Summary
עבודה זו מתארת שתי שיטות למחקר התפתחות איברים, התקנה משופרת xenotransplantation שתלת על ממברנה כוראולאנטואית (CAM) מעוברי העופות המאפשר vascularization של איברים עובריים ואורגנואידים הרומן קבוע z-כיוון שיטת תרבות האיברים עם תנאים ניסיוני שונה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה מיקוד הזמן.
Abstract
התרבויות העובנותיות בכליות, ובעיקר בתאי גזע מסוג pluripotent, הם כלים מצוינים לטיפול בתהליכים ההתפתחותיים ובמחלת כליות הדוגמנות. עם זאת, המודלים מוגבלים על ידי חוסר vascularization ופונקציונליות. כדי לענות על כך, פרוטוקול משופר עבור השיטה של השתלת תאים ורקמות של xenooallאנטומי הקרום (CAM) של העובר העופות לקבל vascularization ושחזור זרימת הדם פותחה. השתלים מצופים בהתאמה אישית מיני מאגרים כי לתקן את הדגימות כדי CAM ולספק להם במדיום התרבות המגנה על השתלים מייבוש. שיטת התרבות המשופרת מאפשרת לגדל שתלי xenografts עד 9 ימים. כתב היד גם מתאר כיצד לספק תנאים אופטימליים לדימות ממוקד לטווח ארוך של מארגני כליות ותרבויות אורגאוטימית באמצעות שיטת הפעולה שפורסמה בעבר כיוון Z (FiZD). שיטה זו דוחסת בעדינות איבר עובריים או אורגנואיד בין שמיכות זכוכית ממברנה בכמות גדולה של בינונית ומספק תנאים מצוינים לדימות עד 12 ימים. ביחד, שיטות אלו מאפשרות זרימת הדם והזרמת דם לאורגנואידים כליות ולתרביות כליות אורגאוטיאית עם הדמיה משופרת של מיקוד. השיטות המתוארות כאן הן מועילות מאוד ללימוד פונקציות בסיסיות ומוחלות של כליות לשעבר vivo. שתי השיטות חלות על סוגים שונים של רקמות ואורגנואידים.
Introduction
התרבות האורגנותית של הכליות העובריים הפכה למודל חשוב ללמוד נפרוגנזה לפני עשורים1,2,3. אורגנואידים כליות מייצגים מערכת מודל מתקדמת לחקר התפתחות של כליות בריאה וחולה4. עם זאת, החיסרון העיקרי בשתי השיטות הוא שהשיטה אינה משנה את התפקוד העיקרי של הכליה: סינון דם. הנליות והכליות מתפתחות בתרביות כליות ובתרבויות אורגנואיות, בדומה לשלב מוקדם בפיתוח vivo; עם זאת, הפקולי הנוצרת בתוך מבחנה, נשארות נמק העצם5. Vascularization לשעבר הכליות העובריים ואורגנואידים הכליה הפגינו בעבר ניסויים השתלת רק תחת בתנאים vivo. לדוגמה, השתלת תא גזע בעוצמה האנושית של כליות מתחת לקפסולה העכבר מאפשר פיתוח של הנליות בארגון האורגנואיד לשלב פונקציונלי6.
גישה ביניים בין גרידא בתרבויות מבחנה ובשיטות השתלת vivo הוא xenotransplantation שתלת כדי מצלמת עוברי העופות. Vascularization של כליה כליות העכבר השלם הוכח בעבר באמצעות מערכת זו7,8. עם זאת, זה הוכח גם כי הכליות כליות בכליה murine המושתלים היה נגזר מהמארח אנדותל, לא את השתל9. התבוננות זו הפחיתה באופן משמעותי את הפוטנציאל של מודלים של כליה עובריים (העופות-יונקים) של כלייה מתחלקים ללמוד פיתוח של הכליות כליות, כי התנאים הניסיוניים היו לא מתירני להישרדות של תאים שמקורם בתורמים.
המוצגים בחלק הראשון של פרוטוקול זה היא שיטה משופרת לטיפוח של כליות עובריים של העכבר על מצלמת ביצי עופות, שילוב של תנאים מיקרו סביבתיים של תרבות ארגונית ו-xenotransplantation שתלת. השיפור העיקרי השיטות הקודמות היא כי במקום למקם את הכליות מעובריים וכליות אורגנואידים ישירות על מצלמת הרשת, אזור ההשתלה מצופה במיני מאגרים חדיר מלאים במדיום התרבות כי לספק את הרקמה המושתלת עם חומרים מזינים ולהגן עליו מפני ייבוש. שיעור ההצלחה של הניסויים גדל באופן משמעותי והתנאים לפיתוח של ואסיקובלטורה המופק על ידי תורמים משפרים. היישום של שיטה זו לתרבויות xenotransplant שתלות תוצאות בפיתוח של בנייה של הפקלותתיל מורכב של תאים אנדוגאל אנדוסוגאל מכליות התורמים.
ניתוח מפורט של הסלולר מורפולגנזה הוא יישום נוסף חשוב של מודלים תרבות הכליה. שיטות שדווחו בעבר על רכישת תמונות בזמן הקפיצה של תרביות כליות מספיקות רק לניתוח של מורפולוגיה כוללת ומחקר של כליה עובריים, אך לא למעקב אחר תאים בודדים10. לאחרונה, הרומן קבוע Z-כיוון (fizd) שיטה שמטרתה ברזולוציה גבוהה קונפוקלית וקד 3d זמן הדמיה של מאורגנואידים כליות ותרבויות אורגאוטימית תוארה11. בשיטה זו, אורגנואידים והאיברים העובריים דחוסים בעדינות בין שמיכות זכוכית קרום חדיר של הכנס transwell בלוח מעוצב מותאם אישית עד עובי המדגם מגיע 70 μm, מתן תנאים אופטיים אופטימליים עבור הדמיה. בחלק השני של השיטות, פרוטוקול מפורט לייצור של צלחת מעוצב מותאם אישית והכיוונון של הניסויים FiZD עבור הדמיה לטווח ארוך של אורגנואיד מתואר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בבעלי חיים ונהלים היו בהתאם לחקיקה הלאומית הפינית לשימוש בבעלי חיים מעבדתיים, האמנה האירופית להגנה על בעלי חוליות המשמשות למטרות נסיוניות ומדעיות אחרות (ETS 123), והוראת האיחוד האירופי 86/609/EEC.
1. ייצור מיני מאגרים לטיפוח הכליות העכבר מעובריים כליות אורגנואידים על מצלמת עוף והגדרת ניסויים xenotransplantation שתלת
- השתמש מוסיף תרבות התא המיועדים 6 טוב או 12 צלחות היטב.
הערה: בהתאם לניסוי המסוים, ניתן להשתמש במינימאגרים גדולים או קטנים. עדיף להשתמש במיני מאגרים קטנים עבור השתלה של שתלה עד שמונה כליות עובריים או כאשר מיני מאגרים יהיה להציב על אותו עובר עוף (g., ניסוי ובקרה דגימות על אותו מצלמת עוף). - חותכים את הצדדים של התוספות באמצעות מרובה רוטרי עם להב מסור עגול או יד מסור ליצור טבעת 2 מ"מ פלסטיק גבוהה עם קרום חדיר המצורפת אליו.
- להבריק את הקצוות של מיני מאגרים אלה עם אזמל או סכין חדה.
- לחטא את המינימאגרים ב 70% אתנול לפחות 1 h.
- רוחצים את מיני המאגרים במים מזוקקים כפולים, ומאפשרים להם להתייבש בשכונה שכבתית.
- שטפו את מיני המאגרים ב-PBS ובמדיום התרבותי (מדיום גבוה/10% FBS/1% פניצילין-סטרפטומיצין).
- מניחים את המאגר בצלחת פטרי, על גבי טיפה (600 μL/400 μL) של מדיום התרבות עם הקרום פונה כלפי מעלה.
- לסדר את הכליות vivo עובריים או כליות אורגנואידים באופן שווה על הקרום בעזרת פיפטה או צינור נימי זכוכית. להימנע מהשארת הרבה נוזל סביב הכליות.
- תנו לדגימות להתחבר לקרום עבור 2 – 24 שעות בחממה לתרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
הערה: עד שמונה כליות העכבר העובריים 11.5 או אורגנואידים כליה ניתן לארגן על הכנס הקטן. התוספת גדול מומלץ אם חתיכות גדולות יותר של רקמה עובריים ישמש עבור xenotransplant שתלה או שילוב תא הידרוג'ל על אזור גדול יותר של מצלמת. - לקחת שמונה ימים-לשעבר העופות העובריים מתורבת הוכנו על פי שיטות שפורסמו בעבר מתוך חממה תרבות התא12,13.
- להעביר את המינימאגרים כדי CAM כך את השתלים פונים מצלמת, ואת הקרום שכבות אותם. מניחים את המיני מאגרים בפריפריה של CAM, כך שהם לא מכסים את העובר עוף.
הערה: כאשר משתמשים מיני מאגרים קטנים מפוברק מוסיף transwell עבור 12 לוחות היטב, עד שלושה minireservoirs ניתן להציב על מצלמת אחד. - הוסף 500 μL (6 הכנס היטב) או 300 μL (12 הוספה טובה) של התרבות הבינונית למינימאגרים.
- לטפח דגימות על עוף CAM עבור מקסימום של 9 ימים. החלף את מדיום התרבות במינימאגרים מדי יום.
הערה: Vascularization של הדגימות ניתן לצפות ברגע 24 – 48 h לאחר ההשתלה.
2. ייצור צלחות מותאמות אישית והגדרת תרבויות FiZD
- מקדחה 20 מילימטר חורים בקוטר בחלק התחתון של 6 צלחת הבאר.
הערה: עבור ניסויים FiZD, השתמש 6 צלחות טוב עם עומק 16 מ"מ היטב (מצוין בטבלה של חומרים). - להבריק את החישוקים של החורים (בעיקר בצד העליון) באמצעות מקדחה חשמלית עם סיבית מקדחה כיור, אזמל, או סכין חדה.
- לחטא את הצלחות ב-70% אתנול לפחות 1 h.
- רוחצים את הצלחות במים מזוקקים כפולים, ומאפשרים להם להתייבש בתנאים סטריליים.
- לשטוף ביסודיות 22 מ"מ x 22 מ"מ שמיכות זכוכית עם 70% אתנול או לנקות אותם על פי הפרוטוקול שפורסם על ידי זארזלה ואח '11.
- הדבק את הכיסויים בצד העליון של החורים ב 6 צלחות היטב באמצעות דבק רקמות לא רעיל. החלת דבק סביב החור ובעדינות למקם את coverslip כדי לכסות אותו. . תן לדבק להתייבש
- בדוק את לוחיות תחת stereomicroscope ולהסיר דבק מיובש עודף מפני השטח של הכיסויים במידת הצורך.
הערה: בדוק כי אין דבק מעל coverslip כדי להבטיח אפילו דחיסה של דגימות. - מערבבים פוליסטירן מוקצף (70 יקרומטר בגודל חלקיק) עם נפח שווה של הידרוג'ל. נפח של 50-100 μL לכל טוב הוא מספיק.
הערה: שמרו על התערובת של הידרוג'ל ומחרוזות פוליסטירן על קרח. - מניחים הוספת העברה מתחת למיקרוסקופ מבתר עם הקרום למעלה.
- לסדר את הדגימות (למשל, לשעבר vivo עובריים כליות או אורגאונואידים כליות) באופן שווה על הקרום.
- הוסיפו את ההידרוג'ל/פוליסטירן מוקצף לצד הדגימות בזהירות כדי למנוע נזק לרקמות שבירות.
- הפוך את התותב להוסיף כך את הקרום עם דגימות שנאספו עליו הוא פונה כלפי מטה.
- בעדינות למקם את ההכנסה לתוך באר של שונה 6 צלחת הבאר בעדינות ללחוץ אותו למטה כך דגימות נדחסים לרמת החרוזים.
הערה: בצע את ההתקדמות של הדחיסה באמצעות מיקרוסקופ. - לשמור על הוספת לחצה מעט לבאר עם יד אחת ולתקן אותו לצלחת על ידי ההיתוך פלסטיק עם ברזל הלחמה בשלוש נקודות בפריפריה של הכנס.
- כאשר ההכנסה מתוקנת לצלחת, להוסיף 2 מ ל של תרבות בינונית (DMEM/10% FBS/1% פניצילין-סטרפטומיצין) ולהמשיך להרכיב את שאר הבארות בצלחת באותו אופן.
- העבר את הצלחת המוגמר לחממה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך לדימות זמן.
- בצע הדמיה בזמן הדמייה של דגימות באמצעות הגדרות ניסוי מתאים.
הערה: שינוי מדיום התרבות בבארות הצלחת במהלך ניסויים בזמן, אינו נדרש, אך ניתן לעשות זאת בקלות דרך החורים בצידי התותב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול התרבות פקה הציג כאן איפשר והוא יעיל מאוד vascularization של כליות אורגנואידים וכליות עובריים כתוצאה של xenotransplantation שתלת על עוף מצלמת (איור 1, סרט 1). מיני מאגרים המכילים בינונית תרבותית שסופקו חומרים מזינים לרקמת תורם והגנה אותו מפני ייבוש במהלך תקופת הזמן לפני vascularization נאותה. שיטה זו סיפקה תנאים מתירני לתאים הניתנים לתורם הנגזר לצמוח. לפיכך, הכליות והכליות ב כליות המושתלים ואורגנואידים הוצגו בעיקר, אם כי לא באופן בלעדי, על-ידי תאים ספציפיים לתורם (איור 2b,C,F). בוגרת יותר ואצלב בוגר הושגה כליות אורגנואידים כליות מושתלים כדי CAM מאשר בתרבויות כליות אורגאוטימית (איור 2D,E).
Fizd-protocol הוא שיטה המיועדת להדמיה לטווח ארוך הדמיה של כליות vivo עובריים לשעבר ואורגנואידים הכליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה. בפרוטוקול התרבות הקלאסית אורגנוסטימית שתוכננה על ידי הגרנל14, דגימה מונחת על מסנן נקבובי, נתמך על ידי רשת מתכת, ונשמר בממשק האוויר-נוזלי (איור 3a). שיטה זו אינה אופטימלית גם עבור סוג של מיקרוסקופ זקוף או הפוך. השיטה שהוצגה כאן תוכננה במיוחד כדי לתפקד עם מיקרוסקופ הפוך להדמיה. המדגם היה ללא קיבוע בין שמיכות זכוכית מלמטה וממברנה נקבובי של הוספה transwell (ראה לעיל) (איור 3B). המרחק האופטימלי בין קרום לבין שמיכות היה ~ 70 μm. חרוזים פוליסטירן שימשו מרווחים כדי להגדיר את העובי של הדגימה בטווח הזה (איור 3B).
אין מסחרית זמין 6 לוחות היטב שבו שמיכות זכוכית ממוקם על המשטח העליון של החלק התחתון של הבאר. לכן, הפרוטוקול פותח לייצור צלחות מעוצבות בהתאמה אישית בעלת תכונה זו (איור 3B). איור 4 מראה את המבנה הייצוגי של תרבות כליות עובריים (איור 4a,D-F) ואורגנואידים כליות (איור 4a,ג). סרט 2 מייצג את התוצאות של הדמיה ברזולוציה גבוהה לשגות הזמן של תאים אנדותל בכליות מעובריים העכבר בתוך ההתקנה FiZD. הלוח הימני בסרט 2 ממחיש שניתן להבחין הן בהתפלגות והן בהעברה של תאים בודדים באמצעות שיטה זו.
איור 1: מורנין כליה עובריים xenotransplanted ושתלים העובר עוף CAM. Xenotransplantation שתלת של E 11.5 כליות העכבר העובריים לתוך 8 יום-בן לשעבר העובר עוף ברובו; כליה עובריים מורבית היה מטופח במשך 7 ימים על CAM. סרגל קנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט 1: זרימת הדם בכליה עובריים מוריין לאחר השתלת xenotransplantation מצלמת העובר עוף. מורנין E 11.5 כליה עובריים היה xenotransplanted ושתלים למצלמת מצלמת העובר של שמונה ימים ומתורבת במשך 7 יום. הסרט מראה זרימת דם עוף בשתל מבע יום 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
איור 2: מוריין עובריים כליה השתלת על מצלמת העובר עוף. מורנה E 11.5 כליות עובריים (m) היו מעובדות כתרבות אורגנוטימית (כלומר, שליטה) או xenotransplanted ושתלים ל 8 יום-הישן מצלמת עוף מתחלקים (c) (כלומר, ניסוי). לאחר 5 ימים של טיפוח כליות עובריים, השליטה והדגימות הנסיוניות היו קבועות ומוכתמות עבור הסמן האנדותל CD31 (אדום) (A – e) והגרעינים (הופסט; כחול) (D, e). (ג) אנסטוסים בין כלי דם של עוף ועכבר (ראשי חץ). (ד,ה) פרוסה אחת של מיקוד מאמצע הנפרון מוצגת. (ו) xenotransplantation שתלת של מורנה e 11.5 כליה עובריים כדי טרנסגניים-עוף מצלמת במשך 7 ימים, ויטראז עבור CD-31 (אדום). קנה מידה ברים = A–B 100 μm; C-E 20 μm; F 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שיטת התרבות כיוון קבוע Z. (א) שיטת תרבותמסורתיתשבה המדגם גדל על קרום נקבובי נתמך על ידי רשת ומחזיק את ההסבר בממשק נוזלי האוויר. (ב) ההתקנה החדשה FiZD, המדגם היה דחוס בעדינות בין שמיכות זכוכית קרום נקבובי היטב. חרוזי פוליאסטר שלטו בעובי של המדגם מותאם בכיוון z. הדמות הזאת שונתה מזאראלה ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הכליות עובריים ופיתוח כליות אורגנואיד בשיטת התרבות החדשה FiZD. כליות עובריים (A, D-F) ואורגנואידיםכליות(ב – C) טיפחו באמצעות ההתקנה החדשה של fizd. (א) ברייטפילד הדימוי של כליה עכבר עובריים ללא פגע ביום 7 של התרבות FiZD. (ב) ברייטפילד תמונה של אורגאיד כליה של העכבר ביום 7 של התרבות FiZD. (ג) mtmg (אדום) כליה העכבר אורגנואיד היה מטופח עבור 4 ימים באמצעות ההתקנה החדשה של FiZD. תצלום הבזק של ערימת התמונות בזמן הצילום מראה Wnt4Creהמופעל ביטוי gfp (ירוק) בהתפתחות הנליות. (D) העכבר העובריים מעובד עבור 7 ימים באמצעות ההתקנה החדשה של FiZD. Six2 (ירוק) ו troma-1 (Krt8, אדום) הצביעת הראה כנפרון בשרי ו-ureteric ניצן (ועוד) הבייונים, בהתאמה. (E) העכבר העובריים הכליה היתה תרבותית עבור 12 ימים באמצעות ההתקנה החדשה של FiZD. היא הייתה מוכתמת ב-Troma-1 (אדום) ובנפרורין (ירוק), והראתה הסתעפות ופודוקציטים בהתאמה. (ו) אותו מדגם כמו ב (E) עם הגדלה בעוצמה גבוהה של troma-1 + (אדום) והנפרורין (ירוק) + podocytes. הדמות הזאת שונתה מזאראלה ואח '11. קנה מידה שלסרגלים = A-D, F 100 μm; E 1,000 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט 2: תאי כליות אנדותל עם המסומנת gfp לגדול fizd ההתקנה החדשה יכול להיות נצפתה עם ברזולוציה גבוהה קונפוקלית יקרוסקופית מיקרוסקופ. הכליות עובריים של E 18.5 Mtmg; עכברים Tie1Cre גזור וגדל 6 ימים באמצעות ההתקנה החדשה FiZD. הסרט מציג ביטוי GFP Tie1Creהמושרה בתאי האנדותל. ערימה של 20 z-שכבות נלקח באמצעות מטרה 10x/0.45, עם תמונות שהתקבלו כל 15 דקות. בסרט, חמישה GFP z-שכבות ומטוס מוקד אחד בהיר השדה מתמזגים. הפאנל בצד ימין מראה תקריב של כליה מתפתחת. תאים אנדותל לעבור לתוך שסוע כלי הדם של בשלב S-צורת הנרונס ניתן לראות. בחלונית מימין, שכבת ה-GFP z ומטוס מוקד אחד בהיר ממוזגים. התאים נע במהירות סביר להניח מקרופאגים15. אות GFP התבטא גם על ידי כמה תאי דם. Voxel בגודל 0.69 יקרומטר x 0.69 יקרומטר x 4.13 יקרומטר. הסרט הזה שונה מזאראלה ואח '11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שני פרוטוקולים מפורטים מוצגים המחדד את שיטת התרבות הקלאסית כליות אורגנותמית, ולאפשר vascularization, התפתחות מורחבת, ו 4D אופטימלי (כלומר, 3D תמונה וזמן) הדמיה של כליות vivo עובריים ואורגנואידים. סעיף זה מדגיש את השלבים הקריטיים בשיטות ודן בפתרון בעיות.
ההבדל המשמעותי בין שיטות אחרות של מצלמת התרבות קאם לבין שיטת התרבות המשופרת של מצלמת העוף הוא השימוש במיני-מאגרים מותאמים אישית ב-שתלה הכליות העובריים ואורגנואידים כליות למצלמת הסרט. התחתון הקרום של הכנס שונה להוסיף לוחץ על דגימות נגד מצלמת עוף ושומר אותם במקום. הצדדים של התוספת לשמש מאגר למדיום התרבות כי מגן על השתל מפני ייבוש. Xenografting שתלת מצלמת עוף עובריים מתורבת מומלץ מאוד, כמו שיטה זו חושפת אזור גדול יותר של מצלמת שבו ניתן למקם את minireservoir והופכת אותו קל ויזואלי לעקוב אחר תהליך vascularization12,13.
חיסרון של עוף קאם שיטת התרבות היא כי חלון הזמן לביצוע השתלת xenotransplantation וגבל 8-9 ימים כאשר מצלמת העובר התרנגול פונקציות לפני שהוא מתחיל משפיל. שתלי הצורך זמן רב יותר לפתח צריך להיות ולכן באמצעות השתלת xenotransplantation רקמות שונות (למשל, קפסולת כליה העכבר)6. השתלת סדרתי של רקמת תורם עשויה להיות פתרון לבעיית זמן הדגירה הארוכה. השיטה יכולה להיות מותאמת להדמיית זמן הדמיה של vascularization ופיתוח של השתל, אבל תחילה את הדרישה לייצוב של minireservoir ו-CAM עבור הדמיה ארוכת טווח חייב להיות ממוען. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה משופר כליות xenotransplantation שתלת עוף CAM היא כי השיטה מספקת תנאים עבור תאים תורמים נגזר התורם לשגשג.
Fizd-protocol מתאר שיטה המיועדת לדימות זמן ארוך לטווח הדמיה של כליות vivo עובריים לשעבר ואורגנואידים הכליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה. עבור הכיוונון הוא קריטי שממדי הבאר וההכנסה תואמים. כאשר coverslip מודבק לתחתית של 6 צלחת הבאר וההכנסה מונחת על הבאר, קרום התותב צריך לגעת בזכוכית. לאחר מכן, כאשר התרבות מוגדרת, חרוזי החלל יקבע את מיקום הקרום וכתוצאה מכך את עובי האיבר התרבותי או אורגנואיד. מסיבה זו, חשוב להסיר את הדבק העודף ולבדוק ששום חומר אינו מגביל את התוספת לנגיעה בזכוכית המכסה. חשוב גם להשתמש בדבק רקמות שאינו רעיל כדי לחבר את הזכוכית המכסה. הינכם מתבקשים לשים לב כי הדבק אינו מתחבר בחוזקה, כך שחיוני לטפל בלוחות בזהירות. ניתן לעשות שימוש חוזר בלוחות, ואם זכוכית העטיפה מתנתק במהלך שטיפת המדרגות, ניתן לדבוק בה בחזרה.
שיטת הדימות FiZD מאפשרת לימוד של נפרוגנזה ברמת תא בודד. איכות גבוהה של תמונות זמן ברזולוציה גבוהה לשגות מאפשר את היישום של פילוח תא אוטומטי כדי ללמוד התנהגות תאית בתרביות כליות ובתרבויות כליות. מספר דוגמאות הממוקמות בבארות שונות של 6 צלחות באר ניתן ללמוד בו זמנית בתנאי תרבות שונים. ניתן לשנות את הטכניקה בקלות בגדלים וסוגים שונים של רקמות ואורגנואידים על ידי שינוי גודל חרוזי החלל; זה הוכח עם תרביות תאים השחלות14. כאופטימיזציה נוספת של שיטה זו, שילוב FiZD ההתקנה עם הגישות מיקרופלואידיc שפורסמו לאחרונה16 עשוי להועיל מאוד עבור ניתוח מיקרוסקופי ברזולוציה גבוהה של מורפולגנזה סלולרית בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות הכליות.
אחד היתרונות של שיטת FiZD היא כי יש הרבה מדיום התרבות זמין ואין צורך לשנות אותו במהלך השבוע 1 של הדמיה. עדיין, אם יש צורך בשינוי מדיה, ניתן לשנות בקלות את המדיום מפתיחה בקיר ההוספה. השיטה FiZD הוא גם מעולה לשיטות אחרות תרבות איברים בכך שהוא מביא את הדגימה קרוב יותר למטרה המיקרוסקופ. בשיטות תרבות אחרות בשימוש נרחב יש ממברנה או מסנן וצלחת זכוכית בתחתית בין דגימת הדמיה למטרה, האוסרת על הדמיה מדויקת ברזולוציה גבוהה17. עם שיטת FiZD ניתן לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של רקמות החיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת מבחינה פיננסית על ידי האקדמיה האקדמית של פינלנד (206038, 121647, 250900, 260056; מרכז המצוינות בהענקת 2012-2017 251314), מונאיזזזאקאז-פינית כליה וכליות, האגודה השוודית לתרבות בפינלנד, ויקטוריה, הקרן השבדית. נובו Nordisk, מערכת הסרטן (האגודה הסרטנית של פינלנד), תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013; גרנט FP7-בריאות-F5-2012-חדשנות -1 EURenOmics 305608), ו H2020 מארי Sklodowska-קירי פעולות הדרכה חדשני רשת "RENALTRACT דרכי" פרויקט מזהה 642937. המחברים מודים לפאולה הייפוס, ג'ואנה קקולאטי-ליפיי והאננלסון היקמן לסיוע טכני.
מספרים 3, 4 ו-Movie 2 מודפס באישור מפיתוח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
