Summary
Este trabalho descreve dois métodos para estudar o desenvolvimento de órgãos, uma melhor configuração de xenotransplante na membrana corioallantoica (CAM) a partir de embriões aviários que permite a vascularização de órgãos e organóides embrionários cultivados e uma nova direção fixa z método de cultura de órgãos com condições experimentais modificadas que permite imagens confocais de lapso de tempo de alta resolução.
Abstract
Culturas organotípicas de rim embrionário, e especialmente organóides renais derivados de células-tronco pluripotentes, são excelentes ferramentas para acompanhar processos de desenvolvimento e modelar doenças renais. No entanto, os modelos são limitados pela falta de vascularização e funcionalidade. Para lidar com isso, foi desenvolvido um protocolo aprimorado para o método de xenoenxerto de células e tecidos para a membrana corioallantoica (CAM) de um embrião aviário para obter vascularização e restauração do fluxo sanguíneo. Os enxertos são sobrepostos com minireservatórios feitos medida que fixam as amostras no CAM e fornecem-lhes meio de cultura que protege os enxertos da secagem. O método de cultura aprimorado permite que os xenoenxertos cresçam por até 9 dias. O manuscrito também descreve como fornecer condições ideais para imagens confocais de longo prazo de organóides renais e culturas organotípicas usando o método Fixa Z-Direction (FiZD) publicado anteriormente. Este método comprime suavemente um órgão embrionário ou organóide entre um deslizamento de vidro e membrana em uma grande quantidade de meio e fornece excelentes condições para a imagem por até 12 dias. Juntos, esses métodos permitem a vascularização e o fluxo sanguíneo para organóides renais e culturas renais organotípicas com melhor imagem confocal. Os métodos descritos aqui são altamente benéficos para o estudo de funções fundamentais e aplicadas de rins ex vivo. Ambos os métodos são aplicáveis a vários tipos de tecidos e organóides.
Introduction
A cultura organotípica dos rins embrionários tornou-se um importante modelo para estudar a nefrogênese décadas atrás1,2,3. Organóides renais representam um sistema de modelo avançado para estudar o desenvolvimento de rins saudáveis e doentes4. A principal desvantagem para ambos os métodos, no entanto, é que nenhum dos métodos recapitula a função principal do rim: filtração sanguínea. Neffros e vasculatura renal desenvolvem-se em organóides renais e culturas organotípicas de forma semelhante ao estágio inicial no desenvolvimento vivo; no entanto, os glomeruli formados in vitro permanecemavasculares 5. A vascularização de rins embrionários ex vivos e organóides renais foi previamente demonstrada em experimentos de transplante apenas em condições in vivo. Por exemplo, o transplante de organóides renais derivados de células-tronco pluripotentes humanas sob uma cápsula de rim de camundongos permite o desenvolvimento dos néfrons no organóide para um estágio funcional6.
Uma abordagem intermediária entre culturas puramente in vitro e métodos de transplante in vivo é o xenotransplante para a CAM de embriões aviários. A vascularização da primordia renal do rato intacta foi demonstrada anteriormente usando este sistema7,8. No entanto, também foi demonstrado que a vasculatura renal no rim murina xenotransplantado foi derivada do endotélio hospedeiro, não do enxerto9. Esta observação reduziu significativamente o potencial de modelos quiméricos (aviários-mamíferos) de rim embrionário para estudar o desenvolvimento da vasculatura renal, porque as condições experimentais não eram permissivas para a sobrevivência de células endoteliais derivadas de doadores.
Apresentado na primeira parte deste protocolo é um método aprimorado para o cultivo de rins embrionários de camundongos em CAM de ovos aviários, combinando condições microambientais de cultura organotípica e xenotransplante. A principal melhoria dos métodos anteriores é que, em vez de colocar os rins embrionários do rato e organóides renais diretamente no CAM, a área de implantação é sobreposta com minireservatórios permeáveis cheios de meio de cultura que fornecem o tecido transplantado com nutrientes e protegê-lo da secagem. A taxa de sucesso dos experimentos aumenta significativamente e as condições para o desenvolvimento da vasculatura derivada de doadores melhoram. A aplicação deste método às culturas xenotransplanteresulta no desenvolvimento da vasculatura glomerular composta por células endógenas endógenas dos rins doadores.
A análise detalhada da morfogênese celular é outra importante aplicação de modelos de cultura renal. Os métodos previamente relatados de aquisição de imagens de lapso de tempo de culturas renais são suficientes apenas para análise da morfologia geral e padronização do rim embrionário, mas não para o rastreamento de células individuais10. Recentemente, foi descrito um novo método Fixo de Direção Z (FiZD) destinado à imagem confocal de lapso de tempo 3D de alta resolução de organóides renais e culturas organotípicas11. Neste método, os organóides e órgãos embrionários são suavemente comprimidos entre uma tampa de vidro e uma membrana permeável de uma inserção transwell em uma placa projetada medida até que a espessura da amostra atinja 70 μm, proporcionando condições ópticas ideais para a imagem. Na segunda parte dos métodos, é descrito um protocolo detalhado para a fabricação de uma placa projetada medida e a configuração de experimentos FiZD para imagens organóides de longo prazo.
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Protocol
Os cuidados e procedimentos dos animais estavam de acordo com a legislação nacional finlandesa para o uso de animais de laboratório, a Convenção Europeia para a proteção de animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros produtos científicos (ETS 123) e a Diretiva 86/609/CEE da UE.
1. Fabricação de minireservatórios para cultivo de rins embrionários de camundongos e organóides renais em CAM de frango e criação de experimentos de xenotransplante
- Use pastilhas de cultura de células transwell projetadas para 6 placas de poço ou 12 poços.
NOTA: Dependendo do experimento específico, podem ser utilizados minireservatórios grandes ou pequenos. É melhor usar pequenos minireservatórios para xenoenxertar até oito rins embrionários ou quando vários minireservatórios serão colocados no mesmo embrião de frango (por exemplo, experimentar e controlar amostras no mesmo CAM de frango). - Corte as laterais das pastilhas usando uma multiferramenta rotativa com uma lâmina de serra circular ou uma serra de mão para criar um anel plástico de 2 mm de altura com uma membrana permeável presa a ele.
- Polir as bordas desses minireservatórios com um bisturi ou uma faca afiada.
- Esterilize os minireservatórios em 70% de etanol por pelo menos 1 h.
- Lave os minireservatórios em água dupla destilada autoclaved e deixe-os secar em um capô laminar.
- Enxágüe os minireservatórios em PBS e meio de cultura (DMEM de alta glicose/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina).
- Coloque o reservatório em uma placa de Petri, em cima de uma gota (600 μL/400 μL) de meio de cultura com a membrana voltada para cima.
- Disponha rins embrionários ex vivos dissecados ou organóides renais uniformemente na membrana com a ajuda de uma pipeta ou de um tubo capilar de vidro. Evite deixar muito líquido ao redor dos rins.
- Deixe as amostras se prenderem à membrana por 2-24 h em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% CO2.
NOTA: Até oito rins embrionários de camundongos e organóides embrionários E11.5 podem ser dispostos na pequena inserção. A grande inserção é recomendada se pedaços maiores de tecido embrionário serão usados para xenotransplante ou uma mistura de hidrogel celular em uma área maior do CAM. - Pegue galinhas embrionárias ex ovo de 8 dias preparadas de acordo com métodos publicados anteriormente da incubadora de cultura celular12,13.
- Transfira os minireservatórios para o CAM para que os enxertos estejam voltados para a CAM, e a membrana os sobrepõe. Coloque os minireservatórios na periferia da CAM, para que não estejam cobrindo o embrião de frango.
NOTA: Ao utilizar os minireservatórios menores fabricados a partir de pastilhas transwell para 12 placas de poço, até três minireservatórios podem ser colocados em uma CAM. - Adicione 500 μL (6 inserções de poço) ou 300 μL (12 pastilhas de poço) do meio de cultura aos minireservatórios.
- Cultive as amostras em CAM de frango por um máximo de 9 dias. Substitua o meio de cultura nos minireservatórios diariamente.
NOTA: A vascularização das amostras pode ser observada a partir das 24 h às 48 h após o transplante.
2. Fabricação de placas personalizadas e criação de culturas FiZD
- Furos de 20 mm de diâmetro na parte inferior de uma placa de 6 poços.
NOTA: Para experimentos FiZD, use 6 placas de poço com uma profundidade de poço de 16 mm (especificada em Tabela de Materiais). - Polir as bordas dos orifícios (especialmente na parte superior) usando uma broca elétrica com uma broca de contra-pia, um bisturi ou uma faca afiada.
- Esterilize as placas em 70% de etanol por pelo menos 1 h.
- Lave as placas em água duplamente destilada e deixe-as secar em condições estéreis.
- Lave completamente as tampas de vidro de 22 mm x 22 mm com 70% de etanol ou limpe-as de acordo com o protocolo publicado por Saarela et al.11.
- Cole as tampas para o lado superior dos orifícios em 6 placas de poço usando uma cola de tecido não tóxica. Aplique cola ao redor do orifício e coloque delicadamente o deslizamento de cobertura para cobri-lo. Deixe a cola secar.
- Inspecione as placas sob um microscópio eretore e remova o excesso de cola seca da superfície das tampas, se necessário.
NOTA: Verifique se não há cola acima do deslizamento de cobertura para garantir a compressão das amostras. - Misture contas de poliestireno (tamanho de partícula de 70 μm) com um volume igual de hidrogel. Um volume de 50-100 μL por poço é suficiente.
NOTA: Mantenha a mistura de contas de hidrogel e poliestireno no gelo. - Coloque uma inserção transwell um microscópio dissecando com a membrana para cima.
- Organize as amostras (por exemplo, rins embrionários ex vivos ou organóides renais) uniformemente na membrana.
- Adicione cuidadosamente a mistura de talo hidrogel/poliestireno ao lado das amostras para evitar danos a tecidos frágeis.
- Gire a inserção transwell para que a membrana com as amostras montadas sobre ela esteja voltada para baixo.
- Coloque suavemente a inserção em um poço da placa de 6 poços modificada e pressione-a suavemente para baixo para que as amostras sejam compactadas ao nível das contas.
NOTA: Acompanhe o progresso da compressão usando um microscópio. - Mantenha a inserção ligeiramente pressionada para o poço com uma mão e fixe-a na placa derretendo plástico com um ferro de soldar em três pontos na periferia da pastilha.
- Quando a inserção estiver fixada na placa, adicione 2 mL de meio de cultura (DMEM/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina) ao poço e continue montando os poços restantes na placa da mesma forma.
- Transfira a placa acabada para uma incubadora no estágio de um microscópio invertido para imagens de lapso de tempo.
- Realize imagens de lapso de tempo das amostras usando configurações experimentais apropriadas.
NOTA: A mudança do meio de cultura nos poços da placa durante experimentos de lapso de tempo não é necessária, mas pode ser facilmente feita através dos orifícios nas laterais da pastilha.
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Representative Results
O protocolo de cultura CAM aqui apresentado possibilitou a vascularização altamente eficiente de organóides renais e rins embrionários como resultado do xenotransplante no cam de frango (Figura 1, Filme 1). Minireservatórios contendo meio saqueador forneceram nutrientes ao tecido doador e o protegeram da secagem durante o período anterior à vascularização adequada. Este método forneceu condições permissivas para o crescimento de células endoteliais derivadas de doadores. Portanto, a vasculatura renal nos rins e organóides transplantados foi representada principalmente, embora não exclusivamente, por células específicas do doador(Figura 2B,C,F). Vasculatura glomerular mais madura foi obtida em rins e organóides renais transplantados para CAM do que em culturas organotípicas renais(Figura 2D,E).
O protocolo FiZD é um método projetado para imagens de lapso de tempo de longo prazo de rins ex vivos embrionários e organóides renais usando microscopia confocal de alta resolução. No protocolo de cultura organotípica clássica projetado por Trowell14,um espécime é colocado em um filtro poroso, apoiado por uma grade metálica, e mantido na interface ar-líquido(Figura 3A). Este método não é ideal nem para um tipo vertical nem invertido de microscópio. O método aqui apresentado foi especificamente projetado para funcionar com um microscópio invertido para imagem. A amostra foi imobilizada entre uma tampa de vidro de baixo e uma membrana porosa de inserção transwell (ver acima) (Figura 3B). A distância ideal entre a membrana e o deslizamento de cobertura foi de ~70 μm. As contas de poliestireno foram usadas como espaçadores para definir a espessura da amostra nesta faixa(Figura 3B).
Não há 6 placas de poço disponíveis comercialmente onde a tampa de vidro está localizada na superfície superior do poço. Por isso, foi desenvolvido um protocolo para a fabricação de placas personalizadas que possuem esse recurso(Figura 3B). A Figura 4 apresenta a morfologia representativa de uma cultura renal embrionária (Figura 4A,D–F) e organóides renais(Figura 4B,C). O filme 2 representa os resultados da imagem de lapso de tempo de alta resolução de células endoteliais em rim embrionário de camundongos cultivados em uma configuração FiZD. O painel direito no Filme 2 demonstra que tanto a distribuição quanto a migração de células individuais poderiam ser observadas usando este método.
Figura 1: Xenotransplantado de rim embrionário murina para o embrião de frango CAM. Xenotransplante de rins de rato embrionário E11.5 em embrião de frango ex ovo de 8 dias de idade; um rim embrionário murina foi cultivado por 7 dias em CAM. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Fluxo sanguíneo no rim embrionário murina após o xenotransplante para o embrião de frango CAM. Um rim embrionário murine E11.5 foi xenotransplantado para o CAM de um embrião de frango de 8 dias de idade e cultivado por 7 dias. O filme mostra o fluxo sanguíneo de galinha no xenoenxerto no dia 7. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Figura 2: Xenotransplante de rim embrionário murina no embrião de frango CAM. Os rins embrionários Murine E11.5 (m) foram cultivados como cultura organotípica (ou seja, controle) ou xenotransplantados para um cam de frango embrionário de 8 dias de idade (c) (ou seja, experimento). Após 5 dias de cultivo de rim embrionário, as amostras de controle e experimentais foram fixadas e manchadas para o marcador endotelial CD31 (vermelho)(A-E)e núcleos (Hoechst; azul)(D, E). (C) Anastomoses entre vasos sanguíneos de frango e rato (pontas de flecha). (D,E) Uma única fatia confocal do meio do néfron é mostrada. (F) Xenotransplante de murina E11.5 rim embrionário para gfp-frango transgênico CAM por 7 dias, manchado para CD-31 (vermelho). Barras de escala = A–B 100 μm; C-E 20 μm; F 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Método fixo de cultura de direção Z. (A) Método de cultura tradicional onde a amostra cresce em uma membrana porosa apoiada por uma grade e segurando a explanta na interface ar-líquido. (B) Na nova configuração FiZD, a amostra foi suavemente comprimida entre a tampa de vidro e uma membrana porosa transwell. As contas de poliéster controlavam a espessura da amostra ajustada na direção z. Esta figura foi modificada a partir de Saarela et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Rins embrionários e desenvolvimento organóide renal no novo método de cultura FiZD. Rins embrionários(A, D-F) e organóides renais(B-C) foram cultivados usando a nova configuração FiZD. (A)Imagem brightfield de um rim de rato embrionário intacto no 7º dia da cultura FiZD. (B) Imagem brightfield de um organóide de rim de rato no 7º dia da cultura FiZD. (C) O organóide do rim do rato MtmG (vermelho) foi cultivado por 4 dias usando a nova configuração FiZD. O instantâneo da pilha de imagens de lapso de tempo mostra a expressão GFP (verde) ativada por Wnt4Crenos néfrons em desenvolvimento. (D) O rim embrionário do rato foi cultivado durante 7 dias utilizando a nova configuração FiZD. A coloração de 62 (verde) e Troma-1 (Krt8, vermelho) mostrou precursores de néfron e bifurcações de brotou uretérico (UB), respectivamente. (E) O rudimento do rim embrionário do rato foi cultivado por 12 dias usando a nova configuração FiZD. Foi manchada com Troma-1 (vermelho) e Nefrina (verde), e apresentou bifurcações ub e podocytes, respectivamente. (F) A mesma amostra de(E)com ampliação de alta potência de Troma-1+ (vermelho) UB e nefrina (verde) + podocytes. Esta figura foi modificada a partir de Saarela et al.11. Barras de escala = A-D, F 100 μm; E 1.000 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 2: Células endoteliais renais rotuladas com GFP crescem na nova configuração FiZD e podem ser observadas com microscopia confocal de alta resolução. rins embrionários de E11,5 mTmG; Os ratos Tie1Cre foram dissecados e cresceram 6 dias usando a nova configuração FiZD. O filme mostra a expressão gfp induzida por Tie1Creem células endoteliais. Uma pilha de 20 camadas z foi tirada usando um objetivo 10x/0,45, com imagens obtidas a cada 15 min. No filme, cinco z-camadas GFP e um plano focal de campo brilhante são fundidos. O painel à direita mostra um close-up de um rim em desenvolvimento. Células endoteliais migrando para a fissura vascular dos néfrons do estágio em forma de S podem ser vistas. No painel à direita, a camada z GFP e um plano focal de campo brilhante são mesclados. As células em movimento rápido são provavelmente macrófagos15. O sinal gfp também foi expresso por algumas células sanguíneas. Tamanho voxel 0,69 μm x 0,69 μm x 4,13 μm. Este filme foi modificado de Saarela et al.11. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
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Discussion
Dois protocolos detalhados são apresentados que refinam o método clássico de cultura organotípica renal, e permitem a vascularização, o desenvolvimento prolongado e a imagem 4D ideal (ou seja, imagem 3D e tempo) de imagens ex vivos embrionárias e organóides. Esta seção destaca as etapas críticas nos métodos e discute a solução de problemas.
A diferença significativa entre outros métodos de cultura CAM e este método de cultura cam de frango melhorado é o uso de minireservatórios feitos medida na xenoenxerto de rins embrionários e organóides renais para o CAM. O fundo da membrana da inserção transwell modificada pressiona as amostras contra o CAM do frango e as mantém no lugar. As laterais da pastilha servem como reservatório para o meio de cultura que protege o enxerto da secagem. Xenoenxerto para ex ovo cultivado frango embrionário CAM é fortemente recomendado, pois este método expõe uma área maior do CAM onde o minireservatório pode ser colocado e facilita o acompanhamento visual do processo de vascularização12,13.
Uma desvantagem do método de cultura cam de frango é que a janela de tempo para a realização do xenotransplante é limitada aos 8-9 dias em que o CAM do embrião de frango funciona antes de começar a se degradar. Os enxertos que necessitam de um tempo maior para se desenvolver devem, portanto, ser vascularizados por xenotransplante para um tecido diferente (por exemplo, cápsula de rim de camundongos)6. O xenotransplante em série de tecido doador pode ser uma solução para este longo problema de tempo de incubação. O método poderia ser adaptado para imagens de lapso de tempo da vascularização e desenvolvimento do enxerto, mas primeiro deve ser abordado o requisito de estabilização do minireservatório e cam para imagens de longo prazo. A principal vantagem deste protocolo de xenotransplante renal melhorado para o CAM de frango é que o método fornece condições para que as células endoteliais derivadas do doador prosperem.
O protocolo FiZD descreve um método projetado para imagens de lapso de tempo de longo prazo de rins ex vivos embrionários e organóides renais usando microscopia confocal de alta resolução. Para a configuração é fundamental que as dimensões do poço e insiram correspondam. Quando um deslizamento de cobertura é colado na parte inferior de uma placa de 6 poços e a inserção é colocada no poço, a membrana da inserção deve tocar o vidro. Então, quando a cultura é criada, as contas do espaçador determinarão a posição da membrana e, consequentemente, a espessura do órgão ou organóide cultivado. Por essa razão, é fundamental remover o excesso de cola e verificar se nenhum material está restringindo a inserção de tocar no vidro da tampa. Também é importante usar cola de tecido não tóxico para prender o vidro da tampa. Observe que a cola não se prende muito fortemente, por isso é fundamental manusear as placas com cuidado. As placas podem ser reutilizadas, e se o vidro da tampa se desprender durante as etapas de lavagem, ele pode ser colado de volta.
O método de imagem FiZD permite o estudo da nefrogênese em um nível unicelular. A alta qualidade de imagens de lapso de tempo de alta resolução permite a aplicação de segmentação celular automatizada para estudar o comportamento celular em organóides renais e culturas renais. Várias amostras localizadas em diferentes poços de uma placa de 6 poços podem ser estudadas simultaneamente em diferentes condições de cultura. A técnica pode ser facilmente modificada para diferentes tamanhos e tipos de tecidos e organóides alterando o tamanho das contas espaçadoras; isso foi demonstrado com culturas de células ovarianas14. Como uma otimização adicional deste método, a combinação da configuração fizd com abordagens microfluidas recentemente publicadas16 pode ser altamente benéfica para a análise microscópica de alta resolução da morfogênese celular em estágios posteriores do desenvolvimento renal.
Uma vantagem do método FiZD é que há muito meio de cultura disponível e não é necessário alterá-lo durante a 1 semana de imagem. Ainda assim, se uma mudança de mídia for necessária, o meio pode ser facilmente alterado de uma abertura na parede da inserção. O método FiZD também é superior a outros métodos de cultura de órgãos, pois aproxima o espécime do objetivo do microscópio. Em outros métodos de cultura amplamente utilizados há uma membrana ou filtro e um fundo de placa de vidro entre a amostra de imagem e o objetivo, proibindo imagens precisas de alta resolução17. Com o método FiZD é possível adquirir imagens de alta resolução de tecidos vivos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Suomen Akatemia (Academia da Finlândia) (206038, 121647, 250900, 260056; Doação do Centro de Excelência 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Associação Finlandesa de Rim e Fígado, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Fundação Cultural Sueca na Finlândia, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Cancer Society of Finland), o Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013; subvenção FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) e H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937 Os autores agradecem a Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias e Hannele Härkman pela assistência técnica.
As figuras 3, 4 e Filme 2 são reimpressas com permissão do Desenvolvimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
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