומטי מצטמצם, עם האקטונים צפוף החוצים נתיבים. יתר על כן, אלגוריתמים אוטומטיים יש יכולת ירידה להבחין בין חלקיקים חופפים. כתוצאה מכך, מומלץ לבצע מעקב ידני או חצי אוטומטי. באופן כללי, מעקב אחר חצי אוטומטי עדיף כפי שהוא פחות זמן רב, אבל מעקב ידני יכול להיות אפשרות טובה כאשר אין תוכנה זמינה בתשלום. השוואה יסודית בין ניתוח ידני ואוטומטי ניתן למצוא Gluska ואח '9.

לסיכום, אימוץ פרוטוקול זה פשוט יכול להניב נתונים חשובים לחקר התחבורה סיבי של רכיבים סלולריים שונים. זה יכול להיות מותאם כדי להתאים מגוון של כיוונוני הדמיה, תת עצבי, כמו גם כדי cocultures של נוירונים עם תאים אחרים. זה גם מאפשר מניפולציה תרופתי מרחבי מרחבית של או גופי תא או אקסונים כדי להבין מנגנונים בסיסיים של בריאות עצבית ולשפר את פיתוח התרופה עבור מחלות עם הובלה אקסונים שונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הישראלית (קרן, 561/11) ומועצת המחקר האירופית (ERC, 309377).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Tags

מדעי המוח סוגיה 159 מיקרופלואידיג צ'יימברס נוירונים מוטוריים explants חוט השדרה תחבורה סיבי המיטו תאי חומצי
הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., … More

Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter