Summary
斑马鱼异种移植模型允许在体内微环境中对人类癌细胞进行高通量药物筛选和荧光成像。我们使用配备自动化荧光显微镜的成像单元，为斑马鱼患者衍生白血病样本进行大规模的自动化药物筛查工作流程。
Abstract
患者衍生的异种移植模型对于定义不同癌症对体内系统药物治疗的反应至关重要。小鼠模型是该领域的标准，但斑马鱼已成为具有多种优势的替代模型，包括高通量和低成本药物筛选的能力。斑马鱼还允许在体内进行药物筛选，其复制数量较大，以前只能通过体外系统获得。快速执行大规模药物筛选的能力可能为个性化医学打开可能性，快速将结果翻译回临床。Zebrafish 异种移植模型还可用于根据针对靶向疗法的肿瘤反应快速筛选可操作突变，或从大型库中识别新的抗癌化合物。目前该领域的主要限制是量化和自动化这一过程，以便药物筛选能够更大规模地进行，减少劳动密集型。我们开发了一个工作流程，用于将原发性患者样本移植到斑马鱼幼虫中，并使用配备荧光显微镜的成像单元和自动取样器单元执行大规模药物筛选。该方法使移植肿瘤区域标准化和定量，对大量斑马鱼幼虫的药物治疗有反应。总体而言，该方法比传统细胞培养药物筛选具有优势，因为它允许肿瘤细胞在整个药物治疗过程中在体内环境中生长，并且比小鼠在体内大规模药物筛选中更实用、更经济。
Introduction
将原发性患者癌症或人类癌细胞系异种移植到模型生物体中，是一种广泛应用的技术，用于研究肿瘤进展和体内行为、肿瘤对药物治疗的反应以及癌细胞与微环境的相互作用等。传统上，细胞被异种移植到免疫受损的小鼠中，这仍然是该领域的标准。然而，该模型系统存在几个局限性，如成本高、复制数低、难以准确量化体内肿瘤负担，以及肿瘤移植和药物检测完成时间延长。近年来，斑马鱼已成为替代异种移植模型，第一次报告是在2005年，绿色荧光蛋白（GFP）标记的人类黑色素瘤细胞系移植到胚芽阶段胚胎11，2。2最近，2天受精后（dpf）斑马鱼幼虫已被用作异种移植受体，以控制注射的解剖位置，并在高分辨率内成像肿瘤与周围微环境33，4。4
斑马鱼作为异种移植模型具有许多优点。首先，成年斑马鱼可以以相对较低的成本大量栖息和快速繁殖。每对成斑马鱼每周可以产下数百条幼虫鱼。由于其体积小，这些幼虫斑马鱼可以保存在96孔板，用于高通量药物筛选。幼虫在典型的异种移植实验过程中不必喂食，因为它们的蛋黄囊为它们的第一周的生命提供了维持它们的营养。此外，斑马鱼在7 dpf之前没有功能齐全的免疫系统，这意味着它们不需要在异种移植注射之前进行辐照或免疫抑制疗法。最后，光学清晰的斑马鱼线允许对肿瘤-微环境相互作用进行高分辨率成像。
也许最有希望的应用斑马鱼作为异种移植模型是能够执行高通量药物筛选人类癌症样本的方式，这是不可能使用任何其他模型有机体。Larvae通过皮肤从水中吸收药物，提高药物管理的便利性。由于动物被保存在96孔板中，通常以100~300μL的水，因此与小鼠相比，屏幕所需的药物数量较少。目前，对斑马鱼药物对人类肿瘤负担的影响进行标准化和量化的方法有几种不同，其中一些方法比其它方法更实用，用于将单一药物检测扩展到高通量筛查。例如，一些组分离鱼成单细胞悬浮液，并通过成像悬浮液的单个液滴和使用半自动ImageJ宏4量化荧光来量化荧光标记或染色肿瘤细胞。研制了一种半自动全幼虫成像方法，将幼虫鱼固定在96孔板中，在重新排列合成图像和定量肿瘤细胞体6之前，使用倒置荧光显微镜进行成像。这两种检测都是相当劳动密集型的定量方法，这使得斑马鱼异种移植模型中真正高通量的药物筛选变得不切实际。
这一问题已经通过开发脊椎动物自动筛选技术（VAST）生物成像仪和大粒子（LP）采样器，荧光显微镜配备成像单元和自动取样器单元（图1和材料表），这是一个真正的自动化方法，高通量成像斑马鱼幼虫7,7，8，9。,9有了这个装置，鱼被麻醉，从96孔板自动取样，定位在毛细管中，并根据预设的用户偏好（成像）旋转成设定的方向，然后放回新的96孔板的同一孔中，以便进一步研究或丢弃。将这种成像技术与斑马鱼异种移植相结合，可以实现个性化药物的可能性，这种个性化药物使用大药物化合物库的高通量药物筛选来对抗单个患者肿瘤。斑马鱼异种移植物也提供了一种大规模和低成本的方法，用于测试体内新型化合物的毒性和功效。斑马鱼可以作为初步筛选步骤，然后再进入小鼠异种移植模型。
我们开发了一个简化的工作流程，用于将原发性患者白血病细胞移植到斑马鱼中，并执行高通量药物屏幕，通过自动成像和定量，可应用于任何其他原发性患者肿瘤细胞或癌细胞系。该工作流程利用荧光显微镜配备的成像单元和自动取样器单元，改进了目前的标准化和定量方法，并提供了一种自动化的替代方法，以取代以前更劳动密集型的体内肿瘤质量量化方法。
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Protocol
该协议中描述的所有程序均已获得肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（2015-2225 年协议）的批准。患者样本是在肯塔基大学机构审查委员会（第44672号议定书）下收集的。根据该协议进行的所有动物实验必须获得用户机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 解冻原发性患者急性淋巴细胞白血病细胞
- 在37°C水浴中解冻原体患者外周血单核细胞（PBMC）。细胞解冻后，立即将冷冻介质中的细胞（90% FBS = 10% 二甲基硫氧化物 [DMSO]）转移到具有缓慢移液的 15 mL 锥形管中，避免气泡。在Iscove的改良Dulbecco的介质[IMDM]中，将10 mL的预热37°C解冻介质（25%胎儿牛血清[FBS]）滴向15 mL锥形管中的细胞。<
注：在诊断时从患者血液样本中采集了PBMC。在 RPMI 1640 = 10% FBS 中，抛光涂层通过密度离心分离，细胞被洗涤 2 倍。细胞被计数，107个细胞在1 mL的冷冻介质中冷冻，并储存在-80°C。 - 离心细胞在100 x g下10分钟，从细胞颗粒中吸出介质。重复添加解冻介质、离心和吸入一次额外时间，以去除任何残留的DMSO。
- 重新悬浮5 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的细胞，并去除10μL，用于自动细胞计数器或血细胞计。将 10 μL 的锥色蓝色添加到 10 μL 的细胞中，取出进行计数。计算每 mL 的单元格数，然后记录以计算重新挂起细胞的体积以进行异种移植（参见步骤 2.5）。
注：通常，500个细胞是异种移植每幼虫斑马鱼。例如，需要5 x 105细胞来注射1，000条斑马鱼。可行性应为 >85%， 用于异种移植。在这个实验中，细胞在解冻后的可行性为96%，通过锥蓝色染色来评估。
2. 带 DiI 的荧光标记细胞
- 在 200 x g下将所需细胞数在 5 mL 的 PBS 中分离5分钟，并吸进上清液。在注射过程中结块或注针时出现问题时，至少染色 2 x 106细胞。
- 制作 1，1'-二氯酸酯-3，3'，3'-四甲基二甲苯胆酸（DiI）染色溶液（5 mL PBS，每 mL DiI 染色，材料表），并在染色溶液中重新悬浮细胞颗粒。
注：在染色溶液中重新悬浮时，细胞密度不应超过 2 x 106细胞/mL。 - 在37°C下孵育细胞，从光中保护20分钟，轻轻旋涡，然后在冰上孵育细胞15分钟，免受光的影响。
- 离心细胞在200 x g下5分钟，吸气上清。用5 mL PBS清洗细胞，在200 x g下离心5分钟，吸气上清剂。重复洗涤，离心，和吸入一次额外的时间。
- 每250，000个活细胞重新悬浮在1μL的PBS细胞中，并转移到1.5mL微离心管。在黑暗中将重新悬浮在冰上的细胞，并立即继续微注射。
注：这可确保将 500 个患者细胞注入斑马鱼，每个注射泵的容量为 2 nL。
3. 微注射斑马鱼幼鱼
注：显微注射应在染色1⁄3小时内完成，以提高细胞的生存能力。
- 在染色细胞和注射之前，将 25 mL 的 3% 琼脂花倒入培养皿中，使其凝固，使其凝固。在 4 °C 下存放板长达 2 周。
- 也是在染色细胞和注射之前，在解剖显微镜下使用钳子使用钳子的dechorionate2 dpf斑马鱼。对于手动多解，从斑马鱼的保护性鱼的两端用钳子拉，直到胆汁撕裂和斑马鱼变成未包10。
注：与前所述的10，也可以通过使用酶处理与普龙酶进行去角质化。卡斯珀（罗伊-/-----------------------------）斑马鱼被用于这些实验11。-/--/-任何斑马鱼幼虫菌株都可用于异种移植。如果色素干扰成像或可视化，如果光学上没有清晰的斑马鱼菌株，可以使用丙基霉素（PTU）处理来阻止黑色素合成。 - 在4°C或冰上预冷针，以防止在微注射过程中细胞结块。使用微装载机移液器尖端将 5 μL 的染色细胞加载到冷却的非纤维硅酸盐玻璃针中。
注：微注射剂和针头设置方法此前已发表13种。 - 将针头装入微喷针臂。使用无菌剃须刀刀片对针尖进行倾斜。使用级千分尺测量矿物油中的滴大小，使滴体积始终保持在 2 nL（±0.15 mm 直径）处。
- 使用350 μL的4mg/mL三环-S麻醉#30去麻醉2 dpf斑马鱼在含有25 mLE3介质的培养皿中。在+1分钟后将麻醉幼虫转移到平面注射板（在培养皿中为3%的阿甘松），并在所需的注射部位用一泵染色细胞注射幼虫（例如，蛋黄或心瓣;参见图2A，B）。
注：应根据实验目标选择注射位点。最常见的注射部位是蛋黄。为了使细胞在血液中循环，近心甲、Cuvier管道、围膜空间或逆轨道空间可用作注射部位。也可以使用正畸注射位点，如大脑。 - 将幼虫从注射板中洗掉，放入含有E3介质14的10厘米2培养皿（每盘30只幼虫），并在28°C下孵育1小时恢复期。继续注射，直到注射了所需数量的幼虫。
注：理想情况下，注射2~2.5倍的幼虫数量需要实验。由于注射压力和孵育温度升高，幼虫会部分死亡。通常，在使用该技术练习后，当应注射染色细胞时，单个人可以在1⁄3小时内注射800~1，500只斑马鱼幼虫。 - 将注射幼虫的板移至34°C孵化器。请勿将幼虫的培养皿直接放在培养箱的金属架子上，以防止E3水过热。例如，在猪的架子和幼虫的培养皿之间放置一个空的培养皿，作为缓冲器。注射后24小时和48小时后清除死斑马鱼幼虫（hpi）。
4. 设置与异种斑马鱼的药物屏幕
-
在48 hpi，屏幕斑马鱼幼虫荧光/肿瘤移植和健康（图2C，D）。去除任何死或畸形的斑马鱼，选择具有类似移植物的斑马鱼（图2C，D，1⁄3和1'+3'）。去除未移植的斑马鱼（图2C，D，5和5'）。
- 对于注入的鱼，去除在缠绕细胞质量周围看不到蛋黄边界的鱼（图2C，4），因为它使量化变得困难。对于注入鱼的食环，去除注射细胞质量侵入蛋黄囊的鱼（图2D，4'）。
- 将斑马鱼加入96孔的盘子中。为此，切断200μL移液器尖端的尖端，刚好足够大，可以容纳4 dpf斑马鱼。使用 P200 移液器从板中吸出 150 μL 的 E3 介质，并添加到平底 96 孔板的空井中。
- 稀释要在E3介质所需体积下测试的药物，每口井150μL。以所需浓度的2倍制备药物。例如，如果所需的最终浓度为 10 μM，则在 E3 中制备 20 μM 的药物，因为每个井中总体积的一半由药物溶液组成。对于 DMSO 控制组，添加与药物相同的体积的 DMSO。
- 在150μL E3中，在每口含有斑马鱼幼虫的油井中加入150 μL的2倍稀释药物溶液，最终体积为300μL，每口井有1倍药物溶液。
- 在34°C孵化板。每天检查死亡的斑马鱼。2天后，如果需要，从96孔板的每个孔中去除200μL的液体，并在E3介质中用200μL的1倍稀释药物溶液或DMSO代替，从而刷新药物。
注：在3天的药物治疗后，该实验找到了最好的结果;然而，药物治疗的长度可能相差2-4天，可能需要根据正在做的实验或正在使用的药物进行优化。
5. 使用荧光显微镜配备成像单元和自动取样器单元成像异种斑马鱼
- 准备 1 L 的新鲜 4 mg/mL 三叶草和 1.5 L 的 E3 介质。用 E3 介质和介质瓶 2 填充介质瓶 1，并加三环。
- 删除成像软件中所有不需要的荧光通道，并添加所需的通道（此实验的 DiI）。检查所需的荧光通道，因为图像将仅针对带有复选标记的通道。此外，选择如何拍摄图像（z 堆栈、自动化、串循环等）。
注：在本实验中，手动设置每个成像的鱼的对焦，以获得最佳对焦的最多图像数量。 - 在经过药物治疗的鱼之前对鱼进行成像，以便在成像软件中设置适当的曝光时间。设置曝光后，不要更改实验持续时间的曝光时间。
注：可以为每个斑马鱼手动调整对焦，以确保没有失焦图像，或者对于完全自动化成像，在进行分析之前，在丢弃对焦图像的鱼之间可以使用相同的对焦或重新成像鱼。此外，该实验可以使用任何荧光成像仪进行，然后使用ImageJ软件对荧光进行定量。
6. 使用图像J量化荧光
- 打开 ImageJ 软件。
-
转到文件 |打开并选择所需的 .czi 文件。该软件将打开一个导入选项窗口。
- 对于堆栈查看选择超堆栈，选中单独打开文件，选中自动缩放，并选中拆分通道。对于颜色选项，请选择"着色"。
- 单击插件|宏|记录。
- 单击图片|调整|阈值。在阈值窗口右侧的下拉菜单中，将图像类型选择为红色。调整最小阈值，直到软件仅突出显示荧光区域（图 3A），然后单击"应用"。该软件将照片转换为黑色和白色，所选区域为黑色。
注：对药物屏幕上的每个图像使用相同的阈值，以保持结果的标准化和可比性。 - 单击"分析" |测量.软件将拉出一个包含该图像的荧光区域的结果窗口。
- 单击"在宏记录器"窗口中创建。这将打开一个带有宏代码的新窗口。突出显示所有所需的图像进行分析，并像步骤 6.2 中一样打开。
- 选择使用宏在窗口中运行。结果窗口现在将包含每个图像的区域。
注：图像分析可以单独完成，而无需记录和运行宏，还可以为每个图像重复上述步骤。 - 将测量的数据复制到电子表格中。对所有控制 （DMSO） 样品的总荧光进行平均。使用以下公式计算百分比差异：[（平均 DMSO 面积 + 实验面积）/平均 DMSO 面积] x 100%（图 3B）。
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Representative Results
按照上述协议，斑马鱼在蛋黄和心外甲中异种，与原发性患者PBMC进行异化，这些PBMC最初在诊断时从T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者中分离出来，并作为一个可行的冷冻样本存存。在48 hpi，异种移植的鱼被筛选为荧光标记的肿瘤细胞（图2C，D），并治疗化疗（德塞米松或文西汀）或DMSO。鱼在7 dpi成像后，使用荧光显微镜配备成像装置和自动取样器装置进行3天的药物治疗（图3A）。
使用ImageJ对每只鱼进行荧光区/肿瘤负担测量，并比较不同的药物治疗组和DMSO（图3B）。总体而言，与经过处理的DMSO处理的鱼相比，用文西汀处理的异种移植鱼的异种移植物质量最大且最一致地减少。与文西汀相比，德塞米松处理的鱼的肿瘤面积减少了大约一半，但与DMSO相比，肿瘤面积仍然减少（图3）。这模仿了病人身上的发现，因为他们的白血病迅速回应了地塞米松和文西汀的组合疗法。这些结果表明，斑马鱼异种移植模型能够适应药物筛选和自动成像和定量，为测试不同药物或药物组合的各种患者样本或细胞系提供了一个平台。
图1：异种药物筛选和成像工作流程。异种移植斑马鱼幼虫和执行药物筛选的工作流程图解，包括荧光显微镜配备成像单元和自动取样器单元的成像。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：注射部位和筛选异种鱼的代表性图像。注射到2只dpf斑马鱼幼虫的蛋黄（A） 或心丝虫 （B） 的微注射针图像。2 dpi筛查的代表性图像描绘了为药物筛选（C， D） 选择的斑马鱼。应选择具有类似移植物（1+3 和 1'+3'）的斑马鱼，应去除未移植的斑马鱼（5 和 5'）。对于注入的鱼，去除在缠绕细胞质量（4）周围看不到蛋黄边界的鱼，因为它使量化变得困难。对于注射鱼的食环，去除注射细胞质量侵入蛋黄囊（4'）的鱼。比例尺 = 0.5 mm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图3：药物治疗可以减少体内异种移植肿瘤区域。使用DMSO或药物（即文西汀或地塞米松）治疗3天后，斑马鱼注射到近心鱼或蛋黄中的代表性图像。通过使用 ImageJ 设置荧光阈值、选择高于设定阈值的所有像素以及测量选定区域的面积和均荧光，对移植肿瘤质量的面积进行量化。高于所选阈值的像素以黑色显示，低于阈值的像素以白色显示。像素被测量在蛋黄和心外甲注入斑马鱼图像（A）。与DMSO控制相比，用文西汀治疗导致移植肿瘤面积减少，每组处理4条鱼（B）。SD = 标准差。比例尺 = 250 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
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Discussion
在这项研究中，我们展示了一种标准化的方法，将原发性患者白血病细胞解冻并注射到斑马鱼中，作为异种移植模型。我们还建立了一个协议，使用荧光显微镜配备成像单元和自动取样器单元，对异种移植斑马鱼进行高通量药物筛选。以前，异种移植物已经报告与人类细胞系，和定量异种移植肿瘤的高通量方式一直是该领域的挑战。该方法作为研究的基础，利用荧光显微镜配备成像单元和自动取样器单元作为自动成像异种斑马鱼的方法，最终目标是执行高通量药物屏幕，以预测特定患者的癌症可能响应哪些药物，为更个性化的药物开辟了可能性。
尽管能够自动执行大部分该协议，但仍有许多技术挑战不容忽视。首先，细胞在染色后尽快注射到斑马鱼中，以防止细胞结块和细胞死亡至关重要。在执行细胞染色协议之前，需要对幼虫进行脱化。在装针前，还应保持玻璃丝针的低温，以减少针堵塞。此外，使用6个月至1年的健康成年斑马鱼产生的胚胎对于确保异种移植幼虫的最佳生存能力至关重要。最后，应仔细筛选异种移植的鱼，以进行肿瘤移植，并且只有肿瘤体积相似的鱼才能用于药物筛选，以减少最终结果的变异性。
虽然我们使用原发性患者白血病PBMC进行实验，但此协议可以与任何肿瘤类型或癌细胞系一起执行。对于培养中的细胞系，在继续染色协议之前，应尝试和在PBS中洗涤粘附细胞。还必须注意，移植率可能因样本而异，在样本类型15之间有所不同。例如，在我们的PBMC样品中，>90% 的循环 PBMC 是白血病爆炸，但此数字可能因患者而异，这可能会影响移植率。由于结果与相同样本类型的 DMSO 控制进行比较，因此存在内控的移植率，因此在决定每只斑马鱼注射多少细胞时，应考虑这种变化。我们发现，使用每只动物注射的250~1，000个细胞是成功的，500个细胞是我们研究的最佳选择。虽然我们的实验在幼虫为7 dpf时得出结论，但我们不希望异种移植物在动物体内存活更长时间，因为免疫系统此时开始发育，并可能导致人类细胞的排斥。免疫受损的斑马鱼系已经形成，与prkdc-/--------il2rga-/---斑马-/-鱼能够移植人类癌细胞16，17，,17这可能有助于长期异种移植或评估肿瘤复发后药物治疗。然而，这些免疫缺陷线必须保持为异血虫，所以幼虫必须在使用前基因型。人间鱼还必须用药物来治疗，以耗尽巨噬细胞，以便可靠地移植人类细胞，这可能使药物筛选结果复杂化。目前，这些线既不实用，也没有必要对幼虫进行大规模的药物筛选，可以在免疫系统在7 dpf18完全功能之前完成。
我们的代表性结果侧重于将细胞注入心外卡和蛋黄，以方便和快速注射，提高生存能力;然而，癌细胞可以注射到许多其他解剖位置，我们已经成功地使用这个工作流程在其他地点，包括管的Cuvier，大脑，复古轨道，和围肠盐囊。此外，很难估计幼虫鱼吸收的每种药物中所吸收的量;如果使用的药物很少，理想情况下，在大规模测定之前将执行一个剂量范围（通常为0.1至25μM）的毒性筛查，以确定最大耐受剂量（MTD）。我们选择使用MTD用于我们的检测，但是，10 μM的药物通常用于斑马鱼场作为高通量药物筛选的起始浓度，通常耐受性良好。池中药物的组合也可以用作初始屏幕，通过大容量化合物库19提高筛选效率。
尽管这种方法比之前报告的工作流更加自动化和高效，但对于没有微注射斑马鱼经验的人来说，这仍然是一个劳动密集型且技术性高的协议。斑马鱼异种移植物中的药物筛选不可能达到化合物库体外筛选的简便性和有效性，而且缺乏小鼠异种移植模型的一些优点。例如，斑马鱼异种移植的一个主要限制是，在细胞库或大多数下游实验的有用数字进行异种移植后，无法轻易从鱼中取回癌细胞。即使这样，人类癌细胞也会在非生理温度和环境下生长数天，并且不适合以后的应用。略低于生理温度对药物动力学和肿瘤细胞反应的影响也不得而知，并可能产生混淆的结果。尽管有这些警告，斑马鱼异种移植确实填补了一个空白，是一个更实用和成本效益的方法，在体内药物筛选执行更大的规模比在小鼠异种移植模型。此外，斑马鱼异种移植物比小鼠模型需要的细胞要少得多，因此少量患者样本可以分布在数百至数千只斑马鱼中，从而允许具有大量样本的药物筛选。通过荧光标记，肿瘤细胞可以从它们被异种移植到幼虫斑马鱼的那一刻起进行监测，从而在药物屏幕中使用的动物之间提供一些标准化。将斑马鱼异种移植物的这些优势与移植细胞的自动成像和定量的可能性相结合，为使患者肿瘤的高通量药物筛查成为现实提供了许多可能性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了V基金会V学者奖和NIH资助DP2CA228043，R01CA227656（J.S.布莱克本）和NIH培训补助金T32CA165990（对M.G.哈尼）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
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