Summary
Diese Arbeit beschreibt zwei Methoden zur Untersuchung der Organentwicklung, eine verbesserte Xenotransplantation auf chorioallantoischer Membran (CAM) aus Aviären Embryonen, die eine Vaskularisation kultivierter embryonaler Organe und Organoide ermöglicht, und eine neuartige feste Z-Richtung. Organkulturmethode mit modifizierten experimentellen Bedingungen, die eine hochauflösende Zeitraffer-Konfokalbildgebung ermöglicht.
Abstract
Embryonale Nierenorganotypische Kulturen, insbesondere pluripotente Stammzell-abgeleitete Nierenorganoide, sind ausgezeichnete Werkzeuge, um Entwicklungsprozesse zu verfolgen und Nierenerkrankungen zu modellieren. Die Modelle sind jedoch durch einen Mangel an Vaskularisation und Funktionalität eingeschränkt. Um diesem Problem zu begegnen, wurde ein verbessertes Protokoll für die Methode der Xenogtransplantation von Zellen und Geweben an die chorioallantoische Membran (CAM) eines Aviären Embryos entwickelt, um Vaskularisation und Wiederherstellung des Blutflusses zu erhalten. Die Transplantate sind mit maßgeschneiderten Minireservoirs überzogen, die die Proben am CAM fixieren und mit einem Kulturmedium versorgen, das die Transplantate vor dem Trocknen schützt. Die verbesserte Kulturmethode ermöglicht xenografts bis zu 9 Tage lang zu wachsen. Das Manuskript beschreibt auch, wie optimale Bedingungen für die langfristige konfokale Bildgebung von Renalorganoiden und organotypischen Kulturen mit der zuvor veröffentlichten Fixed Z-Direction (FiZD)-Methode zur Verfügung gestellt werden können. Diese Methode komprimiert sanft ein embryonales Organ oder Organoid zwischen einem Glasdeckel und einer Membran in einer großen Menge an Medium und bietet hervorragende Bedingungen für die Bildgebung für bis zu 12 Tage. Zusammen ermöglichen diese Methoden Vaskularisation und Blutfluss zu Nierenorganoiden und organotypischen Nierenkulturen mit verbesserter konfokaler Bildgebung. Die hier beschriebenen Methoden sind sehr vorteilhaft für die Untersuchung grundlegender und angewandter Funktionen der Nieren ex vivo. Beide Methoden sind auf verschiedene Arten von Geweben und Organoiden anwendbar.
Introduction
Organotypische Kultur der embryonalen Nieren wurde ein wichtiges Modell zur Studie Nephrogenese vor Jahrzehnten1,2,3. Nierenorganoide stellen ein fortschrittliches Modellsystem zur Untersuchung der Entwicklung gesunder und kranker Nierendar 4. Der Hauptnachteil für beide Methoden ist jedoch, dass keine der beiden Methoden die Hauptfunktion der Niere rekapituliert: Blutfiltration. Nephronen und Renalvaskulatur entwickeln sich in Renalorganoiden und organotypischen Kulturen ähnlich wie im frühen Stadium der In-vivo-Entwicklung; die in vitro gebildeten Glomeruli bleiben jedoch avaskulär5. Die Vaskularisation von ex vivo embryonalen Nieren und Nierenorganoiden wurde zuvor in Transplantationsexperimenten nur unter in vivo-Bedingungen nachgewiesen. Zum Beispiel ermöglicht die Transplantation von menschlichen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Nierenorganoiden unter einer Mausnierenkapsel die Entwicklung der Nephone im Organoid zu einem funktionellen Stadium6.
Ein Zwischenansatz zwischen reinen In-vitro-Kulturen und In-vivo-Transplantationsmethoden ist die Xenotransplantation in das CAM von Vogelembryonen. Die Vaskularisation der intakten Mausnierenprimordie wurde zuvor mit diesem System7,8demonstriert. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass die Renalvaskulatur in der xenotransplantierten murinen Niere vom Wirtenendothel und nicht vom Transplantat9abgeleitet wurde. Diese Beobachtung reduzierte signifikant das Potenzial von chimären (avian-mammalian) Modellen der embryonalen Niere, die Entwicklung der Nierenvaskulatur zu untersuchen, da die experimentellen Bedingungen für das Überleben von spenderabgeleiteten Endothelzellen nicht freizügig waren.
Im ersten Teil dieses Protokolls wird eine verbesserte Methode für die Kultivierung von Maus-Embryonalnieren auf CAM von Aviären Eiern vorgestellt, die mikroökologische Bedingungen der organotypischen Kultur und Xenotransplantation kombiniert. Die wichtigste Verbesserung gegenüber früheren Methoden ist, dass statt der Maus embryonale Nieren und Nierenorganoide direkt auf dem CAM, der Implantationsbereich mit durchlässigen Minireservoirs gefüllt mit Kulturmedium, die das transplantierte Gewebe liefern überlagert werden mit Nährstoffen und schützen Sie sie vor dem Trocknen. Die Erfolgsrate der Experimente steigt deutlich an und die Bedingungen für die Entwicklung der von Spendern abgeleiteten Vaskulatur verbessern sich. Die Anwendung dieser Methode auf Xenotransplant-Kulturen führt zur Entwicklung einer glomerulären Vaskulatur, die aus endogenen Endothelzellen aus Spendernieren besteht.
Die detaillierte Analyse der zellulären Morphogenese ist eine weitere wichtige Anwendung von Nierenkulturmodellen. Zuvor berichtete Methoden der Zeitraffer-Bildaufnahme von Nierenkulturen reichen nur für die Analyse der Gesamtmorphologie und DerMusterung der embryonalen Niere aus, nicht aber für die Verfolgung einzelner Zellen10. Kürzlich wurde eine neuartige Fixed Z-Direction (FiZD) Methode beschrieben, die auf eine hochauflösende konfokale 3D-Zeitraffer-Bildgebung von Renalorganoiden und organotypischen Kulturen abzielte11. Bei diesem Verfahren werden die Organoide und embryonalen Organe sanft zwischen einem Glasdeckel und einer durchlässigen Membran eines Transwell-Einsatzes in einer kundenspezifischen Platte zusammengedrückt, bis die Dicke der Probe 70 m erreicht, was optimale optische Bedingungen für die Bildgebung bietet. Im zweiten Teil der Methoden wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung einer kundenspezifischen Platte und zur Einrichtung von FiZD-Experimenten für die langfristige organoide Bildgebung beschrieben.
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Protocol
Die Tierpflege und -verfahren entsprachen den finnischen rechtsvorschriften Vorschriften für die Verwendung von Labortieren, dem Europäischen Übereinkommen zum Schutz von Wirbeltieren, die für versuchs- und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden (ETS 123), und der EU-Richtlinie 86/609/EWG.
1. Herstellung von Minireservoirs für die Kultivierung von mausembryonalen Nieren und Nierenorganoiden auf Hühner-CAM und Einrichtung von Xenotransplantationsexperimenten
- Verwenden Sie Transwell-Zellkultureinsätze für 6 Well- oder 12-Well-Platten.
HINWEIS: Je nach Experiment können große oder kleine Minireservoirs verwendet werden. Es ist am besten, kleine Minireservoirs für Xenografting bis zu acht embryonale Nieren oder wenn mehrere Minireservoirs auf demselben Hühnerembryon platziert werden (z. B. Experimentier- und Kontrollproben an demselben Hühner-CAM) zu verwenden. - Schneiden Sie die Seiten der Einsätze mit einem Rotierenden Multitool mit einem Kreissägeblatt oder einer Handsäge ab, um einen 2 mm hohen Kunststoffring mit einer durchlässigen Membran zu erzeugen.
- Polieren Sie die Ränder dieser Minireservoirs mit einem Skalpell oder einem scharfen Messer.
- Sterilisieren Sie die Minireservoirs in 70% Ethanol für mindestens 1 h.
- Waschen Sie die Minireservoirs in autoklaviertem doppelt destilliertem Wasser und lassen Sie sie in einer laminaren Haube trocknen.
- Spülen Sie die Minireservoirs in PBS und Kulturmedium (hochglucoseiert DMEM/10% FBS/1% Penicillin-Streptomycin).
- Legen Sie das Reservoir in eine Petrischale, auf einem Tropfen (600 l/400 l) Kulturmedium mit der Membran nach oben.
- Mit Hilfe einer Pipette oder eines Glaskapillarrohrs sezierte ex vivo embryonale Nieren oder Renalorganoide gleichmäßig auf der Membran anordnen. Vermeiden Sie es, viel Flüssigkeit um die Nieren zu lassen.
- Lassen Sie die Proben für 2–24 h in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2an der Membran befestigen.
HINWEIS: Bis zu acht E11.5 embryonale Mausnieren oder Nierenorganoide können auf dem kleinen Einsatz angeordnet werden. Der große Einsatz wird empfohlen, wenn entweder größere Stücke embryonalen Gewebes für Xenotransplantat oder ein Zell-Hydrogel-Gemisch auf einer größeren Fläche des CAM verwendet werden. - Nehmen Sie 8 Tage alte ex ovo kultivierte embryonale Hühner, die nach zuvor veröffentlichten Methoden aus dem Zellkultur-Inkubator12,13hergestellt wurden.
- Übertragen Sie die Minireservoirs auf das CAM, so dass die Transplantate dem CAM zugewandt sind und die Membran sie überlagert. Legen Sie die Minireservoirs in die Peripherie des CAM, damit sie den Hühnerembryon nicht abdecken.
HINWEIS: Bei Verwendung der kleineren Minireservoirs, die aus Transwell-Einsätzen für 12 Well-Platten hergestellt werden, können bis zu drei Minireservoirs auf einem CAM platziert werden. - Fügen Sie den Minireservoirs 500 l (6 Well Insert) oder 300 l (12 Well insert) des Kulturmediums hinzu.
- Kultivieren Sie die Proben auf Huhn CAM für maximal 9 Tage. Ersetzen Sie das Kulturmedium in den Minireservoirs täglich.
HINWEIS: Die Vaskularisation der Proben kann bereits nach 24–48 h nach der Transplantation beobachtet werden.
2. Herstellung von kundenspezifischen Platten und Einrichten von FiZD-Kulturen
- Bohren Sie Löcher mit 20 mm Durchmesser in den Boden einer 6-Well-Platte.
HINWEIS: Für FiZD-Experimente verwenden Sie 6 Wellplatten mit einer Welltiefe von 16 mm (siehe Materialtabelle). - Polieren Sie die Felgen der Löcher (vor allem auf der Oberseite) mit einem elektrischen Bohrer mit einem Senkmittelbohrer, einem Skalpell oder einem scharfen Messer.
- Sterilisieren Sie die Platten in 70% Ethanol für mindestens 1 h.
- Waschen Sie die Platten in autoklaviertem doppeldestilliertem Wasser und lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen trocknen.
- 22 mm x 22 mm Glasabdeckungen mit 70% Ethanol gründlich waschen oder nach dem veröffentlichten Protokoll von Saarela et al.11reinigen.
- Kleben Sie die Abdeckungen an der Oberseite der Löcher in 6 Brunnenplatten mit einem ungiftigen Gewebekleber. Tragen Sie Kleber um das Loch auf und legen Sie den Deckel vorsichtig auf, um es zu bedecken. Lassen Sie den Kleber trocknen.
- Prüfen Sie die Platten unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie bei Bedarf überschüssigen getrockneten Kleber von der Oberfläche der Abdeckungen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich kein Kleber über dem Deckelbeleg befindet, um eine gleichmäßige Kompression der Proben zu gewährleisten. - Mischen Sie Polystyrolperlen (70 m Partikelgröße) mit einem gleichen Hydrogelvolumen. Ein Volumen von 50–100 l pro Brunnen ist ausreichend.
HINWEIS: Halten Sie die Mischung aus Hydrogel und Polystyrol perlen auf Eis. - Legen Sie einen Transwell-Einsatz unter ein Sezierendes Mikroskop mit der Membran nach oben.
- Ordnen Sie die Proben (z. B. ex vivo embryonale Nieren oder Renalorganoide) gleichmäßig auf der Membran an.
- Fügen Sie das Hydrogel/Polystyrol-Perlengemisch neben den Proben sorgfältig hinzu, um Schäden an empfindlichen Geweben zu vermeiden.
- Drehen Sie den Transwell-Einsatz so um, dass die Membran mit den darauf montierten Proben nach unten gerichtet ist.
- Legen Sie den Einsatz vorsichtig in einen Brunnen der modifizierten 6 Well-Platte und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, so dass die Proben auf das Niveau der Perlen komprimiert werden.
HINWEIS: Verfolgen Sie den Fortschritt der Kompression mit einem Mikroskop. - Halten Sie den Einsatz mit einer Hand leicht auf den Brunnen gedrückt und fixieren Sie ihn an der Platte, indem Sie Kunststoff mit einem Lötkolben an drei Stellen am Rand des Einsatzes schmelzen.
- Wenn der Einsatz an der Platte befestigt ist, fügen Sie 2 ml Kulturmedium (DMEM/10% FBS/1% Penicillin-Streptomycin) in den Brunnen und setzen Sie die Montage der verbleibenden Brunnen in der Platte auf die gleiche Weise fort.
- Übertragen Sie die fertige Platte auf einen inder Inkubator eines invertierten Mikroskops für die Zeitraffer-Bildgebung.
- Führen Sie die Zeitraffer-Bildgebung der Proben mit den entsprechenden experimentellen Einstellungen durch.
HINWEIS: Eine Änderung des Kulturmediums in den Blechen während Zeitrafferexperimenten ist nicht erforderlich, kann aber leicht durch die Löcher an den Seiten des Einsatzes durchgeführt werden.
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Representative Results
Das hier vorgestellte CAM-Kulturprotokoll ermöglichte eine hocheffiziente Vaskularisation von Nierenorganoiden und embryonalen Nieren als Folge einer Xenotransplantation am Hühner-CAM (Abbildung 1, Film 1). Minireservoirs, die Kulturmedium enthalten, versorgten das Spendergewebe mit Nährstoffen und schützten es während des Zeitraums vor der eigentlichen Vaskularisation vor dem Trocknen. Diese Methode bot freizügige Bedingungen für Spender-abgeleitete Endothelzellen zu wachsen. Daher wurde die Renalvaskulatur in den transplantierten Nieren und Organoiden meist, wenn auch nicht ausschließlich, durch spenderspezifische Zellen dargestellt (Abbildung 2B,C,F). In Nieren und Nierenorganoiden, die in CAM transplantiert wurden, wurde eine reifere glomeruläre Vaskulatur gewonnen als in organotypischen Nierenkulturen (Abbildung 2D,E).
Das FiZD-Protokoll ist eine Methode zur Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung von ex vivo embryonalen Nieren und Nierenorganoiden mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie. Im klassischen organotypischen Kulturprotokoll von Trowell14wird eine Probe auf einen porösen Filter gelegt, von einem Metallgitter gestützt und an der Luft-Flüssig-Schnittstelle aufbewahrt (Abbildung 3A). Diese Methode ist weder für ein aufrechtes noch für invertiertes Mikroskop optimal. Die hier vorgestellte Methode wurde speziell für die Funktion mit einem invertierten Mikroskop für die Bildgebung entwickelt. Die Probe wurde zwischen einem Glasdeckel von unten und einer porösen Membran aus Transwell-Einsatz (siehe oben)(Abbildung 3B) immobilisiert. Der optimale Abstand zwischen der Membran und dem Abdeckschlupf betrug 70 m. Polystyrolperlen wurden als Abstandshalter verwendet, um die Dicke der Probe in diesem Bereich einzustellen (Abbildung 3B).
Es gibt keine handelsüblichen 6 Brunnenplatten, bei denen sich der Glasdeckel an der Oberseite des Brunnenbodens befindet. Daher wurde ein Protokoll für die Herstellung von kundenspezifischen Platten entwickelt, die diese Funktion aufweisen (Abbildung 3B). Abbildung 4 zeigt die repräsentative Morphologie einer embryonalen Nierenkultur (Abbildung 4A,D–F) und Nierenorganoide (Abbildung 4B,C). Film 2 stellt die Ergebnisse einer hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Endothelzellen in der embryonalen Niere der Maus dar, die in einem FiZD-Setup kultiviert wurden. Das rechte Fenster in Film 2 zeigt, dass sowohl die Verteilung als auch die Migration einzelner Zellen mit dieser Methode beobachtet werden können.
Abbildung 1: Murine embryonale Niere xenotransplantiert an den Hühnerembryon CAM. Xenotransplantation von E11.5 embryonalen Mausnieren in 8 Tage alten ex ovo Hühnerembryon; eine murine embryonale Niere wurde 7 Tage lang auf CAM kultiviert. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 1: Blutfluss in muriner embryonaler Niere nach Xenotransplantation zum Hühnerembryon CAM. Eine murine E11.5 embryonale Niere wurde in das CAM eines 8 Tage alten Hühnerembryons xenotransplantiert und für 7 Tage kultiviert. Der Film zeigt den Blutfluss von Hühnern im Xenograft an Tag 7. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Abbildung 2: Murine embryonale Nieren-Xenotransplantation am Hühnerembryon CAM. Murine E11.5 embryonale Nieren (m) wurden als organotypische Kultur (d.h. Kontrolle) kultiviert oder zu einem 8 Tage alten embryonalen Huhn CAM (c) (d.h. Experiment) xenotransplantiert. Nach 5 Tagen embryonaler Nierenkultivierung wurden die Kontroll- und Versuchsproben für den Endothelmarker CD31 (rot) (A-E) und Die Kerne (Hoechst; blau) (D, E) fixiert und gebeizt. (C) Anastomosen zwischen Hühner- und Mausblutgefäßen (Pfeilspitzen). (D,E) Eine einzelne konfokale Scheibe aus der Mitte des Nephrons wird gezeigt. (F) Xenotransplantation der murinen E11.5 embryonalen Niere in transgenen GFP-Huhn CAM für 7 Tage, gefärbt für CD-31 (rot). Skalenstäbe = A–B 100 m; C-E 20 m; F 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Feste Z-Richtungskulturmethode. (A) Traditionelle Kulturmethode, bei der die Probe auf einer porösen Membran wächst, die von einem Gitter gestützt wird und das Explant an der Luft-Flüssig-Schnittstelle hält. (B) Im neuen FiZD-Setup wurde die Probe vorsichtig zwischen dem Glasdeckel und einer transwell porösen Membran komprimiert. Polyesterperlen kontrollierten die Dicke der Infilz-Anpassung der Probe. Diese Zahl wurde von Saarela et al.11geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Embryonale Nieren und Nierenorganoidentwicklung in der neuen FiZD-Kulturmethode. Embryonale Nieren (A, D-F) und Nierenorganoide (B-C) wurden mit dem neuen FiZD-Setup kultiviert. (A) Hellfeldbild einer intakten embryonalen Mausniere am 7. Tag der FiZD-Kultur. (B) Hellfeldbild eines Mausnierenorganoids am 7. Tag der FiZD-Kultur. (C) MtmG (rot) Maus Nierenorganoid wurde für 4 Tage mit dem neuen FiZD-Setup kultiviert. Snapshot des Zeitraffer-Image-Stacks zeigt Wnt4Cre-aktivierte GFP-Expression (grün) in den sich entwickelnden Nephronen. (D) Maus embryonale Niere wurde für 7 Tage mit dem neuen FiZD-Setup kultiviert. Six2 (grün) und Troma-1 (Krt8, rot) Färbung zeigten Nephron-Vorläufer und Harnröhrenknospen (UB) Bifurkationen. (E) Maus embryonale Nierenrudiment wurde für 12 Tage mit dem neuen FiZD-Setup kultiviert. Es war mit Troma-1 (rot) und Nephrin (grün) gefärbt und zeigte UB Bifurkationen bzw. Podozyten. (F) Die gleiche Probe wie in (E) mit Hochleistungsvergrößerung von Troma-1+ (rot) UB und nephrin (grün) + Podozyten. Diese Zahl wurde von Saarela et al.11geändert. Skalenbalken = A-D, F 100 m; E 1.000 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 2: Renale Endothelzellen, die mit GFP gekennzeichnet sind, wachsen im neuen FiZD-Setup und können mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie beobachtet werden. Embryonale Nieren von E11.5 mTmG; Tie1Cre Mäuse wurden seziert und gewachsen 6 Tage mit dem neuen FiZD-Setup. Der Film zeigt Tie1Cre-induzierteGFP-Expression in Endothelzellen. Ein Stapel von 20 Z-Schichten wurde mit einem 10x/0.45 Objektiv aufgenommen, wobei alle 15 min Bilder aufgenommen wurden. Im Film werden fünf GFP-Z-Schichten und eine helle Feldfokusebene zusammengeführt. Das Panel rechts zeigt eine Nahaufnahme einer sich entwickelnden Niere. Endothelzellen, die in den Gefäßspalten von S-förmigen Nephronen wandern, sind zu sehen. Im Panel rechts werden GFP-Z-Layer und eine helle Feldfokusebene zusammengeführt. Die sich schnell bewegenden Zellen sind wahrscheinlich Makrophagen15. GfP-Signal wurde auch von einigen Blutzellen ausgedrückt. Voxel-Größe 0,69 x 0,69 x 4,13 m. Dieser Film wurde von Saarela et al.11modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Es werden zwei detaillierte Protokolle vorgestellt, die die klassische renale organotypische Kulturmethode verfeinern und Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und optimale 4D-Bild- und Zeitbildgebung von ex vivo embryonalen Nieren und Organoiden ermöglichen. In diesem Abschnitt werden die wichtigen Schritte in den Methoden erläutert und die Fehlerbehebung erläutert.
Der signifikante Unterschied zwischen anderen CAM-Kulturmethoden und dieser verbesserten Hühner-CAM-Kulturmethode ist die Verwendung von maßgeschneiderten Minireservoirs bei der Xenogierung embryonaler Nieren und Nierenorganoide auf das CAM. Der Membranboden des modifizierten Transwell-Einsatzes drückt die Proben gegen das Huhn CAM und hält sie an Ort und Stelle. Die Seiten des Einsatzes dienen als Reservoir für Kulturmedium, das das Transplantat vor dem Trocknen schützt. Xenografting zu ex ovo kultivierten embryonalen Huhn CAM wird dringend empfohlen, da diese Methode eine größere Fläche des CAM freilegt, wo das Minireservoir platziert werden kann und macht es einfach, visuell den Vaskularisationsprozess zu folgen12,13.
Ein Nachteil der Chicken CAM-Kulturmethode ist, dass das Zeitfenster für die Durchführung der Xenotransplantation auf die 8-9 Tage begrenzt ist, an denen das CAM des Hühnerembryons funktioniert, bevor es zu abbauen beginnt. Transplantate, die eine längere Entwicklungszeit benötigen, sollten daher durch Xenotransplantation in ein anderes Gewebe (z.B. Mausnierenkapsel)6vaskularisiert werden. Serielle Xenotransplantation von Spendergewebe könnte eine Lösung für dieses lange Inkubationszeitproblem sein. Die Methode könnte für die Zeitraffer-Bildgebung der Vaskularisation und Entwicklung des Transplantats angepasst werden, aber zunächst muss die Anforderung an die Stabilisierung des Minireservoirs und des CAM für die Langzeitbildgebung angegangen werden. Der Hauptvorteil dieses verbesserten Nieren-Xenotransplantationsprotokolls für Hühner-CAM ist, dass die Methode Bedingungen für spenderabgeleitete Endothelzellen bietet, um zu gedeihen.
Das FiZD-Protokoll beschreibt eine Methode zur Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung von ex vivo embryonalen Nieren und Nierenorganoiden mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie. Für das Setup ist es wichtig, dass die Abmessungen des Brunnens und des Einfügens übereinstimmen. Wenn ein Deckelschlupf an die Unterseite einer 6-Well-Platte geklebt wird und der Einsatz auf den Brunnen gelegt wird, sollte die Membran des Einsatzes das Glas berühren. Dann, wenn die Kultur eingerichtet ist, bestimmen die Spacer-Perlen die Position der Membran und damit die Dicke des kultivierten Organs oder Organoids. Aus diesem Grund ist es wichtig, den überschüssigen Kleber zu entfernen und zu überprüfen, ob kein Material den Einsatz daran hindert, das Deckglas zu berühren. Es ist auch wichtig, ungiftigen Gewebekleber zu verwenden, um das Deckglas zu befestigen. Bitte beachten Sie, dass der Kleber nicht sehr stark befestigt, so ist es wichtig, die Platten sorgfältig zu behandeln. Die Platten können wiederverwendet werden, und wenn sich das Deckglas während der Waschschritte löst, kann es wieder aufgeklebt werden.
Die FiZD-Bildgebungsmethode ermöglicht die Untersuchung der Nephrogenese auf einzelliger Ebene. Die hohe Qualität von hochauflösenden Zeitrafferbildern ermöglicht die Anwendung einer automatisierten Zellsegmentierung zur Untersuchung des zellulären Verhaltens in Nierenorganoiden und Nierenkulturen. Mehrere Proben in verschiedenen Brunnen einer 6-Well-Platte können gleichzeitig unter verschiedenen Kulturbedingungen untersucht werden. Die Technik kann leicht für verschiedene Größen und Arten von Gewebe und Organoiden durch Änderung der Größe der Spacer-Perlen geändert werden; Dies wurde mit Eierstockzellkulturen demonstriert14. Als weitere Optimierung dieser Methode könnte die Kombination des FiZD-Setups mit kürzlich veröffentlichten mikrofluidischen Ansätzen16 für die hochauflösende mikroskopische Analyse der zellulären Morphogenese in späteren Stadien der Nierenentwicklung von großem Nutzen sein.
Ein Vorteil der FiZD-Methode ist, dass es viel Kulturmedium zur Verfügung gibt und es nicht notwendig ist, es während der 1 Woche der Bildgebung zu ändern. Wenn jedoch ein Medienwechsel erforderlich ist, kann das Medium leicht von einer Öffnung in der Wand des Einsatzes gewechselt werden. Die FiZD-Methode ist auch anderen Organkulturmethoden überlegen, da sie die Probe dem Mikroskopobjektiv näher bringt. In anderen weit verbreiteten Kulturmethoden gibt es eine Membran oder einen Filter und einen Glasplattenboden zwischen der abgebildeten Probe und dem Objektiv, was eine genaue hochauflösende Bildgebung17verbietet. Mit der FiZD-Methode ist es möglich, hochauflösende Bilder von lebenden Geweben zu erfassen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Suomen Akatemia (Akademie Finnlands) (206038, 121647, 250900, 260056) finanziell unterstützt; Centre of Excellence Grant 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Finnischer Nieren- und Leberverein, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Schwedische Kulturstiftung in Finnland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Krebsgesellschaft Finnlands), das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (RP7/2007-2013; Stipendium FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) und H2020 Marie Sklodowska-Curie Innovative Actions Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937. Die Autoren danken Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias und Hannele Härkman für die technische Unterstützung.
Die Abbildungen 3, 4 und Movie 2 werden mit Genehmigung von Developmentnachgedruckt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
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