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Developmental Biology

वैस्कुलराइजेशन, विस्तारित विकास और बेहतर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए गुर्दे ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटिक संस्कृति का अनुकूलन

Published: March 28, 2020 doi: 10.3791/60995
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1,2,3
1Biocenter Oulu and Faculty of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Oulu, 2InfoTech Oulu, University of Oulu, 3Biobank Borealis of Northern Finland, Oulu University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

यह काम अंग विकास का अध्ययन करने के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है, एवियन भ्रूण से कोरियोएलन्टोइक झिल्ली (कैम) पर एक बेहतर विद्वेष सेटअप जो सुसंस्कृत भ्रूणीय अंगों और ऑर्गनॉइड के संवहनी करण के लिए अनुमति देता है और एक उपन्यास फिक्स्ड जेड-दिशा संशोधित प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ अंग संस्कृति विधि जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन समय-चूक कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुमति देती है।

Abstract

भ्रूणीय गुर्दे ऑर्गानाटिपिक संस्कृतियां, और विशेष रूप से pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न गुर्दे ऑर्गेनॉइड, विकासात्मक प्रक्रियाओं और मॉडलिंग गुर्दे की बीमारी का पालन करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण हैं। हालांकि, मॉडल संवहनी और कार्यक्षमता की कमी से सीमित हैं। इसका समाधान करने के लिए, संवहनी और रक्त प्रवाह की बहाली हासिल करने के लिए एवियन भ्रूण की कोरियोलंट्टोइक झिल्ली (कैम) के लिए कोशिकाओं और ऊतकों को xenografting की विधि के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। ग्राफ्ट कस्टम-निर्मित मिनीजलाशयों के साथ मढ़ा जाता है जो नमूनों को सीएएम में ठीक करते हैं और उन्हें संस्कृति माध्यम के साथ आपूर्ति करते हैं जो ग्राफ्ट को सूखने से बचाता है। बेहतर संस्कृति विधि ज़ेनोग्राफकोस को 9 दिनों तक बढ़ने की अनुमति देती है। पांडुलिपि में पहले से प्रकाशित फिक्स्ड जेड-डायरेक्शन (FiZD) विधि का उपयोग करके गुर्दे के ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटाइप संस्कृतियों की दीर्घकालिक कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए इष्टतम स्थितियां प्रदान करने का भी वर्णन किया गया है। यह विधि धीरे-धीरे एक बड़ी मात्रा में ग्लास कवरस्लिप और झिल्ली के बीच भ्रूणीय अंग या ऑर्गेनोइड को संकुचित करती है और 12 दिनों तक इमेजिंग के लिए उत्कृष्ट स्थितियां प्रदान करती है। साथ में, ये विधियां बेहतर कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ गुर्दे के ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटिक गुर्दे की संस्कृतियों को संवहनी और रक्त प्रवाह की अनुमति देती हैं। यहां वर्णित विधियां गुर्दे पूर्व वीवो के मौलिक और लागू कार्यों का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक फायदेमंद हैं। दोनों विधियां विभिन्न प्रकार के ऊतकों और ऑर्गेनॉइड पर लागू होती हैं।

Introduction

भ्रूण गुर्दे की ऑर्गानोटिक संस्कृति दशकों पहले1,2,3. गुर्दे के ऑर्गेनॉइड स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे 4 के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उन्नत मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्वकरतेहैं । हालांकि, दोनों तरीकों के लिए मुख्य दोष यह है कि न तो विधि गुर्दे के मुख्य कार्य को फिर से तैयार करती है: रक्त निस्पंदन। नेफ्रोन और गुर्दे के वास्कुल्चर वैवो विकास में प्रारंभिक चरण के समान गुर्दे के ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोपिक संस्कृतियों में विकसित होते हैं; हालांकि, ग्लोमेरिकुली में गठित विट्रो अवासर5रहते हैं . पूर्व वीवो भ्रूण गुर्दे और गुर्दे ऑर्गेनॉइड का संवहनी पहले केवल वीवो स्थितियों में प्रत्यारोपण प्रयोगों में प्रदर्शित किया गया था। उदाहरण के लिए, माउस किडनी कैप्सूल के नीचे मानव pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न गुर्दे के ऑर्गेनॉइड का प्रत्यारोपण ऑर्गेनॉइड में नेफ्रोन के विकास को कार्यात्मक चरण6में जाने की अनुमति देता है।

विशुद्ध रूप से इन विट्रो संस्कृतियों और वीवो प्रत्यारोपण विधियों के बीच एक मध्यवर्ती दृष्टिकोण एवियन भ्रूण के कैम के लिए विद्वेष है। अक्षुण्ण माउस किडनी प्राइमोर्डिया का संवहनी पहले इस प्रणाली7,8का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है । हालांकि, यह भी दिखाया गया कि ज़ेनोट्रांसप्लांट ेड यूरिन किडनी में रेनल वैक्यूलेचर मेजबान एंडोथेलियम से लिया गया था, न कि भ्रष्टाचार9से । इस अवलोकन ने गुर्दे की वैस्कुलचर के विकास का अध्ययन करने के लिए भ्रूणीय गुर्दे के चिमेरिक (एवियन-स्तनधारी) मॉडलकी क्षमता को काफी कम कर दिया, क्योंकि प्रायोगिक स्थितियां दाता-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए गैर-अनुमत थीं।

इस प्रोटोकॉल के पहले भाग में प्रस्तुत एवियन अंडे के कैम पर माउस भ्रूण गुर्दे की खेती के लिए एक बेहतर विधि है, जो ऑर्गानोटिक संस्कृति और विद्वेष की सूक्ष्म पर्यावरणीय स्थितियों का संयोजन है। पिछले तरीकों के लिए मुख्य सुधार यह है कि माउस भ्रूण गुर्दे और गुर्दे ऑर्गेनॉइड सीधे कैम पर रखने के बजाय, प्रत्यारोपण क्षेत्र संस्कृति माध्यम से भरा permeable minireservoirs के साथ मढ़ा है कि प्रत्यारोपित ऊतक की आपूर्ति पोषक तत्वों के साथ और इसे सुखाने से बचाएं। प्रयोगों की सफलता दर काफी बढ़ जाती है और दाता-व्युत्पन्न वास्कुलचर के विकास के लिए स्थितियां सुधर जाती हैं । xenotransplant संस्कृतियों के लिए इस विधि के आवेदन के परिणामस्वरूप ग्लोमर्युलर वास्कुलचर के विकास में दाता गुर्दे से एंडोथेलियल कोशिकाओं शामिल हैं।

सेलुलर मॉर्फोजेनेसिस का विस्तृत विश्लेषण गुर्दे की संस्कृति मॉडल का एक और महत्वपूर्ण अनुप्रयोग है। गुर्दे की संस्कृतियों के समय-चूक छवि अधिग्रहण के पहले सूचित विधियां केवल समग्र आकृति विज्ञान और भ्रूणीय गुर्दे के पैटर्न के विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं, लेकिन व्यक्तिगत कोशिकाओंको 10पर नज़र रखने के लिए नहीं। हाल ही में, एक उपन्यास फिक्स्ड जेड-डायरेक्शन (FiZD) विधि उच्च संकल्प conफोकल 3D समय-गुर्दे ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटिक संस्कृतियों की चूक इमेजिंग के उद्देश्य से11वर्णित किया गया था । इस विधि में, ऑर्गेनोइड और भ्रूणीय अंगों को धीरे-धीरे एक ग्लास कवरस्लिप और कस्टम-डिज़ाइन की गई प्लेट में ट्रांसवेल डालने की पारगम्य झिल्ली के बीच संकुचित किया जाता है जब तक कि नमूने की मोटाई 70 माइक्रोन तक न पहुंच जाए, इमेजिंग के लिए इष्टतम ऑप्टिकल स्थितियां प्रदान नहीं की जाती हैं। तरीकों के दूसरे भाग में, कस्टम-डिज़ाइन की गई प्लेट के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और दीर्घकालिक ऑर्गेनॉइड इमेजिंग के लिए FiZD प्रयोगों का सेटअप वर्णित है।

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Protocol

पशु देखभाल और प्रक्रियाएं प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए फिनिश राष्ट्रीय कानून के अनुसार थे, प्रायोगिक और अन्य वैज्ञानिक प्रयोजनों (ईटीएस १२३) के लिए इस्तेमाल कशेरुकी जानवरों की सुरक्षा के लिए यूरोपीय कन्वेंशन, और यूरोपीय संघ के निर्देश 86/609/EEC ।

1. चिकन कैम पर माउस भ्रूणगुर्दे और गुर्दे के ऑर्गेनॉइड की खेती के लिए मिनीजलाशयों का निर्माण और विद्वेष प्रयोगों की स्थापना

  1. 6 अच्छी तरह से या 12 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए डिज़ाइन ट्रांसवेल सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग करें।
    नोट: विशेष प्रयोग के आधार पर, बड़े या छोटे मिनीजलाशयों का उपयोग किया जा सकता है। आठ भ्रूण गुर्दे तक ज़ेनोग्राफिंग के लिए छोटे मिनीजलाशयों का उपयोग करना सबसे अच्छा है या जब एक ही चिकन भ्रूण (जैसे, प्रयोग और एक ही चिकन कैम पर नमूनों को नियंत्रित करना) पर कई मिनीजलाशय रखे जाएंगे।
  2. एक परिपत्र देखा ब्लेड या एक हाथ के साथ एक रोटरी मल्टीटूल का उपयोग कर आवेषण के किनारों को काट दें, जिसमें एक permeable झिल्ली संलग्न है।
  3. इन मिनीजलाशयों के किनारों को स्केलपेल या तेज चाकू से पॉलिश करें।
  4. कम से कम 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में मिनीजलाशयों को स्टरलाइज करें।
  5. ऑटोक्लेव ्ड डबल-आसुत पानी में मिनीजलाशयों को धोएं और उन्हें लैमिनार हुड में सूखने दें।
  6. पीबीएस और संस्कृति माध्यम (उच्च ग्लूकोज DMEM/10% FBS/1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) में मिनीजलाशयों को कुल्ला करें ।
  7. एक पेट्री डिश में जलाशय रखें, एक बूंद के शीर्ष पर (६०० μL/400 μL) संस्कृति माध्यम की झिल्ली का सामना करना पड़ के साथ ।
  8. एक पिपेट या ग्लास केशिका ट्यूब की मदद से झिल्ली पर समान रूप से विच्छेदित पूर्व वीवो भ्रूणीय गुर्दे या गुर्दे के ऑर्गेनॉइड की व्यवस्था करें। गुर्दे के आसपास बहुत सारे तरल छोड़ने से बचें।
  9. नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 2-24 घंटे के लिए झिल्ली से जुड़ने दें।
    नोट: छोटे डालने पर आठ E11.5 भ्रूणीय माउस गुर्दे या गुर्दे के ऑर्गेनॉइड की व्यवस्था की जा सकती है। बड़े डालने की सिफारिश की जाती है यदि भ्रूण ऊतक के या तो बड़े टुकड़ों का उपयोग ज़ेनोट्रांसप्लांट या कैम के एक बड़े क्षेत्र पर सेल-हाइड्रोगेल मिश्रण के लिए किया जाएगा।
  10. सेल कल्चर इनक्यूबेटर12,,13से पहले प्रकाशित तरीकों के अनुसार तैयार की गई 8 दिन पुरानी पूर्व ओवो सुसंस्कृत भ्रूणीय मुर्गियों को लें ।
  11. मिनीजलाशयों को कैम में स्थानांतरित करें ताकि ग्राफ्ट कैम का सामना कर रहे हों, और झिल्ली उन्हें ओवरले कर सके। मिनीजलाशयों को कैम की परिधि में रखें, ताकि वे चिकन भ्रूण को कवर न कर सकें।
    नोट: 12 अच्छी प्लेटों के लिए ट्रांसवेल आवेषण से निर्मित छोटे मिनीजलाशयों का उपयोग करते समय, एक कैम पर तीन मिनीजलाशयों को रखा जा सकता है।
  12. मिनीजलाशयों में संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोन (6 अच्छी तरह से डालें) या 300 माइक्रोन (12 अच्छी तरह से डालें) जोड़ें।
  13. चिकन कैम पर नमूनों को अधिकतम 9 दिनों तक खेती करें। मिनीजलाशयों में संस्कृति माध्यम की जगह रोजाना।
    नोट: प्रत्यारोपण के बाद 24-48 घंटे के रूप में जल्द ही नमूनों का संवहनी देखा जा सकता है।

2. कस्टम डिजाइन प्लेटों का निर्माण और FiZD संस्कृतियों की स्थापना

  1. ड्रिल 20 मिमी व्यास छेद एक 6 अच्छी तरह से थाली के नीचे में।
    नोट: FiZD प्रयोगों के लिए, 16 मिमी अच्छी गहराई (सामग्री की तालिकामें निर्दिष्ट) के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करें।
  2. छेद के रिम्स पॉलिश (विशेष रूप से ऊपरी तरफ) एक काउंटरसिंक ड्रिल बिट, एक स्केलपेल, या एक तेज चाकू के साथ एक इलेक्ट्रिक ड्रिल का उपयोग कर।
  3. प्लेटों को कम से कम 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में स्टरलाइज करें।
  4. प्लेटों को ऑटोक्लेव्ड डबल-आसुत पानी में धोएं और उन्हें बाँझ परिस्थितियों में सूखने दें।
  5. 70% इथेनॉल के साथ 22 मिमी x 22 मिमी ग्लास कवरस्लिप को अच्छी तरह से धोलें या11द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार उन्हें साफ करें।
  6. एक नॉनटॉक्सिक ऊतक गोंद का उपयोग करके 6 अच्छी तरह प्लेटों में छेद के ऊपरी हिस्से में कवरस्लिप गोंद करें। छेद के चारों ओर गोंद लगाएं और इसे कवर करने के लिए धीरे-धीरे कवरस्लिप रखें। गोंद को सूखने दें।
  7. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे प्लेटों का निरीक्षण करें और जरूरत पड़ने पर कवरस्लिप की सतह से अतिरिक्त सूखे गोंद को हटा दें।
    नोट: जांच करें कि नमूनों का संपीड़न सुनिश्चित करने के लिए कवरस्लिप के ऊपर कोई गोंद नहीं है।
  8. हाइड्रोजेल की बराबर मात्रा के साथ पॉलीस्टीरिन मोड्स (70 माइक्रोन कण आकार) मिलाएं। प्रति अच्छी तरह से 50-100 माइक्रोन की मात्रा पर्याप्त है।
    नोट: बर्फ पर हाइड्रोजेल और पॉलीस्टीरिन मोतियों का मिश्रण रखें।
  9. झिल्ली के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे ट्रांसवेल डालने रखें।
  10. झिल्ली पर नमूनों (जैसे, पूर्व वीवो भ्रूणीय गुर्दे या गुर्दे के ऑर्गेनॉइड) की व्यवस्था करें।
  11. नाजुक ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए नमूनों के बगल में हाइड्रोगेल/पॉलीस्टीरिन बीन मिश्रण को सावधानी से जोड़ें ।
  12. ट्रांसवेल डालने को पलटें ताकि उस पर इकट्ठे हुए नमूनों के साथ झिल्ली नीचे का सामना कर रही हो।
  13. धीरे-धीरे संशोधित 6 अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में डालने को रखें और धीरे-धीरे इसे दबाएं ताकि नमूने मोतियों के स्तर तक संकुचित हो जाएं।
    नोट: माइक्रोस्कोप का उपयोग करके संपीड़न की प्रगति का पालन करें।
  14. डालने को थोड़ा दबाकर एक हाथ से कुएं पर रखें और इसे डालने की परिधि में तीन बिंदुओं पर टांका लोहे के साथ प्लास्टिक पिघलकर प्लेट को ठीक करें।
  15. जब डालने की थाली में तय किया जाता है, तो अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम (DMEM/10% FBS/1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) के 2 मिलील को अच्छी तरह से जोड़ें और उसी तरह प्लेट में शेष कुओं को कोडांतरण जारी रखें ।
  16. तैयार प्लेट को समय-चूक इमेजिंग के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप के ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  17. उचित प्रयोगात्मक सेटिंग्स का उपयोग कर के नमूनों की समय-चूक इमेजिंग करें।
    नोट: समय चूक प्रयोगों के दौरान थाली के कुओं में संस्कृति माध्यम बदलने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन आसानी से डालने के किनारों पर छेद के माध्यम से किया जा सकता है ।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत कैम संस्कृति प्रोटोकॉल ने चिकन कैम(चित्रा 1, मूवी 1)पर विद्वेष प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप गुर्दे के ऑर्गनॉइड और भ्रूणीय गुर्दे के अत्यधिक कुशल संवहनी को सक्षम किया। संस्कृति माध्यम युक्त मिनीजलाशयों ने दाता ऊतकों को पोषक तत्वों की आपूर्ति की और उचित संवहनी से पहले की समयावधि के दौरान इसे सुखाने से बचाया । इस विधि ने दाता-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं को विकसित करने के लिए स्वतंत्र स्थितियां प्रदान की हैं। इसलिए, प्रत्यारोपित गुर्दे और ऑर्गेनॉइड में गुर्दे की वैकुलचर का अधिकांश प्रतिनिधित्व किया गया था, हालांकि विशेष रूप से नहीं, दाता-विशिष्ट कोशिकाओं(चित्रा 2बी,सी,एफ)द्वारा। गुर्दे और गुर्दे ऑर्गेनॉइड में गुर्दे की तुलना में कैम को प्रत्यारोपित किया गया था(चित्रा 2D,ई)।

FiZD-प्रोटोकॉल एक विधि है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूर्व वीवो भ्रूणीय गुर्दे और गुर्दे के ऑर्गेनॉइड की दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग के लिए डिज़ाइन की गई है। ट्रॉवेल14द्वारा डिजाइन किए गए शास्त्रीय ऑर्गानोटिक संस्कृति प्रोटोकॉल में, एक नमूना एक छिद्रपूर्ण फिल्टर पर रखा गया है, जो धातु ग्रिड द्वारा समर्थित है, और एयर-लिक्विड इंटरफेस(चित्रा 3ए)पर रखा जाता है। यह विधि या तो एक ईमानदार और उल्टे प्रकार के माइक्रोस्कोप के लिए इष्टतम नहीं है। यहां प्रस्तुत विधि विशेष रूप से इमेजिंग के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ कार्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। नमूना नीचे से एक ग्लास कवरस्लिप और ट्रांसवेल डालने की एक असुरक्षित झिल्ली (ऊपर देखें)(चित्रा 3B)के बीच स्थिर था। झिल्ली और कवरस्लिप के बीच इष्टतम दूरी ~ 70 माइक्रोन थी। पॉलीस्टीरिन मोतियों का उपयोग इस सीमा(चित्रा 3B)में नमूने की मोटाई सेट करने के लिए स्पेसर्स के रूप में किया जाता था।

कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 6 अच्छी तरह से प्लेटें नहीं हैं जहां ग्लास कवरस्लिप कुएं के नीचे की ऊपरी सतह पर स्थित है। इसलिए, कस्टम-डिज़ाइन की गई प्लेटों के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था जिसमें यह सुविधा(चित्रा 3बी)है। चित्रा 4 एक भ्रूण गुर्दे की संस्कृति के प्रतिनिधि आकृति विज्ञान से पता चलता है(चित्रा 4A,डी-एफ)और गुर्दे ऑर्गेनॉइड(चित्र4B,C)। मूवी 2 एक FiZD सेटअप में सुसंस्कृत माउस भ्रूणीय गुर्दे में एंडोथेलियल कोशिकाओं के उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग के परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है । मूवी 2 में सही पैनल दर्शाता है कि इस विधि का उपयोग करके व्यक्तिगत कोशिकाओं के वितरण और प्रवास दोनों को देखा जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: चिकन भ्रूण कैम के लिए ट्रांसप्लांट किए गए मिमूत्र भ्रूणीय गुर्दे के विद्वेष। 8 दिन पुराने पूर्व ओवो चिकन भ्रूण में E11.5 भ्रूणीय माउस गुर्दे के Xenotransplantation; कैम पर 7 दिनों तक एक मूत्र भ्रूणीय गुर्दे की खेती की गई थी। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1: चिकन भ्रूण कैम के लिए विद्वेष के बाद मूत्र भ्रूण गुर्दे में रक्त प्रवाह । एक मूत्र E11.5 भ्रूण गुर्दे एक 8 दिन पुराने चिकन भ्रूण के कैम के लिए xenotransplant था और 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत । फिल्म 7 दिन में विद्वेष में चिकन रक्त प्रवाह से पता चलता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Figure 2
चित्रा 2: चिकन भ्रूण कैम पर Murine भ्रूण गुर्दे विद्वेष। Murine E11.5 भ्रूण गुर्दे (एम) एक ऑर्गानोटिक संस्कृति (यानी, नियंत्रण) या एक 8 दिन पुराने भ्रूण चिकन कैम (सी) (यानी, प्रयोग) के लिए प्रत्यारोपित करने के रूप में खेती की गई । भ्रूण गुर्दे की खेती के 5 दिनों के बाद, नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों को एंडोथेलियल मार्कर सीडी31 (लाल)(ए-ई)और नाभिक (Hoechst; नीला)(डी, ई)के लिए निर्धारित किया गया था। (ग)चिकन और माउस रक्त वाहिकाओं (तीरसिर) के बीच अनास्तोमूसा। (D,E) नेफ्रोन के बीच से एक कॉन्फोकल स्लाइस दिखाया गया है। (एफ)7 दिनों के लिए ट्रांसजेनिक GFP-चिकन कैम के लिए murine E11.5 भ्रूणीय गुर्दे के Xenotransplantation, सीडी-31 (लाल) के लिए दाग । स्केल बार = ए-बी 100 माइक्रोन; C-ई 20 μm; एफ 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फिक्स्ड जेड दिशा संस्कृति विधि । (क)पारंपरिक संस्कृति विधि जहां नमूना ग्रिड द्वारा समर्थित एक असुरक्षित झिल्ली पर बढ़ता है और वायु-तरल इंटरफेस पर एक्सप्लांट पकड़ता है। (ख)नए FiZD सेटअप में, नमूना धीरे ग्लास कवरस्लिप और एक ट्रांसवेल असुरक्षित झिल्ली के बीच संकुचित किया गया था । पॉलिएस्टर मोतियों ने जेड-दिशा में समायोजित नमूने की मोटाई को नियंत्रित किया। यह आंकड़ा सारारेला एट अल11से संशोधित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: नई FiZD संस्कृति विधि में भ्रूण गुर्दे और गुर्दे ऑर्गेनॉइड विकास। नए फिजेडडी सेटअप का उपयोग करके भ्रूणीय गुर्दे(ए, डी-एफ)और किडनी ऑर्गेनॉइड(बी-सी)की खेती की गई थी। (A)FiZD संस्कृति के 7 दिन पर एक बरकरार भ्रूण माउस गुर्दे की ब्राइटफील्ड छवि । (ख)फिजेडडी संस्कृति के 7 दिन माउस किडनी ऑर्गेनॉइड की ब्राइटफील्ड छवि। (C)नए एफआईजेडडी सेटअप का उपयोग करके एमटीएमजी (लाल) माउस किडनी ऑर्गेनॉइड की खेती 4 दिनों के लिए की गई थी । समय-चूक छवि स्टैक का स्नैपशॉट विकासशील नेफ्रोन में Wnt4Cre-सक्रियGFP (ग्रीन) अभिव्यक्ति दिखाता है। (D)माउस भ्रूण ीय गुर्दे की खेती 7 दिनों के लिए नए FiZD सेटअप का उपयोग कर किया गया था । 62 (ग्रीन) और ट्रोमा-1 (Krt8, लाल) धुंधला नेफ्रोन अग्रदूत और मूत्रमार्ग कली (यूबी) विभाजन दिखाया, क्रमशः । (ई)माउस भ्रूणीय गुर्दे की प्रारंभिक तालीम को नए FiZD सेटअप का उपयोग करके 12 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। यह ट्रोमा-1 (लाल) और नेफ्रीन (ग्रीन) के साथ दाग था, और क्रमशः यूबी विभाजन और पोडोसाइट्स दिखाया गया था। (एफ)ट्रोमा-1 + (लाल) यूबी और नेफ्रोइन (ग्रीन) + पोडोसाइट्स के उच्च शक्ति आवर्धन के साथ में(ई)के रूप में एक ही नमूना । यह आंकड़ा सारारेला एट अल11से संशोधित किया गया था । स्केल बार = ए-डी, एफ 100 माइक्रोन; ई 1,000 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मूवी 2: जीएफपी के साथ लेबल किए गए गुर्दे एंडोथेलियल कोशिकाएं नए FiZD सेटअप में बढ़ती हैं और उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ देखी जा सकती हैं। E11.5 mTmG से भ्रूण गुर्दे; Tie1Cre चूहों को नए FiZD सेटअप का उपयोग करके 6 दिन विच्छेदित और उगाए गए थे। फिल्म एंडोथेलियल कोशिकाओं में Tie1Creप्रेरित GFP अभिव्यक्ति से पता चलता है । 20 z-परतों का एक ढेर एक 10x/0.45 उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया था, छवियों के साथ हर 15 मिन प्राप्त की । फिल्म में पांच जीएफपी जेड-लेयर्स और एक ब्राइट फील्ड फोकल प्लेन का विलय हो गया है । दाईं ओर पैनल एक विकासशील गुर्दे के एक करीबी से पता चलता है । एस-आकार चरण नेफ्रॉन के संवहनी फांक में पलायन करने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं को देखा जा सकता है। दाईं ओर पैनल में, GFP z-परत और एक उज्ज्वल क्षेत्र फोकल विमान का विलय कर दिया जाता है। तेजी से चलने वाली कोशिकाएं15की संभावना है । कुछ रक्त कोशिकाओं द्वारा जीएफपी सिग्नल भी व्यक्त किया गया था। वोक्सल आकार 0.69 माइक्रोन x 0.69 माइक्रोन x 4.13 माइक्रोन। इस फिल्म को सारेला एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

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Discussion

दो विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं जो शास्त्रीय गुर्दे की आर्गानोसाइटिक संस्कृति विधि को परिष्कृत करते हैं, और पूर्व वीवो भ्रूणीय गुर्दे और ऑर्गेनोइड की इमेजिंग संवहनी, विस्तारित विकास और इष्टतम 4डी (यानी, 3 डी छवि और समय) को सक्षम करते हैं। यह खंड तरीकों में महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डालता है और समस्या निवारण पर चर्चा करता है।

अन्य कैम संस्कृति विधियों और इस बेहतर चिकन कैम संस्कृति विधि के बीच महत्वपूर्ण अंतर कैम के लिए भ्रूण गुर्दे और गुर्दे ऑर्गेनॉइड के विद्वेष में कस्टम निर्मित मिनीजलाशयों का उपयोग है। संशोधित ट्रांसवेल डालने की झिल्ली नीचे चिकन कैम के खिलाफ नमूने दबाती है और उन्हें जगह में रखती है। डालने के पक्ष संस्कृति माध्यम के लिए एक जलाशय के रूप में काम करते हैं जो भ्रष्टाचार को सूखने से बचाता है। पूर्व ओवो सुसंस्कृत भ्रूणीय चिकन कैम के लिए Xenografting दृढ़ता से सिफारिश की है, क्योंकि इस विधि कैम के एक बड़े क्षेत्र को उजागर करता है जहां minireservoir रखा जा सकता है और यह आसान नेत्रहीन संवहनी प्रक्रिया12,,13का पालन करने के लिए बनाता है ।

चिकन कैम संस्कृति विधि की एक खामी यह है कि विद्वेष प्रदर्शन के लिए समय खिड़की 8-9 दिनों तक ही सीमित है जब चिकन भ्रूण का कैम अपमानजनक शुरू होने से पहले कार्य करता है। इसलिए विकसित करने के लिए लंबे समय तक की जरूरत वाले ग्राफ्ट को एक अलग ऊतक (जैसे, माउस किडनी कैप्सूल)6पर विद्वेष द्वारा संवहनी किया जाना चाहिए। दाता ऊतक के धारावाहिक विद्वेष इस लंबे ऊष्मायन समय समस्या का समाधान हो सकता है। विधि संवहनी और भ्रष्टाचार के विकास के समय चूक इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन पहले लघु जलाशय और कैम के स्थिरीकरण के लिए दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए आवश्यकता को संबोधित किया जाना चाहिए । चिकन कैम के लिए इस बेहतर गुर्दे विद्वेष प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ यह है कि विधि दाता-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं को कामयाब होने के लिए शर्तें प्रदान करती है।

FiZD-प्रोटोकॉल उच्च संकल्प कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूर्व वीवो भ्रूणीय गुर्दे और गुर्दे के ऑर्गेनॉइड की दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग के लिए डिज़ाइन की गई एक विधि का वर्णन करता है। सेटअप के लिए यह महत्वपूर्ण है कि अच्छी तरह से और सम्मिलित मैच के आयाम। जब एक कवरस्लिप 6 अच्छी प्लेट के नीचे से चिपका हुआ होता है और डालने को कुएं पर रखा जाता है, तो डालने की झिल्ली को ग्लास को छूना चाहिए। फिर, जब संस्कृति की स्थापना की जाती है, तो स्पेसर मोतियों झिल्ली की स्थिति का निर्धारण करेगा और परिणामस्वरूप सुसंस्कृत अंग या ऑर्गेनॉइड की मोटाई होगी। इस कारण से, अतिरिक्त गोंद को हटाना और यह जांचना महत्वपूर्ण है कि कोई भी सामग्री कवर ग्लास को छूने से डालने को प्रतिबंधित नहीं कर रही है। कवर ग्लास को संलग्न करने के लिए नॉनटॉक्सिक टिश्यू गोंद का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है। कृपया ध्यान दें कि गोंद बहुत दृढ़ता से संलग्न नहीं करता है, इसलिए प्लेटों को ध्यान से संभालना महत्वपूर्ण है। प्लेटों को पुन: उपयोग किया जा सकता है, और यदि वाशिंग स्टेप्स के दौरान कवर ग्लास अलग हो जाता है, तो इसे वापस चिपकाया जा सकता है।

FiZD इमेजिंग विधि एकल सेल स्तर पर नेफ्रोजेनेसिस के अध्ययन की अनुमति देता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन समय-चूक छवियों की उच्च गुणवत्ता स्वचालित सेल विभाजन के आवेदन को गुर्दे के ऑर्गेनॉइड और गुर्दे की संस्कृतियों में सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने की अनुमति देती है। 6 अच्छी प्लेट के विभिन्न कुओं में स्थित कई नमूनों का विभिन्न संस्कृति स्थितियों में एक साथ अध्ययन किया जा सकता है। तकनीक को स्पेसर मोतियों के आकार को बदलकर विभिन्न आकारों और ऊतक और ऑर्गेनॉइड के प्रकारों के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है; यह अंडाशय सेल संस्कृतियों14साथ प्रदर्शन किया गया था . इस विधि के एक और अनुकूलन के रूप में, हाल ही में प्रकाशित माइक्रोफ्लूइडिक दृष्टिकोण16 के साथ FiZD सेटअप का संयोजन गुर्दे के विकास के बाद के चरणों में सेलुलर मॉर्फोजेनेसिस के उच्च संकल्प सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अत्यधिक फायदेमंद हो सकता है।

FiZD विधि का एक लाभ यह है कि वहां संस्कृति माध्यम के बहुत उपलब्ध है और यह इमेजिंग के 1 सप्ताह के दौरान इसे बदलने के लिए आवश्यक नहीं है । फिर भी, अगर एक मीडिया परिवर्तन की जरूरत है, माध्यम आसानी से डालने की दीवार में एक खोलने से बदला जा सकता है । FiZD विधि अन्य अंग संस्कृति विधियों से भी बेहतर है जिसमें यह नमूना माइक्रोस्कोप उद्देश्य के करीब लाता है। अन्य व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले संस्कृति विधियों में इमेजड नमूने और उद्देश्य के बीच एक झिल्ली या फिल्टर और एक ग्लास प्लेट नीचे है, जो सटीक उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग17पर रोक लगाता है। FiZD विधि के साथ जीवित ऊतकों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करना संभव है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को सुमेन अकातेमिया (फिनलैंड अकादमी) (206038, 121647, 250900, 260056) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था; सेंटर ऑफ एक्सीलेंस ग्रांट 2012-2017 251314), मुनुइस्सäटिओ - फिनिश किडनी एंड लिवर एसोसिएशन, सिग्रिड जुसेलुकसेन Säätiö, विक्टोरियास्टिफ्टेलसेन, फिनलैंड में स्वीडिश कल्चरल फाउंडेशन, नोवो नॉर्डिस्क, Syöpäjärjestöt (फिनलैंड के कैंसर सोसायटी), यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013; अनुदान FP7-स्वास्थ्य-F5-2012-नवाचार-1 EURenOmics 305608), और H2020 मैरी Sklodowska-Curie कार्रवाई अभिनव प्रशिक्षण नेटवर्क "RENALTRACT" परियोजना 643 लेखक तकनीकी सहायता के लिए पाउला हाइपस, जोहाना केकोलाहटी-लियास और हैनेले हर्कमैन का शुक्रिया अदा करते हैं।

आंकड़े 3, 4, और फिल्म 2 विकाससे अनुमति के साथ फिर से मुद्रित कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable Spade Drill Bit Bosch 2609255277 For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner OLBA B.V., Netherlands AT-42 For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator Panasonic 13090543 Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator SANYO 10070347 Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate Greiner M9062 16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool Dremel SC690
Confocal Microscope Zeiss LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts Corning 10301031 For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit Craftomat, Bauhaus 22377902 For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube Blaubrand 7087 33
Disposable Scalpel Swann-Morton 0501
Dissecting Microscope Olympus SZ61
Drilling Machine Bosch GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma D777 High glucose
Egg Incubator Compact S84 Grumbach, Germany 8012 For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%) VWR
Fertilized Eggs Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum HyClone SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5 Dumont #5SF
Glass Coverslips Menzel-Gläser Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## 22x22 mm
Histoacryl Glue Braun 1050052
Matrigel Corning 356230
On-stage Incubator Okolab Boldline, custom made
PBS -/- Corning 20-031-CV
PBS +/+ Biowest X0520-500 Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin Sigma P4333
Polystyrene Beads Corpuscular 1000263-10 70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System Dremel 4000
Soldering Iron Weller TCP S Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane Greiner Bio-One 665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane Greiner Bio-One 657610

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 157 गुर्दे अंग संस्कृति समय चूक ऑर्गेनोइड इमेजिंग चिक कैम चिकन भ्रूण लड़की पूर्व ओवो संस्कृति संवहनी विद्वेष
वैस्कुलराइजेशन, विस्तारित विकास और बेहतर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए गुर्दे ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटिक संस्कृति का अनुकूलन
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Kaisto, S., Saarela, U.,… More

Kaisto, S., Saarela, U., Dönges, L., Raykhel, I., Skovorodkin, I., Vainio, S. J. Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60995, doi:10.3791/60995 (2020).

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