Summary
Este trabajo describe dos métodos para estudiar el desarrollo de órganos, una mejor configuración de xenotrasplante en la membrana corioalantoica (CAM) a partir de embriones aviares que permite la vascularización de órganos embrionarios y organoides cultivados y una nueva dirección z fija método de cultivo de órganos con condiciones experimentales modificadas que permite imágenes confocales de lapso de tiempo de alta resolución.
Abstract
Los cultivos organotípicos renales embrionarios, y especialmente los organoides renales derivados de células madre pluripotentes, son excelentes herramientas para seguir los procesos de desarrollo y modelar la enfermedad renal. Sin embargo, los modelos están limitados por la falta de vascularización y funcionalidad. Para abordar esto, se desarrolló un protocolo mejorado para el método de xenografting células y tejidos a la membrana corioalantoica (CAM) de un embrión aviar para obtener vascularización y restauración del flujo sanguíneo. Los injertos están superpuestos con minidepósitos hechos a medida que fijan las muestras al CAM y les suministran un medio de cultivo que protege los injertos del secado. El método de cultivo mejorado permite que los xenoinjertos crezcan hasta 9 días. El manuscrito también describe cómo proporcionar condiciones óptimas para la toma de imágenes confocales a largo plazo de organoides renales y cultivos organotípicos utilizando el método de dirección Z fija (FiZD) publicado anteriormente. Este método comprime suavemente un órgano embrionario o un organoide entre un revestimiento de vidrio y una membrana en una gran cantidad de medio y proporciona excelentes condiciones para la toma de imágenes durante un máximo de 12 días. Juntos, estos métodos permiten la vascularización y el flujo sanguíneo a organoides renales y cultivos renales organotípicos con imágenes confocales mejoradas. Los métodos descritos aquí son altamente beneficiosos para el estudio de las funciones fundamentales y aplicadas de los riñones ex vivo. Ambos métodos son aplicables a varios tipos de tejidos y organoides.
Introduction
El cultivo organotípico de los riñones embrionarios se convirtió en un modelo importante para estudiar la nefrogénesis hace décadas1,2,3. Los organoides renales representan un sistema modelo avanzado para el desarrollo de riñones sanos y enfermos4. El principal inconveniente para ambos métodos, sin embargo, es que ninguno de los dos métodos recapitula la función principal del riñón: la filtración de sangre. Las nefronas y la vasculatura renal se desarrollan en organoides renales y cultivos organotípicos de forma similar al desarrollo in vivo en etapa temprana; sin embargo, los glomérulos formados in vitro permanecen avasculares5. La vascularización de los riñones embrionarios ex vivo y los organoides renales se demostró previamente en experimentos de trasplante solo en condiciones in vivo. Por ejemplo, el trasplante de organoides renales pluripotentes derivados de células madre humanas bajo una cápsula renal de ratón permite el desarrollo de las nefronas en el organoide a una etapa funcional6.
Un enfoque intermedio entre cultivos puramente in vitro y métodos de trasplante in vivo es el xenotrasplante a la CAM de embriones aviares. La vascularización de la primordia renal intacta se ha demostrado previamente utilizando este sistema7,8. Sin embargo, también se demostró que la vasculatura renal en el riñón murino xenotransplanted se deriva del endotelio huésped, no del injerto9. Esta observación redujo significativamente el potencial de los modelos quiméricos (aviares-mamíferos) de riñón embrionario para estudiar el desarrollo de la vasculatura renal, porque las condiciones experimentales no eran permisivas para la supervivencia de las células endoteliales derivadas de donantes.
En la primera parte de este protocolo se presenta un método mejorado para el cultivo de riñones embrionarios de ratón en CAM de huevos aviares, combinando condiciones microambientales de cultivo organotípico y xenotrasplante. La principal mejora de los métodos anteriores es que en lugar de colocar los riñones embrionarios de ratón y los organoides renales directamente en el CAM, el área de implantación se superpone con minidepósitos permeables llenos de medio de cultivo que suministran el tejido trasplantado con nutrientes y protegerlo del secado. La tasa de éxito de los experimentos aumenta significativamente y las condiciones para el desarrollo de la vasculatura derivada de donantes mejoran. La aplicación de este método a los cultivos xenotrasplantes da como resultado el desarrollo de vasculatura glomerular compuesta por células endoteliales endógenas de los riñones de los donantes.
El análisis detallado de la morfogénesis celular es otra aplicación importante de los modelos de cultivo renal. Los métodos notificados anteriormente de adquisición de imágenes de lapso de tiempo de cultivos renales son suficientes sólo para el análisis de la morfología general y el patrón del riñón embrionario, pero no para el seguimiento de células individuales10. Recientemente, se describió11un nuevo método de Dirección Z Fija (FiZD) destinado a la toma de imágenes de lapso de tiempo 3D confocales de alta resolución de organoides renales y cultivos organotípicos organotípicos. En este método, los organoides y los órganos embrionarios se comprimen suavemente entre un tapón de vidrio y una membrana permeable de un inserto transpoente en una placa diseñada a medida hasta que el espesor de la muestra alcanza los 70 m, proporcionando condiciones ópticas óptimas para la toma de imágenes. En la segunda parte de los métodos, se describe un protocolo detallado para la fabricación de una placa diseñada a medida y la configuración de experimentos FiZD para imágenes organoides a largo plazo.
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Protocol
El cuidado y los procedimientos de los animales se ajustaron a la legislación nacional finlandesa para el uso de animales de laboratorio, al Convenio Europeo para la protección de los animales vertebrados utilizados con fines experimentales y otros fines científicos (ETS 123) y a la Directiva 86/609/CEE de la UE.
1. Fabricación de minidepósitos para el cultivo de riñones embrionarios de ratón y organoides renales en CAM de pollo y la creación de experimentos de xenotrasplante
- Utilice plaquitas de cultivo de células transwell diseñadas para 6 placas de pozo o 12 pocillos.
NOTA: Dependiendo del experimento en particular, se pueden utilizar minidepósitos grandes o pequeños. Lo mejor es utilizar pequeños minidepósitos para xenografting hasta ocho riñones embrionarios o cuando se colocarán varios minidepósitos en el mismo embrión de pollo (por ejemplo, muestras de experimento y control en el mismo CAM de pollo). - Corte los lados de las plaquitas utilizando una multiherramienta giratoria con una hoja de sierra circular o una sierra de mano para crear un anillo de plástico de 2 mm de alto con una membrana permeable unida a ella.
- Pulir los bordes de estos minidepósitos con un bisturí o un cuchillo afilado.
- Esterilice los minidepósitos en etanol al 70% durante al menos 1 h.
- Lave los minidepósitos en agua autoclave de doble destilación y déjelos secar en una campana laminar.
- Enjuague los minidepósitos en PBS y medio de cultivo (DMEM de alta glucosa/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina).
- Coloque el depósito en una placa de Petri, encima de una gota (600 l/400 l) de medio de cultivo con la membrana hacia arriba.
- Organizar los riñones embrionarios ex vivo diseccionados o organoides renales uniformemente en la membrana con la ayuda de una pipeta o un tubo capilar de vidrio. Evite dejar mucho líquido alrededor de los riñones.
- Dejar que las muestras se adhieran a la membrana durante 2-24 h en una incubadora de cultivo celular a 37 oC y 5% CO2.
NOTA: Se pueden organizar hasta ocho riñones de ratón embrionarios E11.5 o organoides renales en el pequeño inserto. El inserto grande se recomienda si se utilizarán trozos más grandes de tejido embrionario para el xenotrasplante o una mezcla de células y hidrogeles en un área más grande de la CAM. - Tome pollos embrionarios cultivados ex ovo de 8 días de edad preparados de acuerdo con métodos publicados previamente de la incubadora de cultivo celular12,13.
- Transfiera los minidepósitos al CAM para que los injertos estén frente al CAM, y la membrana los superponga. Coloque los minidepósitos en la periferia de la CAM, para que no cubran el embrión de pollo.
NOTA: Cuando se utilizan los minidepósitos más pequeños fabricados a partir de plaquitas transwell para 12 placas de pozo, se pueden colocar hasta tres minidepósitos en un CAM. - Añadir 500 l (6 plaquitas de pozo) o 300 l (12 plaquitas de pozo) de medio de cultivo a los minidepósitos.
- Cultivar las muestras en pollo CAM durante un máximo de 9 días. Sustituya diariamente el medio de cultivo en los minidepósitos.
NOTA: La vascularización de las muestras se puede observar tan pronto como 24–48 h después del trasplante.
2. Fabricación de placas diseñadas a medida y configuración de cultivos FiZD
- Taladre agujeros de 20 mm de diámetro en la parte inferior de una placa de 6 pozos.
NOTA: Para experimentos FiZD, utilice 6 placas de pozo con una profundidad de pozo de 16 mm (especificada en Tabla de materiales). - Pulir las llantas de los agujeros (especialmente en la parte superior) utilizando un taladro eléctrico con una broca de avellanado, un bisturí o un cuchillo afilado.
- Esterilice las placas en 70% de etanol durante al menos 1 h.
- Lave las placas en agua autoclave de doble destilación y déjelas secar en condiciones estériles.
- Lavar a fondo los revestimientos de vidrio de 22 mm x 22 mm con 70% de etanol o limpiarlos de acuerdo con el protocolo publicado por Saarela et al.11.
- Pegue los cubreobjetos en la parte superior de los agujeros en 6 placas de pozo utilizando un pegamento de tejido no tóxico. Aplique pegamento alrededor del orificio y coloque suavemente el cubreobjetos para cubrirlo. Deje que el pegamento se seque.
- Inspeccione las placas bajo un estereomicroscopio y retire el exceso de pegamento seco de la superficie de los labios de las cubiertas si es necesario.
NOTA: Compruebe que no haya pegamento por encima de la cubierta para garantizar una compresión uniforme de las muestras. - Mezclar perlas de poliestireno (tamaño de partícula de 70 m) con un volumen igual de hidrogel. Un volumen de 50–100 l por pocto es suficiente.
NOTA: Mantenga la mezcla de hilagey y perlas de poliestireno en hielo. - Coloque un inserto transwell bajo un microscopio de disección con la membrana hacia arriba.
- Organizar las muestras (p. ej., riñones embrionarios ex vivo o organoides renales) uniformemente en la membrana.
- Agregue cuidadosamente la mezcla de perlas de hidrogel/poliestireno junto a las muestras para evitar daños en tejidos frágiles.
- Voltear el inserto transwell para que la membrana con las muestras ensambladas en ella esté mirando hacia abajo.
- Coloque suavemente el inserto en un pozo de la placa de 6 pocillos modificada y presione suavemente hacia abajo para que las muestras se compriman al nivel de las cuentas.
NOTA: Siga el progreso de la compresión utilizando un microscopio. - Mantenga la plaquita ligeramente prensada al pozo con una mano y fíjela a la placa fundiendo plástico con un soldador en tres puntos en la periferia de la plaquita.
- Cuando la plaquita esté fijada a la placa, añada 2 ml de medio de cultivo (DMEM/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina) al pozo y continúe montando los pozos restantes en la placa de la misma manera.
- Transfiera la placa terminada a una incubadora en el escenario de un microscopio invertido para obtener imágenes de lapso de tiempo.
- Realice imágenes de lapso de tiempo de las muestras utilizando los ajustes experimentales adecuados.
NOTA: No es necesario cambiar el medio de cultivo en los pocillos de la placa durante los experimentos de lapso de tiempo, pero se puede hacer fácilmente a través de los orificios en los lados de la plaquita.
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Representative Results
El protocolo de cultivo CAM presentado aquí permitió la vascularización altamente eficiente de organoides renales y riñones embrionarios como resultado del xenotrasplante en el pollo CAM(Figura 1, Película 1). Los minidepósitos que contenían un medio de cultivo suministraban nutrientes al tejido del donante y lo protegían del secado durante el período anterior a la vascularización adecuada. Este método proporcionó condiciones permisivas para que las células endoteliales derivadas del donante crecieran. Por lo tanto, la vasculatura renal en los riñones y organoides trasplantados estaba representada principalmente, aunque no exclusivamente, por células específicas de donantes(Figura 2B,C,F). Se obtuvo una vasculatura glomerular más madura en riñones y organoides renales trasplantados a CAM que en cultivos organotípicos renales(Figura 2D,E).
El protocolo FiZD es un método diseñado para la toma de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de riñones embrionarios ex vivo y organoides renales mediante microscopía confocal de alta resolución. En el protocolo de cultivo organotípico clásico diseñado por Trowell14, una muestra se coloca en un filtro poroso, apoyado por una rejilla metálica, y mantenido en la interfaz aire-líquido(Figura 3A). Este método no es óptimo ni para un tipo de microscopio vertical ni invertido. El método presentado aquí fue diseñado específicamente para funcionar con un microscopio invertido para la toma de imágenes. La muestra se inmovilizó entre un cubreobjetos de vidrio desde abajo y una membrana porosa de inserto transwell (véase arriba) (Figura 3B). La distancia óptima entre la membrana y el cubreobjetos fue de 70 m. Las perlas de poliestireno se utilizaron como espaciadores para ajustar el espesor de la muestra en este rango(Figura 3B).
No hay 6 placas de pozo disponibles comercialmente donde el cubreobjetos de vidrio se encuentra en la superficie superior de la parte inferior del pozo. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo para la fabricación de placas diseñadas a medida que tienen esta característica(Figura 3B). La Figura 4 muestra la morfología representativa de un cultivo renal embrionario(Figura 4A,D–F)y organoides renales(Figura 4B,C). La película 2 representa los resultados de imágenes de lapso de tiempo de alta resolución de células endoteliales en riñón embrionario de ratón cultivado en una configuración de FiZD. El panel derecho de la película 2 muestra que la distribución y la migración de celdas individuales se pueden observar utilizando este método.
Figura 1: Riñón embrionario murino xenotransplante al embrión de pollo CAM. Xenotrasplante de e11.5 embriones de ratón embrionarios en embrión de pollo ex ovo de 8 días de edad; un riñón embrionario murino se cultivó durante 7 días en CAM. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Flujo sanguíneo en riñón embrionario murino después de xenotrasplante a embrión de pollo CAM. Un riñón embrionario E11.5 murino fue xenotransplanted a la CAM de un embrión de pollo de 8 días de edad y cultivado durante 7 días. La película muestra el flujo de sangre de pollo en el xenoinjerto en el día 7. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
Figura 2: Xenotrasplante renal embrionario murino en CAM de embriones de pollo. Los riñones embrionarios (m) Murine E11.5 se cultivaron como un cultivo organotípico (es decir, control) o xenotransplanted a un pollo embrionario CAM (c) de 8 días de edad (es decir, experimento). Después de 5 días de cultivo embrionario del riñón, las muestras de control y experimentales se fijaron y se teñiron para el marcador endotelial CD31 (rojo) (A–E) y los núcleos (Hoechst; azul) (D, E). (C) Anastomosas entre el pollo y los vasos sanguíneos del ratón (cabezas de flecha). (D,E) Se muestra una sola rebanada confocal desde el centro de la nefrona. (F) Xenotrasplante de murino E11.5 riñón embrionario a CAM transgénico de pollo GFP durante 7 días, manchado para CD-31 (rojo). Barras de escala a A–B 100 m; C-E 20 m; F 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Método de referencia cultural de dirección Z fijo. (A) Método de cultivo tradicional en el que la muestra crece sobre una membrana porosa apoyada por una rejilla y sosteniendo la explanta en la interfaz aire-líquido. (B) En la nueva configuración de FiZD, la muestra se comprimió suavemente entre el cubredes de vidrio y una membrana porosa transwell. Las perlas de poliéster controlaban el espesor de la muestra ajustada en la dirección z. Esta figura fue modificada de Saarela et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los riñones embrionarios y el desarrollo de organoides renales en el nuevo método de cultivo FiZD. Los riñones embrionarios(A, D–F)y los organoides renales(B–C)se cultivaron utilizando la nueva configuración de FiZD. (A) Imagen de Brightfield de un riñón de ratón embrionario intacto en el día 7 del cultivo FiZD. (B) Imagen de Brightfield de un organoide renal de ratón el día 7 de la cultura FiZD. (C) El organoide renal del ratón MtmG (rojo) se cultivó durante 4 días utilizando la nueva configuración de FiZD. La instantánea de la pila de imágenes de lapso de tiempo muestra la expresión GFP activada por Wnt4Cre(verde) en las nefronas en desarrollo. (D) El riñón embrionario del ratón se cultivó durante 7 días utilizando la nueva configuración de FiZD. Seis2 (verde) y troma-1 (Krt8, rojo) la tinción mostró precursores de nefrona y bifurcaciones de cogollos uretéricos (UB), respectivamente. (E) El rudiment renal embrionario del ratón se cultivó durante 12 días utilizando la nueva configuración de FiZD. Se tiñó con Troma-1 (rojo) y Nefrin (verde), y mostró bifurcaciones y podocitos de la UB, respectivamente. (F) La misma muestra que en (E) con aumento de alta potencia de Troma-1+ (rojo) UB y la Nefrin (verde) + podocitos. Esta figura fue modificada de Saarela et al.11. Barras de escala a A-D, F 100 m; E 1,000 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 2: Las células endoteliales renales etiquetadas con GFP crecen en la nueva configuración de FiZD y se pueden observar con microscopía confocal de alta resolución. Riñón embrionario de E11.5 mTmG; Los ratones Tie1Cre fueron diseccionados y crecidos 6 días usando la nueva configuración de FiZD. La película muestra la expresión GFP inducida por Tie1Creen celdas endoteliales. Se tomó una pila de 20 capas z utilizando un objetivo de 10x/0.45, con imágenes obtenidas cada 15 min. En la película, se fusionan cinco capas z de GFP y un plano focal de campo brillante. El panel de la derecha muestra un primer plano de un riñón en desarrollo. Se pueden ver células endoteliales que migran a la hendidura vascular de las nefronas de etapa en forma de S. En el panel de la derecha, se fusionan la capa z de GFP y un plano focal de campo brillante. Las células que se mueven rápidamente son probablemente macrófagos15. La señal de GFP también fue expresada por algunas células sanguíneas. Tamaño de Voxel 0,69 ám x 0,69 ám x 4,13 m. Esta película ha sido modificada de Saarela et al.11. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)
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Discussion
Se presentan dos protocolos detallados que refinan el método clásico de cultivo organotípico renal y permiten la vascularización, el desarrollo prolongado y la imagen y el tiempo óptimos en 4D (es decir, imagen 3D y tiempo) de riñones embrionarios ex vivo y organoides. Esta sección resalta los pasos críticos en los métodos y discute la solución de problemas.
La diferencia significativa entre otros métodos de cultivo CAM y este método de cultivo CAM de pollo mejorado es el uso de minidepósitos hechos a medida en la xenonieve de los riñones embrionarios y los organoides renales a la CAM. La parte inferior de la membrana del inserto transwell modificado presiona las muestras contra el CAM de pollo y las mantiene en su lugar. Los lados de la plaquita sirven como reservorio para el medio de cultivo que protege el injerto del secado. Xenografting to ex ovo cultivado pollo embrionario CAM es muy recomendable, ya que este método expone un área más grande de la CAM donde se puede colocar el miniembalse y hace que sea fácil seguir visualmente el proceso de vascularización12,13.
Un inconveniente del método de cultivo CAM de pollo es que el período de tiempo para realizar el xenotrasplante se limita a los 8-9 días en que funciona el CAM del embrión de pollo antes de que comience a degradarse. Por lo tanto, los injertos que necesiten un tiempo más largo para desarrollarse deben vascularizarse por xenotrasplante a un tejido diferente (por ejemplo, cápsula renal de ratón)6. El xenotrasplante en serie del tejido del donante podría ser una solución a este largo problema del tiempo de incubación. El método podría adaptarse para la toma de imágenes de lapso de tiempo de la vascularización y el desarrollo del injerto, pero primero debe abordarse el requisito de estabilización del minidepósito y CAM para la toma de imágenes a largo plazo. La principal ventaja de este protocolo mejorado de xenotrasplante renal para el pollo CAM es que el método proporciona condiciones para que las células endoteliales derivadas de donantes prosperen.
El protocolo FiZD describe un método diseñado para la toma de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de riñones embrionarios ex vivo y organoides renales mediante microscopía confocal de alta resolución. Para la configuración es fundamental que las dimensiones del pozo y la inserción coincidan. Cuando se pega un cubreobjetos en la parte inferior de una placa de 6 pocillos y el inserto se coloca en el pozo, la membrana de la plaquita debe tocar el vidrio. Luego, cuando se configura el cultivo, las cuentas espaciadoras determinarán la posición de la membrana y, en consecuencia, el grosor del órgano u organoide cultivado. Por esta razón, es fundamental eliminar el exceso de pegamento y comprobar que ningún material está restringiendo la plaquita de tocar el cristal de la cubierta. También es importante utilizar pegamento tisular no tóxico para fijar el vidrio de la cubierta. Tenga en cuenta que el pegamento no se fija con mucha fuerza, por lo que es fundamental manipular las placas con cuidado. Las placas se pueden reutilizar, y si el vidrio de la cubierta se separa durante los pasos de lavado, se puede volver a pegar.
El método de imágenes FiZD permite el estudio de la nefrogénesis a un nivel de una sola célula. La alta calidad de las imágenes de lapso de tiempo de alta resolución permite la aplicación de la segmentación celular automatizada para estudiar el comportamiento celular en organoides renales y cultivos renales. Varias muestras ubicadas en diferentes pozos de una placa de 6 pozos se pueden estudiar simultáneamente en diferentes condiciones de cultivo. La técnica se puede modificar fácilmente para diferentes tamaños y tipos de tejido y organoides cambiando el tamaño de las cuentas espaciadores; esto se demostró con los cultivos de células ováricas14. Como una optimización adicional de este método, combinar la configuración de FiZD con enfoques microfluídicos publicados recientemente16 podría ser altamente beneficioso para el análisis microscópico de alta resolución de la morfogénesis celular en etapas posteriores del desarrollo renal.
Una ventaja del método FiZD es que hay un montón de medio de cultivo disponible y no es necesario cambiarlo durante la 1 semana de imágenes. Aún así, si se necesita un cambio de medios, el medio se puede cambiar fácilmente de una abertura en la pared de la plaquita. El método FiZD también es superior a otros métodos de cultivo de órganos, ya que acerca la muestra al objetivo del microscopio. En otros métodos de cultivo ampliamente utilizados hay una membrana o filtro y un fondo de placa de vidrio entre la muestra de imagen y el objetivo, prohibiendo la imagen precisa de alta resolución17. Con el método FiZD es posible adquirir imágenes de alta resolución de tejidos vivos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado financieramente por la Suomen Akatemia (Academia de Finlandia) (206038, 121647, 250900, 260056; El Centro de Excelencia concede 2012-2017 251314), Munuaiss-tiá - Asociación Finlandesa de Riñón y Hígado, la Sigrid Juseliuksen Sáti, Victoriastiftelsen, La Fundación Cultural Sueca en Finlandia, Novo Nordisk, Sy-P-j-rjest-t (Sociedad del Cáncer de Finlandia), el Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013; conceder FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) y H2020 Marie Sklodowska-Curie Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937. Los autores agradecen la asistencia técnica de Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias y Hannele H'rkman.
Las figuras 3, 4 y 2 se reimprimen con el permiso de Desarrollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
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