Summary
Questo lavoro descrive due metodi per studiare lo sviluppo degli organi, una migliore impostazione dello xenotrapianto sulla membrana corioallantoica (CAM) dagli embrioni aviari che consente la vascolarizzazione di organi embrionali e organoidi coltivati e una nuova direzione z fissa metodo di coltura dell'organo con condizioni sperimentali modificate che consente l'imaging confocale time-lapse ad alta risoluzione.
Abstract
Le colture organotiche renali embrionali, e in particolare gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti, sono strumenti eccellenti per seguire i processi di sviluppo e modellare la malattia renale. Tuttavia, i modelli sono limitati dalla mancanza di vascolarizzazione e funzionalità. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un protocollo migliorato per il metodo di xenotrapianto di cellule e tessuti alla membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario per ottenere la vascolarizzazione e il ripristino del flusso sanguigno. Gli innesti sono sovrapposti a minicarri su misura che fissano i campioni al CAM e forniscono loro un mezzo di coltura che protegge gli innesti dall'essiccazione. Il metodo di coltura migliorato consente agli xenograforti di crescere fino a 9 giorni. Il manoscritto descrive anche come fornire condizioni ottimali per l'imaging confocale a lungo termine di organoidi renali e colture organotipiche utilizzando il metodo di direzione fissa (Fi-D) pubblicato in precedenza. Questo metodo comprime delicatamente un organo embrionale o organoide tra un coperchio di vetro e la membrana in una grande quantità di mezzo e fornisce ottime condizioni per l'imaging per un massimo di 12 giorni. Insieme, questi metodi consentono la vascolarizzazione e il flusso sanguigno agli organoidi renali e alle colture renali organotipiche con una migliore imaging confocale. I metodi qui descritti sono molto utili per studiare le funzioni fondamentali e applicate dei reni ex vivo. Entrambi i metodi sono applicabili a vari tipi di tessuti e organoidi.
Introduction
La coltura organotipica dei reni embrionali è diventata un modello importante per studiare la nefrogenesi decenni fa1,2,3. Gli organoidi renali rappresentano un sistema modello avanzato per studiare lo sviluppo di reni sani e malati4. Lo svantaggio principale per entrambi i metodi, tuttavia, è che nessuno dei due metodi riassume la funzione principale del rene: la filtrazione del sangue. Nefrosci e vascolatura renale si sviluppano in organoidi renali e culture organotipiche in modo simile alla fase iniziale nello sviluppo vivo; tuttavia, i glomeruli formati in vitro rimangono avascolari5. La vascolarizzazione dei reni embrionali e degli organoidi renali ex vivo è stata precedentemente dimostrata negli esperimenti di trapianto solo in condizioni di vivo. Ad esempio, il trapianto di organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti umane sotto una capsula renale di topo consente lo sviluppo dei nefrodi nell'organoid e uno stadio funzionale6.
Un approccio intermedio tra le colture puramente in vitro e i metodi di trapianto in vivo è lo xenotrapianto alla CAM degli embrioni aviari. La vascolarizzazione della primardia renale di topo intatta è stata dimostrata in precedenza utilizzando questo sistema7,8. Tuttavia, è stato anche dimostrato che la vascolatura renale nel rene murino xenotrapiantato è stata derivata dall'endotelio ospite, non l'innesto9. Questa osservazione ha ridotto significativamente il potenziale dei modelli chimerici (aviari-mammiferi) del rene embrionale per studiare lo sviluppo della vascolatura renale, perché le condizioni sperimentali non erano permissive per la sopravvivenza delle cellule endoteliali derivate dai donatori.
Presentato nella prima parte di questo protocollo è un metodo migliorato per la coltivazione di reni embrionali di topo sul CAM di uova aviarie, combinando condizioni microambientali di coltura organotipica e xenotrapianto. Il principale miglioramento dei metodi precedenti è che invece di posizionare i reni embrionali del topo e gli organoidi renali direttamente sul CAM, l'area di impianto è sovrapposta a miniserbatoi permeabili pieni di mezzo di coltura che forniscono il tessuto trapiantato che fornisce il tessuto trapiantato con sostanze nutritive e proteggerlo dall'essiccazione. Il tasso di successo degli esperimenti aumenta in modo significativo e le condizioni per lo sviluppo della vascolatura derivata dal donatore migliorano. L'applicazione di questo metodo alle colture xenotrapianto comporta lo sviluppo della vascolatura glomerare composta da cellule endogene endogene dei reni donatrici.
L'analisi dettagliata della morfogenesi cellulare è un'altra importante applicazione dei modelli di coltura renale. I metodi precedentemente segnalati per l'acquisizione dell'immagine time-lapse delle colture renali sono sufficienti solo per l'analisi della morfologia complessiva e la modellazione del rene embrionale, ma non per tracciare singole cellule10. Recentemente, è stato descritto un nuovo metodo di risoluzione della direzione a z (Fi-D) destinato all'imaging time-lapse 3D confocale ad alta risoluzione di organoidi renali e colture organotipiche11. In questo metodo, gli organoidi e gli organi embrionali sono delicatamente compressi tra un coperchio di vetro e una membrana permeabile di un inserto transwell in una piastra progettata su misura fino a quando lo spessore del campione raggiunge 70 m, fornendo condizioni ottiche ottimali per l'imaging. Nella seconda parte dei metodi, viene descritto un protocollo dettagliato per la fabbricazione di una piastra su misura e la configurazione di esperimenti Fi-D per l'imaging organoid a lungo termine.
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Protocol
La cura e le procedure sugli animali erano conformi alla legislazione nazionale finlandese per l'uso di animali da laboratorio, alla Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e di altro tipo (ETS 123) e alla direttiva 86/609/CEE dell'UE.
1. Fabbricazione di miniserbatoi per la coltivazione di reni embrionali di topo e organoidi renali su CAM di pollo e creazione di esperimenti di xenotrapianto
- Utilizzare inserti di coltura cellulare transwell progettati per 6 pozze o 12 piastre di pozzo.
NOTA: a seconda dell'esperimento specifico, è possibile utilizzare miniserbatoi grandi o piccoli. È meglio utilizzare piccoli miniserbatoi per lo xenotrapianto fino a otto reni embrionali o quando diversi miniserbatoi saranno posizionati sullo stesso embrione di pollo (ad esempio, campioni di esperimento e controllo sullo stesso CAM di pollo). - Tagliare i lati degli inserti utilizzando un multitool rotante con una lama a sega circolare o una sega a mano per creare un anello di plastica alto 2 mm con una membrana permeabile attaccata ad esso.
- Polacco i bordi di questi minireservoirs con un bisturi o un coltello affilato.
- Sterilizzare i miniserbatoi nel 70% di etanolo per almeno 1 h.
- Lavare i miniserbatoi in acqua a doppia distillazione automatica e lasciarli asciugare in un cappuccio laminare.
- Risciacquare i miniserbatoi in PBS e mezzi di coltura (10% FBS/1% penicillina-streptomica).
- Collocare il serbatoio in una piastra Petri, sopra una goccia (600 l/400 l) di mezzo di coltura con la membrana rivolta verso l'alto.
- Disporre sezionati i reni embrionali ex vivo o gli organoidi renali uniformemente sulla membrana con l'aiuto di una pipetta o di un tubo capillare di vetro. Evitare di lasciare un sacco di liquido intorno ai reni.
- Lasciare che i campioni si attacchino alla membrana per 2-24 h in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 e 5% di CO2.
NOTA: Fino a otto reni di topo embrionali E11,5 o organoidi renali possono essere disposti sul piccolo inserto. L'inserto di grandi dimensioni è raccomandato se saranno utilizzati pezzi più grandi di tessuto embrionale per xenotrapianto o una miscela di idrogel cellulare su un'area più ampia della CAM. - Prendere polli embrionali coltivati ex ovo di 8 giorni preparati secondo metodi pubblicati in precedenza dall'incubatore di coltura cellulare12,13.
- Trasferire i miniserbatoi al CAM in modo che gli innesti siano rivolti verso il CAM e la membrana li sovrapponga. Posizionare i miniserbatoi nella periferia del CAM, in modo che non coprano l'embrione di pollo.
NOTA: Quando si utilizzano i miniserbatoi più piccoli fabbricati da inserti transwell per 12 pozze, è possibile posizionare fino a tre miniserbatoi su un CAM. - Aggiungete ai minicarri 500 l (6 ben inserti) o 300 l (12 pozzetto) di coltura medio.
- Coltivare i campioni su pollo CAM per un massimo di 9 giorni. Sostituire il supporto di coltura nei miniserbatoi ogni giorno.
NOTA: La vascolarizzazione dei campioni può essere osservata non appena 24–48 h dopo il trapianto.
2. Fabbricazione di lastre progettate su misura e impostazione di colture Fi
- Forare fori di 20 mm di diametro nella parte inferiore di una piastra di 6 pozzetti.
NOTA: per gli esperimenti di Fi-D, utilizzare 6 piastre di pozzo con una profondità di 16 mm (specificata in Table of Materials). - Polacco i cerchi dei fori (soprattutto sul lato superiore) utilizzando un trapano elettrico con una punta di perforazione controsinkttrice, un bisturi, o un coltello affilato.
- Sterilizzare le piastre nel 70% di etanolo per almeno 1 h.
- Lavare le piastre in acqua a due distillati ad autoclave e lasciarle asciugare in condizioni sterili.
- Lavare accuratamente il vetro da 22 mm x 22 mm copre le labbra con il 70% di etanolo o pulirle secondo il protocollo pubblicato da Saarela et al.11.
- Incollare i copricapi sul lato superiore dei fori in 6 piastre di pozzo utilizzando una colla di tessuto non tossico. Applicare la colla intorno al foro e posizionare delicatamente il coperchio per coprirlo. Lasciare asciugare la colla.
- Ispezionare le piastre sotto uno stereomicroscopio e rimuovere la colla essiccata in eccesso dalla superficie dei coprinti, se necessario.
NOTA: Verificare che non vi sia alcuna colla sopra il coperchio per garantire una compressione uniforme dei campioni. - Mescolare le perline di polistirolo (dimensione delle particelle di 70 m) con un volume uguale di idrogel. È sufficiente un volume di 50-100 l per pozzo.
NOTA: Mantenere la miscela di perline di idrogel e polistirolo sul ghiaccio. - Posizionare un inserto transwell sotto un microscopio dissetante con la membrana verso l'alto.
- Disporre i campioni (ad esempio, reni embrionali ex vivo o organoidi renali) in modo uniforme sulla membrana.
- Aggiungere con attenzione la miscela di perline di idrogel/polistirolo accanto ai campioni per evitare danni ai tessuti fragili.
- Capovolgere l'inserto transwell in modo che la membrana con i campioni assemblati su di esso sia rivolta verso il basso.
- Posizionare delicatamente l'inserto in un pozzo della piastra del pozzo modificato 6 e premere delicatamente verso il basso in modo che i campioni sono compressi al livello delle perline.
NOTA: Seguire l'avanzamento della compressione utilizzando un microscopio. - Tenere l'inserto leggermente premuto al pozzo con una mano e fissarlo alla piastra fondendo la plastica con un ferro da saldatura in tre punti alla periferia dell'inserto.
- Quando l'inserto è fissato alla piastra, aggiungere 2 mL di mezzo di coltura (DMEM/10% FBS/1% penicillina-streptomycin) al pozzo e continuare ad assemblare i pozzi rimanenti nella piastra nello stesso modo.
- Trasferire la piastra finita su un'incubatrice in scena di un microscopio invertito per l'imaging time-lapse.
- Eseguire l'imaging time-lapse dei campioni utilizzando le impostazioni sperimentali appropriate.
NOTA: La modifica del supporto di coltura nei pozzetti della piastra durante gli esperimenti time-lapse non è necessaria, ma può essere facilmente eseguita attraverso i fori sui lati dell'inserto.
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Representative Results
Il protocollo di coltura CAM qui presentato ha permesso una vascolarizzazione altamente efficiente degli organoidi renali e dei reni embrionali come risultato dello xenotrapianto su CAM di pollo(Figura 1, Film 1). I minicarri contenenti mezzi di coltura fornivano nutrienti al tessuto donatore e lo proteggevano dall'essiccazione durante il periodo di tempo precedente a una corretta vascolarizzazione. Questo metodo ha fornito condizioni permissive per la crescita delle cellule endoteliali derivate dai donatori. Pertanto, la vascolatura renale nei reni e negli organoidi trapiantati è stata rappresentata per lo più, anche se non esclusivamente, da cellule specifiche del donatore (Figura 2B,C,F). Più maturo vascolatura glomerare è stato ottenuto in reni e organoidi renali trapiantati in CAM rispetto alle colture organotipiche renali (Figura 2D,E).
Il protocollo Fi-D è un metodo progettato per l'imaging time-lapse a lungo termine di reni embrionali e organoidi renali ex vivo utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione. Nel protocollo di coltura organotipica classica progettato da Trowell14, un campione viene posto su un filtro poroso, supportato da una griglia metallica, e mantenuto nell'interfaccia aria-liquido (Figura 3A). Questo metodo non è ottimale né per un tipo di microscopio verticale né invertito. Il metodo qui presentato è stato specificamente progettato per funzionare con un microscopio invertito per l'imaging. Il campione è stato immobilizzato tra un coperchio di vetro dal basso e una membrana porosa di inserto transwell (vedi sopra) (Figura 3B). La distanza ottimale tra la membrana e il coperchio era di 70 m.Figure 3B
Non ci sono piatti disponibili in commercio 6 pozzetti dove il coperchio di vetro si trova sulla superficie superiore del fondo del pozzo. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo per la fabbricazione di piastre personalizzate che hanno questa funzionalità (Figura 3B). Nella figura 4 è illustrata la morfologia rappresentativa di una coltura renale embrionale (Figura 4A,D–F) e degli organoid renali (Figura 4B,C). Il film2 rappresenta i risultati dell'imaging time-lapse ad alta risoluzione delle cellule endoteliali nel rene embrionale del topo coltivato in una configurazione Fi-D. Il pannello destro di Filmato 2 dimostra che sia la distribuzione che la migrazione di singole celle potrebbero essere osservate utilizzando questo metodo.
Figura 1: Xenotrapianto renale embrionale Murine all'embrione di pollo CAM. Xenotrapianto dei reni di topo embrionale E11.5 in un embrione di pollo ex ovo vecchio di 8 giorni; un rene embrionale murino è stato coltivato per 7 giorni sulla CAM. Barra di scala 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1: Flusso di sangue nel rene embrionale murino dopo lo xenotrapianto all'embrione di pollo CAM. Un rene embrionale E11.5 murino è stato xenotrapianto alla CAM di un embrione di pollo di 8 giorni e coltivato per 7 giorni. Il film mostra il flusso di sangue di pollo nello xenotrapianto al giorno 7. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura 2: xenotrapianto renale embrionale Murine sulla CAM embrionale di pollo. I reni embrionali Murine E11.5 (m) sono stati coltivati come coltura organotipica (cioè, controllo) o xenotrapiantati a un pollo embrionale di 8 giorni CAM (c) (cioè, esperimento). Dopo 5 giorni di coltivazione del rene embrionale, il controllo e i campioni sperimentali sono stati fissati e macchiati per il marcatore endoteliale CD31 (rosso) (A-E) e nuclei (Hoechst; blu) (D, E). (C) Anastomosi tra i vasi sanguigni di pollo e topo (punte di freccia). (D,E) Viene mostrata una singola fetta confocale dal centro del nefrone. (F) Xenotrapianto del rene embrionale murine E11.5 alla CAM transgenica GFP-pollo per 7 giorni, macchiato per CD-31 (rosso). Barre della scala : A–B 100 m; C-E 20 m; F 50 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Metodo di coltura fissa della direzione z. (A) Metodo di coltura tradizionale in cui il campione cresce su una membrana porosa sostenuta da una griglia e tenendo l'espianto nell'interfaccia aria-liquido. (B) Nella nuova configurazione Fi-D, il campione è stato delicatamente compresso tra il coperchio di vetro e una membrana porosa transwell. Le perle in poliestere controllavano lo spessore del campione regolato nella direzione z. Questa cifra è stata modificata da Saarela et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sviluppo renie embrionale e organoide renale nel nuovo metodo di coltura Fi.D. I reni embrionali (A, D–F) e gli organoidi renali (B–C) sono stati coltivati utilizzando la nuova configurazione fi.D. (A) Immagine di un rene di topo embrionale intatto il giorno 7 della coltura Fi-D. (B) Immagine di un organoide renale di topo il giorno 7 della coltura Fi-D. (C) L'organoid renale del topo MtmG (rosso) è stato coltivato per 4 giorni utilizzando la nuova configurazione Fi. L'istantanea dello stack di immagini time-lapse mostra l'espressione GFP (verde) attivata da Wnt4Crenei nefroni in via di sviluppo. (D) Il rene embrionale del topo è stato coltivato per 7 giorni utilizzando la nuova configurazione Fi-D. Le macchie Six2 (verde) e Troma-1 (Krt8, rosso) mostravano rispettivamente precursori di nefrosi e biforcazioni di germogli ureterici (UB). (E) Il rudimento renale embrionale del topo è stato coltivato per 12 giorni utilizzando la nuova configurazione Fi-D. È stato colorato con Troma-1 (rosso) e Nefrilin (verde), e ha mostrato biforcazioni UB e podociti, rispettivamente. (F) Lo stesso campione di (E) con ingrandimento ad alta potenza di Troma-1 (rosso) UB e Nephrin (verde) - podociti. Questa cifra è stata modificata da Saarela et al.11. Barre della scala - A-D, F 100 m; E 1.000 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 2: Le cellule endoteliali renali etichettate con GFP crescono nella nuova configurazione Fi-D e possono essere osservate con microscopia confocale ad alta risoluzione. Reni embrionali da E11.5 mTmG; I topi Tie1Cre sono stati sezionati e cresciuti di 6 giorni utilizzando la nuova configurazione Fi. Il film mostra l'espressione GFP indotta da Tie1Crenelle cellule endoteliali. Una pila di 20 z-strati è stata scattata utilizzando un obiettivo 10x/ 0.45, con immagini ottenute ogni 15 min. Nel filmato vengono uniti cinque strati z GFP e un piano focale di campo luminoso. Il pannello a destra mostra un primo piano di un rene in via di sviluppo. Si possono vedere cellule endoteliali che migrano nella fessura vascolare dei nefroni a forma di S. Nel pannello a destra, i livelli z GFP e il piano focale di un campo luminoso vengono uniti. Le cellule in rapido movimento sono probabilmente macrofagi15. Segnale GFP è stato espresso anche da alcune cellule del sangue. Dimensione del Voxel 0,69 m x 0,69 m x 4,13 m. Questo film è stato modificato da Saarela et al.11. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
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Discussion
Vengono presentati due protocolli dettagliati che perfezionano il metodo classico della coltura organotipica renale e consentono la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging 4D ottimale (ad esempio, immagine e tempo 3D) di reni embrionali e organoidi ex vivo. In questa sezione vengono evidenziati i passaggi critici dei metodi e vengono illustrati i problemi.
La differenza significativa tra altri metodi di coltura CAM e questo metodo di coltura CAM del pollo migliorato è l'uso di miniserbatoi su misura nello xenotrapianto di reni embrionali e organoidi renali alla CAM. Il fondo della membrana dell'inserto transwell modificato preme i campioni contro il pollo CAM e li mantiene in posizione. I lati dell'inserto fungono da serbatoio per il mezzo di coltura che protegge l'innesto dall'essiccazione. Xenografting a ex ovo coltivato pollo embrionale CAM è fortemente raccomandato, come questo metodo espone una più ampia area del CAM dove il minireservoir può essere posizionato e rende facile seguire visivamente il processo di vascolarizzazione12,13.
Uno svantaggio del metodo di coltura CAM del pollo è che l'intervallo di tempo per l'esecuzione dello xenotrapianto è limitato agli 8-9 giorni in cui la CAM dell'embrione di pollo funziona prima che inizi a degradarsi. Gli innesti che richiedono un tempo più lungo per svilupparsi dovrebbero quindi essere vascolarizzati dallo xenotrapianto a un tessuto diverso (ad esempio, capsula renale del topo)6. Lo xenotrapianto seriale del tessuto donatore potrebbe essere una soluzione a questo lungo problema del tempo di incubazione. Il metodo potrebbe essere adattato per l'imaging time-lapse della vascolarizzazione e lo sviluppo dell'innesto, ma prima deve essere affrontato il requisito di stabilizzazione del minireservoir e del CAM per l'imaging a lungo termine. Il vantaggio principale di questo protocollo di xenotrapianto renale migliorato alla CAM del pollo è che il metodo fornisce le condizioni per le cellule endoteliali derivate dai donatori per prosperare.
Il protocollo Fi-D descrive un metodo progettato per l'imaging time-lapse a lungo termine di reni embrionali e organoidi renali ex vivo utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione. Per l'impostazione è fondamentale che le dimensioni del pozzo e dell'inserimento corrispondano. Quando un coverslip è incollato sul fondo di una piastra 6 e l'inserto è posto sul pozzo, la membrana dell'inserto dovrebbe toccare il vetro. Quindi, quando la coltura è impostata, le perle distanziali determineranno la posizione della membrana e di conseguenza lo spessore dell'organo coltivato o organoide. Per questo motivo, è fondamentale rimuovere la colla in eccesso e controllare che nessun materiale stia impedendo all'inserto di toccare il vetro di copertura. È anche importante utilizzare colla di tessuto non tossico per attaccare il vetro di copertura. Si prega di notare che la colla non si attacca molto forte, quindi è fondamentale per gestire le piastre con attenzione. Le piastre possono essere riutilizzate, e se il vetro di copertura si stacca durante le fasi di lavaggio, può essere incollato di nuovo.
Il metodo di imaging Fi'D permette lo studio della nefrogenesi a livello di singola cellula. L'alta qualità delle immagini time-lapse ad alta risoluzione consente l'applicazione della segmentazione cellulare automatizzata per studiare il comportamento cellulare negli organoidi renali e nelle colture renali. Diversi campioni situati in diversi pozzi di una piastra di 6 pozze può essere studiato contemporaneamente in diverse condizioni di coltura. La tecnica può essere facilmente modificata per diverse dimensioni e tipi di tessuto e organoidi modificando le dimensioni delle perline distanziali; questo è stato dimostrato con colture cellulari ovariche14. Come ulteriore ottimizzazione di questo metodo, la combinazione dell'impostazione Fi-D con approcci microfluidici pubblicati di recente16 potrebbe essere altamente vantaggiosa per l'analisi microscopica ad alta risoluzione della morfogenesi cellulare nelle fasi successive dello sviluppo renale.
Uno dei vantaggi del metodo Did è che c'è un sacco di mezzo di coltura disponibile e non è necessario cambiarlo durante la 1 settimana di imaging. Tuttavia, se è necessario un cambiamento multimediale, il supporto può essere facilmente modificato da un'apertura nella parete dell'inserto. Il metodo Fi-D è anche superiore ad altri metodi di coltura dell'organo in quanto avvicina il campione all'obiettivo del microscopio. In altri metodi di coltura ampiamente utilizzati c'è una membrana o un filtro e una piastra di vetro inferiore tra il campione di immagine e l'obiettivo, vietando l'imaging accurato ad alta risoluzione17. Con il metodo Fi-D è possibile acquisire immagini ad alta risoluzione dei tessuti viventi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Suomen Akatemia (Accademia di Finlandia) (206038, 121647, 250900, 260056; Sovvenzione del Centro di Eccellenza 2012-2017 251314, Munuaiss, - Associazione finlandese del rene e del fegato, la Sigrid Juseliuksen S'ti, Victoriastiftelsen, La Fondazione Culturale Svedese in Finlandia, Novo Nordisk, (Società oncologica della Finlandia), il settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013; concedere FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) e H2020 Marie Sklodowska-Curie Innovative Actions Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937. Gli autori ringraziano Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias e Hannele Horkman per assistenza tecnica.
Le figure 3, 4 e Film 2 vengono ristampate con il permesso di Sviluppo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
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