Summary
Dette arbejde beskriver to metoder til at studere organudvikling, en forbedret xenotransplantation setup på chorioallantoic membran (CAM) fra aviær embryoner, der giver mulighed for vaskularisering af dyrkede embryonale organer og organoider og en ny fast z-retning organkulturmetode med modificerede eksperimentelle betingelser, der giver mulighed for konfokal billeddannelse med høj opløsning.
Abstract
Embryonale nyre organotypic kulturer, og især pluripotente stamceller-afledte nyre organoider, er fremragende værktøjer til at følge udviklingsprocesser og modellering nyresygdom. Men modellerne er begrænset af en mangel på vaskularisering og funktionalitet. For at løse dette, en forbedret protokol for metoden til xenografting celler og væv til chorioallantoic membran (CAM) af en aviær embryo for at få vaskularisering og restaurering af blodgennemstrømningen blev udviklet. Transplantatet er overlejret med specialfremstillede minireservoirer, der fastgør prøverne til CAM og forsyner dem med dyrkningsmedium, der beskytter grafts mod tørring. Den forbedrede kulturmetode gør det muligt for xenografts at vokse i op til 9 dage. Håndskriftet beskriver også, hvordan man kan give optimale betingelser for langsigtet konfokal billeddannelse af renale organoider og organotypic kulturer ved hjælp af den tidligere offentliggjorte Fixed Z-Direction (FiZD) metode. Denne metode komprimerer forsigtigt et embryonalt organ eller organoid mellem en glasdæksel og membran i en stor mængde medium og giver fremragende betingelser for billeddannelse i op til 12 dage. Sammen, disse metoder tillader vaskularisering og blodgennemstrømning til nyre organoider og organotypic nyrekulturer med forbedret konfokal billeddannelse. De metoder, der er beskrevet her, er meget gavnligt for at studere grundlæggende og anvendte funktioner nyrer ex vivo. Begge metoder gælder for forskellige typer af væv og organoider.
Introduction
Organotypic kultur embryonale nyrer blev en vigtig model til at studere nephrogenesis årtier siden1,2,3. Renal organoider repræsenterer et avanceret modelsystem til undersøgelse af udviklingen af sunde og syge nyrer4. Den største ulempe for begge metoder, dog, er, at ingen af metoderne opsummerer den vigtigste funktion af nyrerne: blodfiltrering. Nephroner og renal vaskulatur udvikle sig i renal organoider og organotypic kulturer på samme måde som tidlige stadium i vivo udvikling; men glomeruli dannet in vitro forbliver avaskulær5. Vaskularisering af ex vivo embryonale nyrer og renale organoider blev tidligere kun påvist i transplantationsforsøg under in vivo-forhold. For eksempel, transplantation af humane pluripotente stamceller-afledte nyre organoider under en mus nyre kapsel giver mulighed for udvikling af nefroner i organoid til en funktionel fase6.
En mellemliggende tilgang mellem rent in vitro-kulturer og in vivo-transplantationsmetoder er xenotransplantation til CAM af aviær embryoner. Vaskularisering af intakt mus nyre primordia er blevet påvist tidligere ved hjælp af dette system7,8. Det blev dog også påvist, at renal vaskulaturen i xenotransplanterede murine nyre var afledt9af værten endotel, ikke transplantat9 . Denne observation reducerede i betydelig grad potentialet i kimære (aviær-pattedyr) modeller af embryonale nyrer til at studere udviklingen af renal vaskulaturen, fordi de eksperimentelle betingelser var nonpermissive for overlevelsen af donor-afledte endotelceller.
Præsenteret i første del af denne protokol er en forbedret metode til dyrkning af mus embryonale nyrer på CAM af aviær æg, der kombinerer mikromiljømæssige betingelser for organotypic kultur og xenotransplantation. Den største forbedring af tidligere metoder er, at i stedet for at placere musen embryonale nyrer og renal organoids direkte på CAM, implantation området er overlejret med gennemtrængelige minireservoirer fyldt med kultur medium, der leverer det transplanterede væv næringsstoffer og beskytte det mod tørring. Succesraten for forsøgene øges betydeligt, og betingelserne for udvikling af donorafledt vaskulatur forbedres. Anvendelse af denne metode på xenotransplantkulturer resulterer i udvikling af glomerulær vaskulatur bestående af endogene endotelceller fra donornyrer.
Detaljeret analyse af cellulære morfogenese er en anden vigtig anvendelse af nyre kultur modeller. Tidligere rapporterede metoder til time-lapse billede erhvervelse af nyrekulturer er tilstrækkelige kun til analyse af den samlede morfologi og mønstre af embryonale nyre, men ikke til sporing af individuelle celler10. For nylig, en ny Fast Z-Direction (FiZD) metode med henblik på høj opløsning konfokale 3D time-lapse billeddannelse af nyre organoider og organotypic kulturer blev beskrevet11. Ved denne metode komprimeres organoiderne og embryonale organer forsigtigt mellem en glasdæksel og en gennemtrængelig membran af et transwell-skær i en specialdesignet plade, indtil prøvens tykkelse når 70 μm, hvilket giver optimale optiske betingelser for billeddannelse. I den anden del af metoderne beskrives en detaljeret protokol til fremstilling af en specialdesignet plade og opsætning af FiZD-eksperimenter til langsigtet organoid billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pasning og anvendelse af dyr var i overensstemmelse med finsk national lovgivning om anvendelse af laboratoriedyr, den europæiske konvention til beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (ETS 123), og EU-direktiv 86/609/EØF.
1. Fremstilling af minireservoirer til dyrkning af museembryonale nyrer og renale organoider på kylling CAM og opsætning af xenotransplantationsforsøg
- Brug transwell cellekultur skær designet til 6 godt eller 12 godt plader.
BEMÆRK: Afhængigt af det pågældende eksperiment kan der anvendes store eller små minireservoirer. Det er bedst at bruge små minireservoirer til xenografting op til otte embryonale nyrer, eller når flere minireservoirer vil blive placeret på samme kyllingeembryo (f.eks. skal der eksperimenteres og kontrolleres prøver på samme kylling-CAM). - Skær siderne af indsatserne ned ved hjælp af en roterende multiværktøj med en rundsavklinge eller en håndsav for at skabe en 2 mm høj plastring med en gennemtrængelig membran fastgjort til den.
- Puds kanterne af disse minireservoirer med en skalpel eller en skarp kniv.
- Minireservoirerne steriliseres i 70% ethanol i mindst 1 time.
- Vask minireservoirerne i autoclaved dobbeltdestilleret vand og lad dem tørre i en laminar hætte.
- Minireservoirerne skylles i PBS og kulturmediet (DMEM/10% FBS/1% penicillin-streptomycin).
- Beholderen anbringes i en petriskål oven på en dråbe (600 μL/400 μL) dyrkningsmedium med membranen opad.
- Arranger dissekeret ex vivo embryonale nyrer eller renal organoids jævnt på membranen ved hjælp af en pipette eller et glas kapillær rør. Undgå at efterlade en masse væske omkring nyrerne.
- Prøverne fastgøres til membranen i 2-24 timer i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO2.
BEMÆRK: Op til otte E11.5 embryonale musenyrer eller nyreorganoider kan arrangeres på det lille skær. Det store skær anbefales, hvis der enten anvendes større stykker embryonalt væv til xenotransplanteller en cellehydrogelblanding på et større område af CAM. - Tag 8 dage gamle ex ovo dyrkede embryonale kyllinger tilberedt efter tidligere offentliggjorte metoder ud af cellekultur kuvøse12,13.
- Minireservoirerne overføres til CAM'et, så transplantaterne vender mod CAM'et, og membranen overlejrer dem. Placer minireservoirerne i periferien af CAM, så de ikke dækker kyllingembryonet.
BEMÆRK: Når du bruger de mindre minireservoirer fremstillet af transwell skær til 12 brøndplader, kan der placeres op til tre minireservoirer på et CAM. - Der tilsættes 500 μL (6 brøndskær) eller 300 μL (12 brøndskær) kulturmedium til minireservoirerne.
- Prøverne dyrkes på kylling CAM i højst 9 dage. Udskift kulturmediet i minireservoirerne dagligt.
BEMÆRK: Vaskularisering af prøverne kan observeres så snart 24-48 timer efter transplantation.
2. Fremstilling af specialdesignede plader og opsætning af FiZD-kulturer
- Bor huller med en diameter på 20 mm i bunden af en 6 brøndplade.
BEMÆRK: Til FiZD-forsøg anvendes 6 brøndplader med en 16 mm brønddybde (angivet i Materialetabel). - Puds hullernes fælge (især på oversiden) ved hjælp af en elektrisk boremaskine med et kontravaskbor, en skalpel eller en skarp kniv.
- Pladerne steriliseres i 70% ethanol i mindst 1 time.
- Pladerne vaskes i autoclaved dobbeltdestilleret vand, og lad dem tørre under sterile forhold.
- Vask 22 mm x 22 mm glasdækselslips grundigt med 70 % ethanol eller rengør dem i henhold til den offentliggjorte protokol af Saarela et al.11.
- Lim dækseltil oversiden af hullerne i 6 brøndplader ved hjælp af en ugiftig vævslim. Påfør lim omkring hullet og forsigtigt placere dæksel til at dække det. Lad limen tørre.
- Undersøg pladerne under et stereomikroskop, og fjern overskydende tørret lim fra overfladen af dækslips, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Kontroller, at der ikke er lim over dækslen for at sikre jævn komprimering af prøverne. - Bland polystyrenperler (70 μm partikelstørrelse) med et tilsvarende volumen hydrogel. Et volumen på 50-100 μL pr. brønd er tilstrækkeligt.
BEMÆRK: Hold blandingen af hydrogel og polystyren perler på is. - Placer et transwell-skær under et dissekeret mikroskop med membranen op.
- Prøverne (f.eks. ex vivo embryonale nyrer eller renale organoider) arrangeres jævnt på membranen.
- Tilsæt hydrogel/polystyrenperleblandingen ved siden af prøverne omhyggeligt for at undgå skader på skrøbeligt væv.
- Vend transwell-indsatsen, så membranen med prøverne samlet på den vender nedad.
- Placer forsigtigt indsatsen i en brønd af den modificerede 6 brøndplade og tryk den forsigtigt ned, så prøverne komprimeres til perlernes niveau.
BEMÆRK: Følg forløbet af kompressionen ved hjælp af et mikroskop. - Hold indsatsen let presset til brønden med den ene hånd og fastgør den til pladen ved at smelte plast med et loddejern tre punkter i periferien af indsatsen.
- Når indsatsen er fastgjort til pladen, tilsættes 2 ml dyrkningsmedium (DMEM/10% FBS/1% penicillin-streptomycin) til brønden og fortsætte med at samle de resterende brønde i pladen på samme måde.
- Overfør den færdige plade til en inkubator på scenen af et omvendt mikroskop til time-lapse billeddannelse.
- Udfør time-lapse-billeddannelse af prøverne ved hjælp af passende eksperimentelle indstillinger.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at ændre kulturmediet i pladens brønde under tidsforskydningsforsøg, men kan nemt udføres gennem hullerne på siden af indsatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CAM kultur protokol præsenteret her aktiveret meget effektiv vaskularisering af nyre organoider og embryonale nyrer som følge af xenotransplantation på kylling CAM (Figur 1, Movie 1). Minireservoirer indeholdende dyrkningsmedium leverede næringsstoffer til donorvæv og beskyttede det mod tørring i den periode, der gik forud for korrekt vaskularisering. Denne metode gav eftergivende betingelser for donor-afledte endotelceller til at vokse. Derfor var renal vaskulatur i de transplanterede nyrer og organoider hovedsagelig, men ikke udelukkende, repræsenteret af donorspecifikke celler (figur 2B,C,F). Mere moden glomerulær vaskulatur blev opnået i nyrer og renale organoider transplanteret til CAM end i renal organotypic kulturer (Figur 2D,E).
FiZD-protokollen er en metode, der er designet til langtidsterminsscanning af ex vivo embryonale nyrer og nyreorganoider ved hjælp af konfokal mikroskopi med høj opløsning. I den klassiske organotypic kultur protokol designet af Trowell14, en prøve er placeret på et porøst filter, understøttet af et metalgitter, og holdes på luft-væske interface (Figur 3A). Denne metode er ikke optimal, hverken for en opretstående eller omvendt type mikroskop. Den metode, der præsenteres her, er specielt designet til at fungere med et omvendt mikroskop til billeddannelse. Prøven blev immobiliseret mellem en glasdæksel nedefra og en porøs membran af transwell-indsats (se ovenfor) (figur 3B). Den optimale afstand mellem membranen og dækselvar ~ 70 μm. Polystyren perler blev brugt som afstandsstykker til at indstille tykkelsen af prøven i dette område (Figur 3B).
Der er ingen kommercielt tilgængelige 6 brøndplader, hvor glasdækslen er placeret på den øverste overflade af bunden af brønden. Derfor blev der udviklet en protokol til fremstilling af specialdesignede plader, der har denne funktion (Figur 3B). Figur 4 viser den repræsentative morfologi for en embryonal nyrekultur (figur 4A,D–F) og nyreorganoider (figur 4B,C). Movie 2 repræsenterer resultaterne af høj opløsning time-lapse billeddannelse af endotelceller i mus embryonale nyre dyrket i en FiZD setup. Det højre panel i Movie 2 viser, at både distribution og migration af individuelle celler kan observeres ved hjælp af denne metode.
Figur 1: Murine embryonale nyre xenotransplanteret til kylling embryo CAM. Xenotransplantation af E11.5 embryonale musenyrer i 8 dage gamle ex ovo kylling embryo; en murine embryonalnyre blev dyrket i 7 dage på CAM. Skalabar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Film 1: Blodgennemstrømning i murine embryonale nyre efter xenotransplantation til kylling embryo CAM. En murine E11.5 embryonale nyre blev xenotransplanteret til CAM af en 8-dages gammel kylling embryo og dyrket i 7 dage. Filmen viser kylling blodgennemstrømning i xenograft på dag 7. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Figur 2: Murine embryonal nyre xenotransplantation på kylling embryo CAM. Murine E11.5 embryonale nyrer (m) blev dyrket som en organotypisk kultur (dvs. kontrol) eller xenotransplanteret til en 8 dage gammel embryonal kylling CAM (c) (dvs. eksperiment). Efter 5 dages embryonal nyredyrkning blev kontrol- og forsøgsprøverne fikseret og farves for den endotelmærke CD31 (rød) (A-E) og kerner (Hoechst; blå) (D, E). CC) Anastomoses mellem kylling og mus blodkar (pilespidser). (D,E) En enkelt konfokal skive fra midten af nefrron er vist. (F) Xenotransplantation af murine E11.5 embryonalnyre til transgene GFP-kylling CAM i 7 dage, plettet for CD-31 (rød). Skalastænger = A–B 100 μm; C-E 20 μm; F 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fast Z-retningskulturmetode. (A) Traditionel dyrkningsmetode, hvor prøven vokser på en porøs membran, der understøttes af et gitter og holder explanten ved luftvæskegrænsefladen. (B) I den nye FiZD-opsætning blev prøven forsigtigt komprimeret mellem glasdækslen og en transwell porøs membran. Polyesterperler kontrollerede prøvens tykkelse justeret i z-retningen. Dette tal blev ændret fra Saarela et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Embryonale nyrer og nyre organoid udvikling i den nye FiZD kultur metode. Embryonale nyrer (A, D-F) og nyre organoids (B-C) blev dyrket ved hjælp af den nye FiZD setup. (A) Brightfield billede af en intakt embryonale mus nyre på dag 7 i FiZD kultur. (B)Brightfield billede af en mus nyre organoid på dag 7 i FiZD kultur. (C) MtmG (rød) mus nyre organoid blev dyrket i 4 dage ved hjælp af den nye FiZD setup. Øjebliksbilledeaf timelapse-billedstakken viser Wnt4Cre-aktiveretGFP-udtryk (grøn) i de udviklende nefroner. (D) Mus embryonale nyre blev dyrket i 7 dage ved hjælp af den nye FiZD setup. Six2 (grøn) og Troma-1 (Krt8, rød) farvning viste nefron prækursorer og ureteric bud (UB) bifurcations, henholdsvis. (E) Mus embryonale nyre rudiment blev dyrket i 12 dage ved hjælp af den nye FiZD setup. Det blev plettet med Troma-1 (rød) og Nephrin (grøn), og viste UB bifurcations og podocytter, henholdsvis. (F) Den samme prøve som i (E) med højeffektforstørrelse af Troma-1+ (rød) UB og Nephrin (grøn) + podocytter. Dette tal blev ændret fra Saarela et al.11. Skalastænger = A-D, F 100 μm; E 1.000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 2: Renalendotelceller mærket med GFP vokser i den nye FiZD-opsætning og kan observeres med konfokal mikroskopi med høj opløsning. Embryonale nyrer fra E11.5 mTmG; Tie1Cre mus blev dissekeret og vokset 6 dage ved hjælp af den nye FiZD setup. Filmen viser Tie1Cre-induceretGFP udtryk i endotelceller. En stak på 20 z-lag blev taget ved hjælp af en 10x/0.45 mål, med billeder opnået hver 15 min. I filmen, fem GFP z-lag og en lys felt brændplan er fusioneret. Panelet til højre viser et nærbillede af en nyre under udvikling. Endotelceller, der migrerer ind i den vaskulære kløft af S-form fase nephrons kan ses. I panelet til højre flettes GFP z-lag og et lyst feltfokusplan. De hurtigt bevægende celler er sandsynligvis makrofager15. GFP signal blev også udtrykt af nogle blodlegemer. Voxel størrelse 0,69 μm x 0,69 μm x 4,13 μm. Denne film er blevet ændret fra Saarela et al.11. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To detaljerede protokoller præsenteres, der forfine den klassiske renal organotypic kultur metode, og muliggøre vaskularisering, udvidet udvikling, og optimal 4D (dvs. 3D-billede og tid) billeddannelse af ex vivo embryonale nyrer og organoider. I dette afsnit fremhæves de kritiske trin i metoderne, og fejlfinding beskrives.
Den betydelige forskel mellem andre CAM kultur metoder og denne forbedrede kylling CAM kultur metode er brugen af skræddersyede minireservoirer i xenografting af embryonale nyrer og nyre organoids til CAM. Membranbunden på det modificerede transwell-skær presser prøverne mod kyllingen CAM og holder dem på plads. Siderne af indsatsen tjener som et reservoir for dyrkningsmedium, der beskytter transplantatet mod tørring. Xenografting til ex ovo dyrkede embryonale kylling CAM anbefales kraftigt, da denne metode udsætter et større område af CAM, hvor minireservoiret kan placeres og gør det nemt visuelt at følge vaskularisering proces12,13.
En ulempe ved kylling CAM kultur metode er, at tidsvinduet for udførelse af xenotransplantation er begrænset til 8-9 dage, hvor CAM af kylling embryo funktioner, før det begynder at nedbryde. Transplantater, der har behov for længere tid til at udvikle sig, bør derfor vaskulariseres ved xenotransplantation til et andet væv (f.eks. musenyrekapsel)6. Seriel xenotransplantation af donorvæv kan være en løsning på denne lange inkubationstid problem. Metoden kunne tilpasses til time-lapse billeddannelse af vaskularisering og udvikling af transplantatet, men først kravet om stabilisering af minireservoiret og CAM til langtidsscanning skal behandles. Den største fordel ved denne forbedrede nyrexenotransplantation protokol til kylling CAM er, at metoden giver betingelser for donor-afledte endotelceller til at trives.
FiZD-protokollen beskriver en metode, der er beregnet til langtidsterminsscanning af ex vivo embryonale nyrer og nyreorganoider ved hjælp af konfokal mikroskopi med høj opløsning. For opsætningen er det afgørende, at dimensionerne af brønden og indsætte match. Når en dæksel er limet til bunden af en 6 brøndplade, og indsatsen placeres på brønden, skal indsatsens membran røre glasset. Derefter, når kulturen er sat op, vil afstandsstykkerne bestemme placeringen af membranen og dermed tykkelsen af det dyrkede organ eller organoid. Derfor er det vigtigt at fjerne den overskydende lim og kontrollere, at intet materiale begrænser indsatsen i at røre dækglasset. Det er også vigtigt at bruge utoksisk vævlim til at fastgøre dækglasset. Bemærk, at limen ikke sidder særlig stærkt fast, så det er vigtigt at håndtere pladerne omhyggeligt. Pladerne kan genbruges, og hvis dækglasset løsner sig under vasketrin, kan det limes på igen.
FiZD-billeddannelsesmetoden gør det muligt at studere nephrogenesis på et enkeltcelleniveau. Den høje kvalitet af høj opløsning time-lapse billeder giver mulighed for anvendelse af automatiseret celle segmentering at studere cellulære adfærd i nyre organoids og nyre kulturer. Flere prøver placeret i forskellige brønde af en 6 brøndplade kan studeres samtidigt under forskellige dyrkningsforhold. Teknikken kan let ændres til forskellige størrelser og typer af væv og organoider ved at ændre størrelsen af afstandsperlerne; dette blev påvist med ovariecellekulturer14. Som en yderligere optimering af denne metode, kombinere FiZD setup med nyligt offentliggjorte mikrofluidiske tilgange16 kan være meget gavnligt for høj opløsning mikroskopisk analyse af cellulære morfogenese på senere stadier af nyre udvikling.
En fordel ved FiZD-metoden er, at der er masser af kulturmedium til rådighed, og det er ikke nødvendigt at ændre det i løbet af 1 uge af billeddannelse. Men hvis der er behov for en medieændring, kan mediet nemt ændres fra en åbning i skærens væg. FiZD-metoden er også bedre end andre organkulturmetoder, idet den bringer prøven tættere på mikroskopmålet. I andre udbredte dyrkningsmetoder er der en membran eller filter og en glasplade bund mellem den afbildede prøve og målet, der forbyder nøjagtig høj opløsning billeddannelse17. Med FiZD-metoden er det muligt at erhverve billeder i høj opløsning af levende væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet økonomisk af Suomen Akatemia (Finlands Akademi) (206038, 121647, 250900, 260056; Ekspertisecentertilskud 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Finsk Nyre- og Leverforening, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Den Svenske Kulturfond i Finland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Finlands Kræftselskab), Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013; tilskud FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) og H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network "RENALTRACT" Projekt ID 642937. Forfatterne takker Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias og Hannele Härkman for teknisk bistand.
Figur 3, 4 og Movie 2 genoptrykkes med tilladelse fra Udvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
