Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Аксональный Транспорт органелл в культурах моторных нейронов с использованием системы микрофлюидных камер

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/60993
* These authors contributed equally

Summary

Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья моторных нейронов. В этом протоколе мы предоставляем подробный метод отслеживания аксональной транспортировки кислых отсеков и митохондрий в моторных нейронных аксонах с помощью микрофлюидных камер.

Abstract

Моторные нейроны (Инн) являются сильно поляризованными клетками с очень длинными аксонами. Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья MN, способствуя росту нейронов, развитию и выживанию. Мы описываем подробный метод использования микрофлюидных камер (МФУ) для отслеживания аксональной транспортировки флуоресцентно маркированных органелл в аксонах MN. Этот метод является быстрым, относительно недорогим, и позволяет для мониторинга внутриклеточных сигналов в пространстве и времени. Мы описываем пошаговый протокол для: 1) Изготовление полидиметилсилоксана (PDMS) МФЦ; 2) Покрытие брюшной спинной мозг explants и MN диссоциированной культуры в МФЦ; 3) Маркировка митохондрий и кислых отсеков с последующим живым конфокальным воображением; 4) Ручной и полуавтоматизированный аксональный анализ транспорта. Наконец, мы демонстрируем разницу в транспортировке митохондрий и кислых отсеков HB9::GFP вентральный спинной мозг explant аксоны как доказательство действия системы. В целом, этот протокол обеспечивает эффективный инструмент для изучения аксонального переноса различных аксональных компонентов, а также упрощенное руководство по использованию MFC, чтобы помочь обнаружить пространственные экспериментальные возможности.

Introduction

MNs являются сильно поляризованными клетками с длинными аксонами, достигающими до одного метра в длину у взрослых людей. Это явление создает критическую проблему для поддержания подключения и функции MN. Следовательно, MNs зависит от надлежащей транспортировки информации, органелл ы и материалов вдоль аксонов от их клеточного тела к синапсу и спине. Различные клеточные компоненты, такие как белки, РНК и органеллы регулярно переносятся через аксоны. Митохондрии являются важными органеллами, которые регулярно транспортируются в MNs. Митохондрии имеют важное значение для надлежащей деятельности и функции MNs, ответственных за предоставление АТФ, буферизации кальция, и сигнализации процессов1,2. Аксональный транспорт митохондрий является хорошо изученным процессом3,,4. Интересно, что дефекты в митохондриальной транспортировки, как сообщается, участвуют в нескольких нейродегенеративных заболеваний и, в частности, в MN заболеваний5. Кислотные отсеки служат еще одним примером для внутренних органелл, которые движутся вдоль аксонов MN. Кислые отсеки включают в себя лисосомы, эндосомы, транс-голги аппарат, и некоторые секреторные пузырьки6. Дефекты в аксональной транспортировки кислых отсеков были обнаружены в нескольких нейродегенеративных заболеваний, а также7, и последние документы подчеркивают их важность в MN заболеваний8.

Для эффективного изучения аксонального транспорта часто используются микрофлюидные камеры, разделяющие соматические и аксональные,10отсеки. Два существенных преимущества микрофлюидной системы, а также разобщенности и изоляции аксонов, делают его идеальным для изучения субклеточных процессов11. Пространственное разделение между нейрональными клетками и аксонами может быть использовано для манипулирования внеклеточной средой различных нейрональных отсеков (например, аксонов против сомы). Биохимические, нейрональный рост / дегенерация, и иммунофлуоресценции анализы все выгоды от этой платформы. МФУ могут также помочь в изучении связи от клетки к клетке путем coculturing нейронов с другими типами клеток, таких как скелетные мышцы12,13,14.

Здесь мы описываем простой, но точный протокол для мониторинга митохондрий и кислого отсека транспорта в моторных нейронов. Мы также показываем использование этого метода, сравнивая относительный процент ретроградных и антероградных движущихся органелл, а также распределение транспортной скорости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Уход и обращение с животными в этом протоколе осуществлялись под наблюдением и одобрением Комитета по этике животных Тель-Авивского университета.

1. Подготовка МФЦ

  1. PDMS литья в первичных форм(Рисунок 1)
    1. Покупка или создание первичных форм (вафель) после подробного протокола9.
    2. Используйте воздух под давлением, чтобы удалить любой тип грязи с вафельной платформы, прежде чем приступить к покрытию шаг. Поверхность вафель должна выглядеть гладкой и прозрачной.
    3. Заполните контейнер с 50 мл жидкого азота. Приготовьте 10 мл шприца и 23 G иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры с этого шага вперед должны быть выполнены в химическом капюшоне.
    4. В химическом капоте используйте шприц и иглу для бассейна 2 мл жидкого азота. Хотя может показаться, что воздух был нарисован, шприц наполнен азотом(рисунок 1А). Поместите пластину в герметичном контейнере.
    5. Винт открыть хлоротриметилсилан бутылку, проколоть резиновую крышку с помощью азота заполненные шприц, и вводить все содержимое шприца в бутылку. Не вытягивая иглу, переверните бутылку вверх дном и оттяните 2 мл хлоротриметилсилана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за давления шприца, небольшое количество хлоротримметилсиланана распыляется из иглы. Чтобы избежать опасности, укажите иглу на внутреннюю стену капота(рисунок 1B).
    6. Равномерно распределите хлоротриметилсилан в контейнере (от шага 1.1.4), но не непосредственно на пластине или пластиносодержащей пластине. Закройте контейнер и инкубировать в течение 5 минут на вафу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это первый раз, когда вафля покрыта хлоротриметилсиллан, 1 ч инкубации должны быть разрешены для каждой пластины.
    7. Не вынимайте и контейнер из химического капота в течение 30 мин.
      ВНИМАНИЕ: Хлоротриметилсилан очень волатильный.
    8. Взвесьте базу PDMS (см. Таблицу Материалов)в трубке 50 мл и добавьте отcurание PDMS в соотношении 16:1 соответственно (например, 47,05 г основания и 2,95 г лечебного средства). Смешайте в течение 10 минут с помощью поворота низкой скорости.
    9. Налейте PDMS в каждую пластину-содержащую пластину на нужную высоту(рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тонких микрофлюидных камер (до 3-4 мм) улучшает соблюдение блюда культуры и предотвращает утечку.
    10. Поместите все пластины вместе внутри вакуумного высыхателя в течение 2 ч(Рисунок 1E). Этот процесс удаляет воздух, захваченный в PDMS, тем самым устраняя пузырьки воздуха и образуя четкую, однородную форму.
    11. Поместите тарелки в духовку на 3 ч (или на ночь) при температуре 70 градусов по Цельсию(рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины должны быть ровными при размещении в духовке.
  2. Литье PDMS в эпоксидных формах
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что подготовка дорого, требует специального оборудования, и может повредить хрупкие пластины, можно генерировать эпоксидные реплики вафель. Реплики дешевле, долговечнее, и могут быть использованы для массового производства микрофлюидных камер.
    1. В ролях и лечения PDMS (как описано в 1.1.8-1.1.11) в оригинальной пластины.
    2. Удалить и отрезать избыточные части PDMS оставляя только микрофлюидные элементы и функциональную область, необходимую для их обработки в микрофлюидные камеры.
    3. Немедленно оберните PDMS с толщиной, липкой лентой для того чтобы предотвратить его от аккумулировать пыль.
    4. Выберите пластиковую тарелку класса культуры ткани, которая соответствует всему PDMS внутри и оставить место для эпоксидной смолы вокруг него. Расстояние от PDMS до пластиковой тарелки должно быть менее 5 мм.
    5. Подготовьте небольшое количество PDMS, смешанного в соотношении 10:1 (базовый: лечебный агент). Свежая жидкость PDMS будет использоваться для приклеивания твердых PDMS на дно пластиковой пластины.
    6. Нанесите минимальное количество жидкости PDMS на центральное дно пластиковой пластины, а затем снимите липкую ленту из PDMS и привяжете ее к нижней пластиковой тарелке. Убедитесь, что микрофлюидные элементы обращены вверх.
    7. Пусть PDMS вылечить в течение 30 минут в духовке 70 градусов по Цельсию.
    8. Подготовка эпоксидной смолы путем смешивания базы и лечения агента в соотношении 100:45 соответственно в пробирке. Различные эпоксидные смолы могут иметь различные соотношения смешивания. Необходимый объем для обычной 100-мм пластины составляет около 40 мл.
    9. Пусть эпоксидная смесь хорошо в течение 10 минут в ротаторе, пока смесь не станет заметно однородной (т.е. в жидкости нет видимых волоконно-подобных артефактов).
    10. Centrifuge эпоксидной смеси на 400 х г в течение 5 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха, оказавшихся внутри.
    11. Во время центрифугации, распространение тонким слоем силиконовой смазки вокруг стен и всех других открытых пластиковых частей культуры блюдо. Это предотвратит полимеризацию эпоксидной смолы с помощью пластика тарелки и позволит легко удалить вылеченную эпоксидную кислоту в конце протокола.
    12. Налейте эпоксидную кислоту медленно в блюдо, пока он полностью покрывает PDMS и выходит за его пределы, по крайней мере 5 мм. Предотвратить образование любых пузырьков в эпоксидной смолы, сохраняя нулевое расстояние между трубкой и пластиной. Поместите тарелку в безопасное место, чтобы она не была перемещена в течение следующих 48 ч.
    13. После 48 ч эпоксидная кислота должна быть полностью вылечена. Вставьте тарелку в разогретую духовку при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 3 ч для окончательного лечения.
    14. Удалите вылеченную эпоксидку из пластины и оригинальную плесень PDMS, осторожно дергая пластиковую стенку пластины, пока она не сломается. Затем он должен легко отделиться от эпоксидной смолы и отслаиваться.
    15. После извлечения, стереть оставшуюся смазку с новой эпоксидной реплики и ввести его с ног на голову (т.е., с реплицированными микрофлюидными элементами вверх) в новое блюдо культуры. Эпоксидная копия теперь готова для литья PDMS.
    16. Используйте под давлением воздуха или N2, чтобы взорвать любые остатки PDMS или грязи от эпоксидной формы и промыть его 2x с изопропанол. Заполните его в третий раз и инкубировать в течение 10 минут на орбитальной пластине шейкера. Промыть плесень снова 3x с изопропанол и отбросить оставшуюся жидкость. Удар сухой с воздухом или N2 или поместите в духовке 70 градусов до высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте процедурам безопасности при работе с изопропанол и отбрасывайте его.
    17. Держите плесень пластины закрыты до литья. Выполните шаги 1.1.8.-1.1.11.
  3. Пробивание и скульптура PDMS в МФЦ(Рисунок 2)
    1. Вырезать и удалить форму PDMS из пластины, следуя (к) знаки на с помощью скальпеля. Не используйте силу, так как формы хрупкие(рисунок 2А).
    2. Следуйте инструкциям, нарисованным на эскизе, чтобы пробить и вырезать камеры в зависимости от экспериментальной установки(рисунок 2B-F).
      1. Для спинного мозга explant культуры(Рисунок 2C, E), удар два 7 мм скважин в дистальной стороне большой MFC. Найдите скважины таким образом, чтобы они пересекались с краями канала. На проксимальной стороне, удар один 7 мм хорошо в середине канала, с минимальным перекрытием, так что достаточно места будет оставлено для explants. Пробить еще два отверстия 1 мм в двух краях проксимального канала. Поверните MFC с микрофлюидными элементами, обращенными вверх, и, используя 20 G иглы, вырезать три небольших пещеры explant на пробитой 7 мм хорошо.
      2. Для разобщенных культур ы MN(рисунок 2D,F),пробить четыре 6-мм колодца по краям двух каналов небольшого МФЦ.
  4. Стерилизация МФЦ для использования культуры тканей
    1. Распространение 50 см длинные липкие ленты полосы на скамейке. Нажмите и отодвите камеру, чтобы столкнуться с липкой лентой (как верхние, так и нижние грани) и удалите сырую грязь. Поместите чистые камеры в новую 15-сантиметровую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не нажимаете непосредственно на микрофлюидные элементы, когда они обращены вверх.
    2. Инкубировать камеры в аналитическом классе 70% этанола в течение 10 минут на орбитальной шейкер.
    3. Утилизировать этанол и высушить камеры в капюшоне культуры ткани или в духовке при температуре 70 градусов по Цельсию.
  5. Размещение МФЦ на стеклянном донистом блюде
    1. Поместите камеру в центре ткани культуры класса 35 мм / 50 мм стекла нижней блюдо и применить незначительную силу по краям, чтобы сделать PDMS и блюдо нижней связать. Чтобы не разбить стеклянное дно, всегда нанося силу поверх твердой поверхности.
    2. Инкубировать 10 мин в 70 градусах По Цельсию. Пресс-камеры, чтобы укрепить присоединение к пластине.
    3. Инкубировать под ультрафиолетовым светом в течение 10 мин.
  6. Покрытие и культивирование
    1. Добавьте 1,5 нг/мл поли-L-орнитина (ООП) в оба отсека. Убедитесь, что ООП проходит через каналы, pipetting покрытия средств массовой информации несколько раз непосредственно в входе канала.
    2. Изучите микрофлюидную камеру под легким микроскопом с 10-разным увеличением, чтобы проверить наличие пузырьков воздуха. Если пузырьки воздуха блокируют микрогры, поместите MFC в вакуумный дезикатор на 2 мин. Позже, удалить избыток воздуха, который попал в каналы, пиптинг покрытия средств через них. Инкубировать на ночь.
    3. Замените ООП ламинином (3 мкг/мл в DDW) для ночной инкубации таким же образом.
    4. Перед покрытием, мыть ламинин с нейрональной среды культуры.

2. Нейронная культура покрытие

  1. Диссоциированная культура моторных нейронов
    1. Используя прямые ножницы и тонкие щипцы, вскрыть спинной мозг из E12.5 ICR-HB9::GFP мыши эмбриона. Работа в 1X HBSS решение с 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)(рисунок 3A-C).
    2. Используя ножницы микродиссекции, удалите оленя и рога доза(рисунок 3D).
    3. Соберите части спинного мозга и перенесите на трубку(#1)с 1 мл HBSS 1% P/S.
    4. Разрежьте спинной мозг на мелкие кусочки с помощью изогнутых ножниц и ждать, пока куски, чтобы решить.
    5. Добавьте 10 кл. трипсина 2,5% и поместите в водную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. После 5 минут, смешать, нажав трубку. Части должны образовывать суглюк-как комок.
    6. Перенесите комок в новую трубку(#2),содержащую 800 л предварительно разогретого L-15, 100 л BSA 4%, и 100 л 10 мг/мл DNase. Измельчить 2x, затем ждать 2 мин, чтобы неотделимые части оседают. Перенесите супернатант в новую трубку(#3).
    7. Добавьте 100 л BSA 4%, 20 л 10 мг/мл DNase, и 900 л полной нейробазальной среды (CNB, см. Таблица материалов и Таблица 1). Измельчить 8x и ждать 2 мин. Соберите супернатант в трубку #3.
    8. Повторите шаг 2.1.7 и измельчите 10x. Соберите супернатант в трубку #3. Небольшое количество ткани должно быть оставлено в нижней части трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если большой комок все еще остается в нижней части трубки #2,повторите шаг 2.1.8.
    9. Добавьте 1 мл подушки BSA 4% на дно трубки #3.
    10. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
    11. Приостановите действие клеточной гранулы, осторожно нажав трубку, а затем добавьте 1 мл среды CNB. Пипетка 6x и добавить 20 л 10 мг/мл DNase.
    12. Дополнить дополнительно 5 мл среды CNB и передать 3 мл на новую трубку(#4).
    13. Добавьте 1 мл из 10,4% градиентной среды плотности (см. таблицу 2)в нижней части каждой трубки(#3 и #4). Должно появиться резкое поэтапное разделение между двумя интерфейсами.
    14. Центрифуга при температуре 775 х г в течение 20 мин при комнатной температуре (RT). Замедление центрифуг должно быть установлено на низком уровне, чтобы избежать распада фазового разделения.
    15. Клетки должны плавать, появляясь как пасмурная межфаза между носителями. Соберите клетки из обеих труб в новую трубку(#5),уже содержащую предварительно разогретую 1 мл CNB среды.
    16. Добавьте еще 4-6 мл среды CNB.
    17. Добавьте 1 мл подушки BSA 4% на дно трубки.
    18. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин на RT. Отбросьте супернатант и аккуратно отбросите гранулы с 1 мл среды CNB.
    19. Посчитайте клетки. Ожидается выход 0,75-1 х 106 МН на спинной мозг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вентральный спинной мозг также содержит другие нейрональные подтипы, кроме моторных нейронов (например, интернейронов). Чистота MN зависит главным образом от удаления торсальных участков во время вскрытия и способности достигать обогащенных РН ростовских участков. Для обеспечения изображения нейронов MNs, использование штамма мышей с эндогенным маркером MN, таких как HB9::GFP мышей, рекомендуется. Для достижения чистой культуры MN (но с пониженной урожайностью клеток), возможно использование очистки FACS15.
    20. Покрытие разобщенных Культуры MN в МФЦ
      1. Концентрируйте 150 000 МН на камеру, центрифугиваясь при 400 х г в течение 5 мин.
      2. Аспирируй супернатант и осторожно resuspend клетки в богатой нейробазальной среде (RNB) на 4 Зл на МФЦ. РНБ дополняется дополнительными 2% B27 и 25 нг/мл BDNF.
      3. Удалите средство из обоих отсеков, оставляя низкий объем, эквивалентный 10 зл в колодцах дистального отсека. Он выглядит как тонкое кольцо медиума в периметре колодца.
      4. Медленно загружайте 4 qL клеток в канал. Выняйте 4 qL скважины в другой стороне канала, и медленно загрузите их обратно прямо в канал, чтобы обратить вспять текущий поток и максимизировать плотность клеток в канале.
      5. Убедитесь, что клетки вошли в канал с помощью 10-x светового микроскопа и поместите камеру в инкубатор в течение 30 минут, не добавляя больше носителей.
      6. Медленно добавляйте 10-15 евро зЛ РНБ в проксимальные и дистальные колодцы и помещайте камеры в инкубатор еще на 15 минут.
      7. После этой инкубации, медленно добавляйте 75-80 евро ЛЛ РНБ в каждую скважину.
    21. Диссоциированное обслуживание культуры MN
      1. На следующий день после покрытия (DIV1), заменить среду с RNB дополнен 1 мкм цитозин арабиносид (Ara-C) для ингибирования роста глиального.
      2. Через два дня после применения Ara-C (DIV3) заменить среду со свежей средой CNB в проксимальном отсеке (без Ara-C).
      3. Для повышения скрещивания аксонов через микрогры, применять RNB дополнен ы 25 нг/мл глиальных клеток, полученных нейротрофический фактор (GDNF) и 25 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF) только в дистальном отсеке. Поддержание градиента объема не менее 10 л на скважину между аксональными дистальными скважинами (более высокий объем) и проксимальными скважинами.
      4. Освежать среду каждые 2 дня. Это может занять аксоны до 4-6 дней, чтобы пересечь distally.
  2. Спинной мозг explant культуры
    1. Используя прямые ножницы и тонкие щипцы, вскрыть спинной мозг из E12.5 ICR-HB9::GFP мыши эмбриона. Работа в 1X HBSS решение с 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)(рисунок 3A-C).
    2. Используя ножницы микродиссекции, удалите оленя и рога доза(рисунок 3D).
    3. Разрежьте спинной мозг на 1 мм толщиной поперечных секций(рисунок 3E). Утилизировать все средство от проксимального отсека МФЦ.
    4. Возьмите один спинной мозг explant с пипеткой в общей сумме 4 ЗЛ. Введите explant как можно ближе к пещере и вытянуть любой чрезмерной жидкости из проксимальной хорошо через боковые розетки (1 мм ударов). Экспланты должны быть всасывается в проксимальный канал.
    5. Медленно добавьте 150 л спинного мозга explant среды (SCEX, см. Таблица материалов и Таблица 3) к проксимальной хорошо.
    6. Спинной мозг explant культуры обслуживания
      1. Добавьте среду SCEX в проксимальный отсек и богатую среду SCEX (SCEX с 50 нг/мл BDNF и GDNF) в дистальном отсеке. Поддерживайте градиент объема не менее 15 л на скважину между дистальными скважинами (более высокий объем) и проксимальной скважиной.
      2. Освежать среду каждые 2 дня. Это может занять аксоны до 3-5 дней, чтобы пересечь distally.

3. Аксональный транспорт(рисунок 4А)

  1. Маркировка митохондрий и кислых отсеков
    1. Подготовьте свежий средний SCEX (или CNB для разъединенных MN), содержащий 100 нм Mitotracker Deep Red FM и 100 нм LysoTracker Red. Инкубировать в течение 30-60 мин при 37 градусах Цельсия. Другие цвета могут быть использованы до тех пор, пока их фторфоры не пересекаются.
    2. Вымойте 3x с теплой средой CNB/SCEX. Пластины готовы к визуализации.
  2. Изображения в реальном маштабе времени
    1. Приобретите 100 покадровой серии изображений аксонального транспорта с интервалом в 3 с интервалами, в общей сложности 5 минут на фильм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система визуализации, используемая в этом исследовании, включала перевернутый микроскоп, оснащенный вращающимся диском confocal, управляемый с помощью программного обеспечения визуализации клеток, 60-x масляный объектив, NA No 1.4 и камеру EMCCD. Фильмы были приобретены в контролируемой среде при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длинные или более короткие покадровые фильмы могут быть изображены, в зависимости от эксперимента. Даже ночные фильмы могут быть записаны, если это необходимо. Тем не менее, очень важно, чтобы попытаться уменьшить время экспозиции и лазерной мощности, а также количество общих изображений, чтобы уменьшить фототоксичность и отбеливание во время приобретения фильма.

4. Анализ изображений (рисунки 4-5)

  1. Анализ распределения и плотности переноса частиц с помощью анализа кимографа
    1. Откройте файл в FIJI. Отдельные каналы нажатия Изображения Стеки Инструменты Deinterleave.
    2. Установите свойства изображения, нажав изображение Свойства.
    3. Выберите инструмент сегментированной строки, нажав на значок строки. Установите ширину до 8-10, дважды нажав на значок строки. Соответствие той же ширине линии на протяжении всего анализа.
    4. Отметьте сегментированную линию, следуя по аксонному пути от дистальной к проксимальной. Дважды щелкните, чтобы остановить разметку линии.
    5. Нажмите t, чтобы добавить новую область линии, представляющий интерес (ROI) для менеджера roI. Добавьте это в таблицу анализа таблицы таблицы таблицы электронных таблиц.
    6. Нажмите м, чтобы измерить площадь и длину аксона. Добавьте это в таблицу анализа.
    7. Создайте kymograph, нажав на плагины KymoToolBox Нарисуйте Kymo. Кроме того, другие плагины поколения kymograph доступны могут быть использованы.
    8. Вручную подсчитайте движущиеся (ретроградные или антероградские) и неподвижные частицы и добавляйте их в таблицу в правильной колонке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы классифицируются как движущиеся антерограды (т.е. перемещение влево в kymograph) или ретроградные (т.е. движение вправо), если их смещение превышает 10 мкм в определенном направлении. Измерить смещение можно, просто пометив горизонтальную линию иконкой line и нажав м. Иммобильные частицы или те, которые не отвечают критериям смещения определяются как неподвижные(рисунок 4B).
  2. Отслеживание отдельных частиц: Ручное отслеживание
    1. Скачать ручной плагин отслеживания для программного обеспечения FIJI (разработан Фабрис. Кордельер) с http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
    2. Откройте файл в FIJI/ImageJ. Используйте опцию «Поворот», чтобы выровнять канавки MFC горизонтально.
    3. Чтобы улучшить соотношение сигнала к шуму, если это необходимо, нажмите Процесс Вычесть фон.
    4. Откройте плагин ручного слежения. Установите параметры (например, размер пикселя, временной интервал и т.д.) в соответствии с конкретным микроскопом, используемым для визуализации. Для результатов, показанных здесь, микроскоп и объектив соотношение было 0,239 мкм / пиксель и интервал кадра был 3 с.
    5. Получите координаты X и Y треков и сохраните результаты, копируя текст в электронную таблицу.
    6. Анализ многоканальных фильмов, нажав изображение Цветовая гамма Слияние каналов для слияния каналов, а затем отслеживать только colocalized puncta.
  3. Отслеживание отдельных частиц: Полуавтоматическое отслеживание (Рисунок 5)
    1. Откройте программное обеспечение для анализа. В этом исследовании использовалась версия программного обеспечения Bitplane Imaris 8.4.1.
    2. Переключитесь на Surpass в верхнем меню.
    3. Нажмите обработка изображений (ru) Время свопов и й Ok.
    4. Нажмите На кнопку «Отмету» (ru) Свойства изображений (Ctrl'I) Геометрия Voxel Размер строки. Установите свойства изображения в соответствии с используемой установкой микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для данных, отображаемых здесь, соотношение микроскопа и объектива составило 0,239 мкм/пиксель.
    5. Нажмите Все equidistant и изменить интервал времени. Например, используйте 3 с в качестве интервала. Нажмите кнопку сброс в правом нижнем углу или нажмите ctrl'B.
    6. Добавьте слой пятен в левом верхнем цвете, нажав на иконку малых желтых пятен. В левом нижнем углу открывается новое меню для редактирования пятен.
    7. Нажмите на правую голубую стрелку до тех пор, пока не начнется обнаружение места.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отфильтровать некоторые точки с помощью фильтра в левом нижнем углу окна. Проверьте фильм несколько раз, чтобы увидеть, что достаточное количество точек выбрано.
    8. Проверить или настроить параметры в соответствии с экспериментальными потребностями. Например, Max Distance 12 мкм (максимальное допустимое расстояние между двумя различными точками, чтобы все еще включить их в один и тот же трек); Max Gap Размер No 1 (количество кадров, что трек разрешено пропустить и по-прежнему считается одной дорожке).
    9. Нажмите Настройки, а затем отслеживать стиль - Off, Очки и Сфера.
    10. Используя панель фильтров,выберите различные фильтры для регулировки. Например, в данных, представленных здесь, Track Duration 9 удалены все треки с менее чем 3 кадрами. Когда все параметры установлены, нажмите правозеленую стрелку. Дальнейшее редактирование не представляется возможным после этого шага.
    11. Нажмите малый карандаш с точками, чтобы вручную отсечить все треки.
    12. Посмотреть фильм(рисунок 5B). При возникновении ошибки существует несколько возможных вариантов:
      1. Чтобы отключить трек, щелкните опцион «Объект» и выберите два места, которые необходимо отключить, удерживая Ctrl,и выберите Отключените.
      2. Чтобы подключить трек, щелкните опцион «Объект», выберите два места, которые необходимо подключить, удерживая Ctrl, и выберите Connect.
      3. Чтобы удалить трек или пятно, с правильным вариантом (Трек / Объект), переключиться на экран с обычной иконки карандаша, и выбрать Удалить.
      4. Чтобы добавить пятна вручную, переключитесь на обычный экран иконки карандаша. В нижней части экрана есть ручной знак слежения. Убедитесь, что чекбокс Auto-Connect является V. На самом фильме, для того, чтобы добавить пятно, удерживайте кнопку Shift и лево-нажмитекнопку .
    13. Чтобы добавить место в существующий трек, выберите желаемый трек (желтый) и кадр, переключитесь на обычный экран карандашной иконки и добавьте пятно вручную. Когда весь фильм будет закончен, переключитесь на значок, который выглядит как красный график (Статистика). Отойти от проанализированных параметров можно позже. Чтобы отослать, в левом нижнем углу экрана нажмите на шведскую иконку Key . Например: Позиция X, Позиция Y.
    14. Нажмите на значок, который выглядит как несколько дисков floppy, Экспорт Все статистические данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выход электронной таблицы может быть обработан непосредственно или дополнительно проанализирован с помощью опубликованного кода9, используемого для этого анализа, который будет использоваться по запросу. Следующие параметры извлекаются из анализа: скорость, перемещение треков, длина выполнения, скорость (включая направленность), Стоп-граф, Средняя продолжительность остановки, Альфа, Изменение направления и Мгновенная скорость. Подробное объяснение каждого параметра описано в Gluska et al.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После описанного протокола, мышь эмбриональной HB9::GFP спинного мозга explants были культивированы в MFC(Рисунок 4A). Выращенные растения выращивались в течение 7 дней, когда аксоны полностью пересекались в дистальном отсеке. Mitotracker Deep Red и Lysotracker Red красители были добавлены в дистальные и проксимальные отсеки для обозначения митохондрий и кислых отсеков(рисунок 4C). Аксоны в дистальных канавках были изображены, и фильмы были проанализированы следующим образом: Во-первых, мы сравнили общее распределение движения с помощью анализа kymograph (Рисунки 4B,D). Этот анализ выявил уклон в ретроградном направлении только в кислых отсеках (неподвижные 77,1 и 9,5%; ретроградные - 16,9 - 8,3%, антероградные - 6 и 5%; Рисунок 4E),но не в митохондриальной транспортировке (неподвижный 83,4 и 6,8%; ретроградный no 10,5 и 6,9%; антероградный 6,8 и 5,1%; Рисунок 4F). Анализ кимографии был использован для количественной оценки плотности частиц, выявление более высокого числа митохондриальных частиц по сравнению с кислыми отсеками в HB9::GFP спинного мозга explant аксоны (Митохондрии 0,46 и 0,13; Кислотные отсеки 0,3 и 0,07 частиц/аксон, рисунок 4G).

Далее, анализ переноса отдельных частиц был проведен с использованием полуавтоматизированного программного обеспечения с последующим кодом(рисунок 5A-B). Этот анализ показал, что, несмотря на наличие аналогичной скорости частиц в целом(Рисунок 5C), при наблюдении за распределением скоростей(Рисунок 5D) только кислые отсеки, но не митохондрии отображается уклон в сторону ретроградного движения.

Figure 1
Рисунок 1: Подготовка силиконовой формы. Схематический рисунок, описывающий процедуру очищения хлоротриметилсиллана. (A)Во-первых, 50 мл жидкого азота были добавлены в соответствующий контейнер. Работая в химическом капоте, шприц и игла были использованы для рисования 8 мл жидкого азота. Все содержимое шприца было введено в бутылку хлоротриметилсиллана. Бутылка была повернута с крышкой вниз и 8 mL хлоротриметилсилана наспиненана были нарисованы назад. (B) Chlorotrimethylsilane распространяется в контейнере (не непосредственно на вафли). Контейнер должен быть закрыт, а затем 5 мин инкубации для каждой формы. (C)жидкий PDMS был вылил в каждую пластину до нужной высоты. (D) Все пластины были помещены вместе внутри вакуумного обезлищочения в течение 2 ч, а затем 3 ч-ночь в печи 70 градусов по Цельсию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Специализированный дизайн МФЦ. (A) Полимеризированный шаблон PDMS, вынимаемый из формы с помощью металлического скальпеля. (B) В зависимости от экспериментальной установки либо 6 мм, 7 мм, или 1 мм перфораторы были использованы для штамповки шаблонов PDMS. (C) Для explant культуры в MFC, 7 мм и 1 мм перфораторы были использованы, и 20 G шприц был использован для изготовления "пещеры" для легкой вставки explant. (D) Для разъединенных MFC культуры MN, перфоратор 6 мм был использован для создания четырех скважин на краях канала. (E-F) Иллюстрации окончательных форм MFC, описанные в C и D,соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Нейронная культура. (A) Эмбрион мыши E12.5 был помещен в положение после того, как голова, хвост и кожа были удалены для того, чтобы разоблачить нейронную трубку. (B) Рассечение всего спинного мозга. (C) Использование нежных щипцы, оболонь была очищена от спинного мозга. (D) Левая панель: Удаление бокового спинного мозга боковые сегменты из брюшного спинного мозга, чтобы дать лучше ежемое очищение MN. Правая панель: Представительный образ разобщенной культуры MN в МФЦ. HB9:GFP аксоны перешли к дистальной отсек (зеленый). Hoechst окрашивание указывает нейрональных ядер (синий). (E) Спинной мозг explants, генерируемых вскрытия 1 мм толщиной поперечных разделов брюшного спинного мозга. Представитель изображения HB9:GFP (зеленый) спинного мозга explant аксоны в MFC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Аксональный транспорт митохондрий и кислых отсеков в МН. (A) Иллюстрация аксонального транспортного эссе. Lysotracker Red и Mitotracker Deep Red были добавлены как в проксимальные, так и дистальные отсеки MFC, содержащие HB9::GFP вентральный спинной мозг explant. (B) Анализ kymograph. Движущиеся частицы были определены как движущиеся антероградные или ретроградные после смещения более чем на 10 мкм в этом направлении. Вращающиеся или неподвижные частицы считались неподвижными. Шкала бар No 10 мкм. (C) Первый кадр замедленного фильма отображения первичного HB9::GFP мыши спинного мозга explant аксоны окрашены Lysotracker красный пометить кислые отсеки и Mitotracker Deep Red для тегов митохондрий. Шкала бар No 10 мкм. (D) Представитель скимографов отображения типичных аксональных движения кислых отсеков и митохондрий. Шкала бар No 10 мкм. (E) Кимограф анализ митохондриального аксонального транспорта, зюп йlt; 0,0001, Anova с Коррекцией Холм-Сидак (n - 77 аксонов). Шкала бар No 10 мкм(F) Кимограф анализ кислого отсека аксонального транспорта, йп юlt; 0,01, йп юlt; 0,0001, Anova с Холм-Сидак коррекции (п - 77 аксонов). (G) Анализ плотности частиц Аксонала митохондрий и кислых отсеков, зюп злт; 0,0001, Студенческая t-тест (n 77 аксонов). Бары ошибок представляют значения с SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Полуавтоматический анализ отдельных частиц для измерения скорости органеллы. (A) Схематический рабочий процесс для полуавтоматизированного анализа переноса одной частицы. (B) Вентральный спинной мозг explant аксоны были проанализированы для отслеживания отдельных частиц. Программное обеспечение для анализа способно отслеживать отдельные аксональные частицы в фильмах замедленного времени, как указано для митохондрий (желтые точки, верхняя панель) и кислые отсеки (зеленые точки, нижняя панель). (C) Средняя скорость не изменилась между митохондриями и кислыми отсеками, тест Манн Уитни (n No 417 митохондрий, n no 371 кислых отсеков). Бары ошибок представляют значения с SD. (D) Распределение митохондриальных и кислых отсеков ретроградных и антероградных скоростей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Полный нейробазальный средний - для 50mL
Ингредиент Объем Концентрации
Нейробазал 47мЛ
B27 1 мл 2%
Лошадиная сыворотка 1 мл 2%
P/S 0,5 мл л. 1%
L-глютамин (Глютамакс) 0,5 мл л. 1%
Бета-Меркаптоэтанол (50мМ) 25 зл. 25 мкм
BDNF (10ug/mL) 5 зл 1нг/мл
GDNF (10ug/mL) 5 зл 1нг/мл
CNTF (10ug/mL) 2,5 л л 0,5 нг/мл

Таблица 1: Рецепт для подготовки полного нейробазального (CNB) раствора.

Решение Optiprep - для 10mL
Ингредиент Объем Концентрации
Ddw 5,27 мл л.
Плотность Градиентная среда (Optiprep) 60% 1,73 мл л. 10,4% (w/v)
Трицин 100мМ 1 мл 2%
Глюкоза 20% (w/v) 2 мл 2%

Таблица 2: Рецепт для подготовки градиентного среднего раствора плотности.

Спинной мозг Explant Medium (SCX) - для 20mL
Ингредиент Объем Концентрации
Нейробазал 19,5 мл л.
B27 200 зл. 2%
P/S 100 л 1%
L-глютамин (Глютамакс) 100 л 1%
Bdnf 50 зл 25нг/мл

Таблица 3: Рецепт для подготовки раствора выделения спинного мозга (SCEX).

Культура MN Спинной мозг Explants
Более длительная процедура до покрытия Короткая процедура - Рассекать и плиты
Дополнительная осторожность, необходимая для покрытия в МФЦ Легче пластины в МФЦ
Высокая концентрация моторных нейронов без глиальных клеток – более точная Наличие глиальных клеток и других типов нейронов – более физиологическое
Неограниченные возможности манипуляции как на Соме, так и на аксонах Ограниченные возможности манипуляции на клеточных телах
Легкое иммунопятно как для клеточных органов, так и для аксонов Низкая эффективность при иммуностабилизации клеточных тел внутри экспланта.
Высокая эффективность вирусной инфекции Очень низкая эффективность вирусной инфекции

Таблица 4: Сравнение между спинного мозга explants и диссоциированных MN культуры на основе периметров скорости, осуществимость, глиальное присутствие, возможности манипуляции, иммуно-пятно, и вирусной инфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе мы описываем систему отслеживания аксонального переноса митохондрий и кислых отсеков в моторных нейронах. Эта упрощенная платформа in vitro позволяет точно контролировать, контролировать и манипулировать субклеточными нейронными отсеками, позволяя экспериментальный анализ локальных функций моторных нейронов. Этот протокол может быть полезен для изучения заболеваний MN, таких как ALS, чтобы сосредоточиться на понимании основного механизма аксональной дисфункции транспорта при заболевании10,16. Кроме того, эта система также может быть применена для изучения переноса трофических факторов89,,16,микроРНК10, мРНК 8 , и помечены белки в здоровых и больных MNs или в других нейронов, таких как сенсорные9 или симпатической аксонов14. Аналогичный метод может быть также применен для изучения транспортировки органелл в системе сокультуры, таких как MNs культивируется с скелетными мышечными клетками12 или симпатической нейронов cocultured с кардиомиоцитами14. Система MFC может быть использована для генерации активных NMJs17,,18 и изучения влияния формирования синапсов на аксональный транспорт16.

Этот протокол имеет ряд преимуществ по сравнению с другими протоколами для культивирования нейронов в МФЦ и использования живой визуализации для анализа аксонального транспорта: 1) МФЦ коммерчески доступны несколькимпроизводителям. Тем не менее, самопроизводство МФЦ является чрезвычайно рентабельным по сравнению с коммерческой альтернативой. Одна вафля PDMS дает четыре больших МФЦ или девять небольших при минимальных затратах в несколько долларов США для самой смолы PDMS. 2) Самоуправляемые МФЦ могут быть модифицированы с целью удовлетворения конкретных экспериментальных потребностей (например, изменение размера и расположения скважин, увеличение толщины МФЦ PDMS). 3) МФЦ могут быть необратимо прикреплены к пластине (через плазменную связь), но также могут быть переработаны несколько раз, чтобы уменьшить вероятность загрязнения. 4) PDMS MFCs являются прозрачными, что делает их идеальными для живой визуализации, снижая фон, который имеет решающее значение для аксональных транспортных анализов, где различие сигнала к шуму может быть ограничивающим фактором. 5) Спинной мозг explant культуры очень эффективно и быстро. Один эмбриональный спинной мозг может дать до 30 explants, достаточно для 10 МФК. Это может помочь сохранить время и материалы, и гарантирует, что даже беременная мышь с несколькими эмбрионами может произвести успешный эксперимент. Смотрите подробное сравнение выделения спинного мозга и диссоциированной культуры MN в таблице 4.

Этот протокол является относительно простым и недорогим. Однако для этого необходимы знания в ряде технических вопросов. Производство и обработка МФЦ должна быть точной и мягкой, чтобы избежать структурных дефектов и создания пузырьков воздуха в обязательном вакуумном шаге (1.1.10), например. Во время дополнительного вакуумного шага (1.6.2) важно очистить весь воздух, или он будет блокировать аксональный скрещивания, но и держать вакуум коротким, чтобы избежать отрыва МФЦ от стекла. Обратите пристальное внимание на действия протокола вскрытия, так как важно правильно удалить оранжеры и дронские рога, а также попытаться разрезать кусочки до нужного размера, чтобы вставить их в пещеру МФЦ без применения физической силы. Любая чрезмерная физическая сила, применяемая к МФЦ, может легко отсоединить канавки или весь МФЦ, поэтому процедуру следует делать аккуратно. Культирование МН и покрытие их в МФЦ должно быть относительно быстрым, так как МН, как правило, агрегируют и быстро теряют жизнеспособность в стрессовых условиях, таких как низкий средний объем шага покрытия. Покрытие в МФЦ должно быть сделано в малом объеме, чтобы обеспечить правильное крепление нейронов в канале MFC, и после не более чем 30 мин разогретой среды должны быть добавлены очень осторожно, чтобы предотвратить отслоение MNs.

После нескольких дней в культуре, и как только аксоны распространились на дистальный отсек, культуры готовы пройти органеллы окрашивания с последующим приобретением аксональных транспортных фильмов и, наконец, специфическая процедура для анализа изображений. Анализ может быть выполнен либо путем отслеживания отдельных частиц с течением времени, либо с помощью автоматизированного или полуавтоматизированного алгоритма отслеживания. По нашему опыту, автоматизированные методы отнимают меньше времени, но имеют ряд недостатков. В основном, автоматизированная надежность слежения снижается, с переполненными аксонами, которые пересекают сяпоты. Кроме того, автоматизированные алгоритмы имеют уменьшенную способность различать перекрывающиеся частицы. Следовательно, рекомендуется выполнение ручного или полуавтоматического слежения. В целом, полуавтоматизированное отслеживание предпочтительнее, так как оно занимает меньше времени, но ручное отслеживание может быть хорошим вариантом, когда нет доступного платного программного обеспечения. Тщательное сравнение ручного и автоматического анализа можно найти в Gluska et al.9.

В заключение, принятие этого простого протокола может дать важные данные для изучения аксонального переноса различных клеточных компонентов. Он может быть адаптирован к разнообразию визуализации и нейрональных подтипов, а также к культурам нейронов с другими клетками. Он также позволяет различные пространственные фармакологические манипуляции либо клеточных органов или аксонов для того, чтобы понять основные механизмы нейронального здоровья и улучшить развитие лекарственных средств для заболеваний с измененным аксональным транспортом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Израильского научного фонда (ISF, 561/11) и Европейского исследовательского совета (ERC, 309377).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Tags

Нейронаука Выпуск 159 микрофлюидные камеры моторные нейроны спинной мозг экспланты аксональный транспорт митохондрии кислые отсеки
Аксональный Транспорт органелл в культурах моторных нейронов с использованием системы микрофлюидных камер
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., More

Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter