Summary
Zebrafish Xenograft-Modelle ermöglichen ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening und eine fluoreszierende Bildgebung menschlicher Krebszellen in einer in vivo Mikroumgebung. Wir haben einen Workflow für großangelegte, automatisierte Arzneimitteluntersuchungen an von Patienten abgeleiteten Leukämieproben in Zebrafischen mit hilfe einer automatisierten Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungseinheit entwickelt.
Abstract
Von Patienten abgeleitete Xenograft-Modelle sind entscheidend für die Definition, wie verschiedene Krebsarten auf die medikamentöse Behandlung in einem In-vivo-System reagieren. Mausmodelle sind der Standard auf dem Gebiet, aber Zebrafische haben sich als alternatives Modell mit mehreren Vorteilen herauskristallisiert, einschließlich der Fähigkeit für High-Throughput und Low-Cost-Drogen-Screening. Zebrafische ermöglichen auch in vivo-Arzneimittelscreenings mit großen Replikationszahlen, die bisher nur mit In-vitro-Systemen erhältlich waren. Die Fähigkeit, schnell großflächige Arzneimittel-Screens durchzuführen, kann die Möglichkeit für personalisierte Medizin mit schneller Übersetzung der Ergebnisse zurück in die Klinik eröffnen. Zebrafish Xenograft-Modelle könnten auch verwendet werden, um schnell auf umsetzbare Mutationen basierend auf Tumorreaktionen auf gezielte Therapien zu überprüfen oder um neue Krebsabwehrverbindungen aus großen Bibliotheken zu identifizieren. Die aktuelle Hauptbeschränkung in diesem Bereich war die Quantifizierung und Automatisierung des Prozesses, so dass Drogenbildschirme in größerem Maßstab durchgeführt werden können und weniger arbeitsintensiv sind. Wir haben einen Workflow für die Xenogtransplantation von primären Patientenproben in Zebrafischlarven und die Durchführung von großflächigen Medikamentensieben mit einer mit Fluoreszenzmikroskop ausgestatteten Bildgebungseinheit und einer automatisierten Probenehmereinheit entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Standardisierung und Quantifizierung des transplantierten Tumorbereichs und die Reaktion auf die medikamentöse Behandlung über eine große Anzahl von Zebrafischlarven. Insgesamt ist diese Methode vorteilhaft gegenüber dem herkömmlichen Zellkultur-Arzneimittel-Screening, da sie das Wachstum von Tumorzellen in einer In-vivo-Umgebung während der gesamten medikamentösen Behandlung ermöglicht und praktischer und kostengünstiger ist als Mäuse für groß angelegte In-vivo-Medikamenten-Screenings.
Introduction
Xenografting von Primärpatientenkrebs oder menschlichen Krebszelllinien in Modellorganismen ist eine weit verbreitete Technik zur Untersuchung der Tumorprogression und des Verhaltens in vivo, der Tumorreaktion auf die medikamentöse Behandlung und der Interaktion von Krebszellen mit der Mikroumgebung. Traditionell werden Zellen in immungeschwächte Mäuse gexpfropt, und dies bleibt der Standard auf dem Gebiet. Dieses Modellsystem hat jedoch mehrere Einschränkungen, wie hohe Kosten, niedrige Replikationszahlen, Schwierigkeiten bei der genauen Quantifizierung der Tumorbelastung in vivo und die längere Zeit, die es für die Transplantation von Tumoren und die Abgeschlossenheit von Medikamententests benötigt. In den letzten Jahren sind Zebrafische als alternatives Xenograft-Modell entstanden, wobei das erste im Jahr 2005 berichtet wurde, mit grünen fluoreszierenden Proteinen (GFP)-markierten menschlichen Melanomzelllinien, die in Blastula-Stadium-Embryonentransplantiertwurden 1,2. In jüngerer Zeit wurden 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischlarven als Xenograft-Empfänger verwendet, um die Kontrolle der anatomischen Injektionsortung zu ermöglichen und für den Einsatz in hochauflösender In-vivo-Bildgebung der Tumorinteraktion mit der umgebenden Mikroumgebung3,4.
Zebrafische bieten viele Vorteile als Xenograft-Modell. Erstens können erwachsene Zebrafische zu relativ geringen Kosten in großen Mengen untergebracht und gezüchtet werden. Jedes Paar erwachsener Zebrafische kann Hunderte von Larvenfischen pro Woche produzieren. Aufgrund ihrer geringen Größe können diese Larvenzebrafische in 96-Well-Platten für das Hochdurchsatz-Drogenscreening aufbewahrt werden. Larven müssen nicht im Rahmen eines typischen Xenograft-Experiments gefüttert werden, da ihr Eigelbsack die Nährstoffe liefert, um sie für ihre erste Lebenswoche zu erhalten. Darüber hinaus haben Zebrafische erst 7 dpf ein voll funktionsfähiges Immunsystem, was bedeutet, dass sie vor der Xenograft-Injektion keine Bestrahlung oder immunsuppressive Therapien benötigen. Schließlich ermöglichen optisch klare Zebrafischlinien eine hochauflösende Abbildung von Tumor-Mikro-Umgebungen.
Die vielleicht vielversprechendste Anwendung von Zebrafischen als Xenograft-Modell ist die Fähigkeit, drogenstarke Untersuchungen an menschlichen Krebsproben auf eine Weise durchzuführen, die mit keinem anderen Modellorganismus möglich ist. Larven absorbieren Medikamente aus dem Wasser durch die Haut, Verbesserung der Leichtigkeit der Medikamentenadministration5. Da Tiere in 96-Well-Platten gehalten werden, in der Regel in 100 bis 300 l Wasser, erfordern Sie kleinere Wirkstoffmengen im Vergleich zu Mäusen. Derzeit gibt es mehrere verschiedene Methoden zur Standardisierung und Quantifizierung der Wirkung von Medikamenten auf die menschliche Tumorbelastung bei Zebrafischen, von denen einige praktischer sind als andere für die Ausweitung einzelner Arzneimitteltests auf ein Hochdurchsatz-Screening. Einige Gruppen dissoziieren beispielsweise Fische in einzelzellige Suspensionen und quantifizieren fluoreszierend oder gefärbte Tumorzellen, indem sie einzelne Tröpfchen der Suspension bildgeben und die Fluoreszenz mit einem halbautomatischen ImageJ-Makro4quantifizieren. Es wurde ein halbautomatisches Ganzlarven-Bildgebungsverfahren entwickelt, bei dem Larvenfische in 96-Well-Platten fixiert und mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop vor der Neuausrichtung von zusammengesetzten Bildern und der Quantifizierung von Tumorzellfoci6abgebildet wurden. Beide Assays sind ziemlich arbeitsintensive Methoden zur Quantifizierung, die wirklich High-Throughput-Drogen-Screening in Zebrafisch Xenograft Modelle unpraktisch gemacht hat.
Dieses Problem wurde durch die Entwicklung der Wirbeltier-Automated Screening Technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, einer fluoreszenzmikroskopischen Bildgebungseinheit und automatisierten Probenehmereinheit (Abbildung 1 und Tabelle der Materialien) angegangen, die eine wirklich automatisierte Methode zur Hochdurchsatz-Bildgebung von Zebrafischlarven7,8,9ist. Mit dieser Einheit werden Fische beäpftisiert, automatisch aus einer 96-Well-Platte entnommen, in einer Kapillare positioniert und auf der Grundlage einer voreingestellten Benutzerpräferenz in die eingestellte Ausrichtung gedreht, abgebildet und dann entweder für weitere Studien in den gleichen Brunnen einer neuen 96-Well-Platte gelegt oder verworfen. Die Kombination dieser bildgebenden Technologie mit Zebrafisch-Xenografts kann die Möglichkeit einer personalisierten Medizin ermöglichen, die ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening großer Arzneimittelbibliotheken gegen einzelne Patiententumoren verwendet. Zebrafish Xenografts bieten auch eine groß angelegte und kostengünstige Methode zur Prüfung sowohl der Toxizität als auch der Wirksamkeit neuartiger Verbindungen in vivo. Zebrafische können als vorderer Screening-Schritt verwendet werden, bevor Sie zu Maus-Xenograft-Modellen übergehen.
Wir haben einen optimierten Workflow für die Xenogtransplantation von primären Leukämiezellen von Patienten in Zebrafische entwickelt und durchführen hochdurchsatzige Arzneimittelbildschirme mit automatisierter Bildgebung und Quantifizierung, die auf alle anderen primären Tumorzellen oder Krebszelllinien angewendet werden können. Dieser Workflow nutzte eine mit Fluoreszenzmikroskop ausgestattete Bildgebungseinheit und eine automatisierte Probenehmereinheit, um aktuelle Standardisierungs- und Quantifizierungsmethoden zu verbessern und bietet eine automatisierte Alternative zu früheren, arbeitsintensiveren Methoden zur Quantifizierung der Tumormasse in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Kentucky (Protokoll 2015-2225) genehmigt. Patientenproben wurden im Rahmen des Institutional Review Board der University of Kentucky (Protokoll 44672) gesammelt. Alle Tierversuche, die nach diesem Protokoll durchgeführt werden, müssen vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss des Benutzers genehmigt werden.
1. Auftauen primärer Patient akute lymphoblastische Leukämiezellen
- Thaw Primärpatienten periphere Blut mononukleäre Zellen (PBMCs) aus gefrorenem Vorrat in einem 37 °C Wasserbad. Unmittelbar nach dem Auftauen der Zellen übertragen Die Zellen in ihren Gefriermedien (90% FBS + 10% Dimethylsulfoxid [DMSO]) auf ein 15 ml konisches Rohr mit langsamer Pipettierung, wodurch Luftblasen vermieden werden. 10 ml vorgewärmte 37 °C Auftaumedien (25% fetales Rinderserum [FBS] in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium [IMDM]) tropfenweise (ca. 2x3 s pro ml) zu den Zellen in der 15 ml konischen Röhre hinzufügen.
HINWEIS: PBMCs wurden zum Zeitpunkt der Diagnose aus Blutproben des Patienten entnommen. Das buffy Fell wurde durch Dichtezentrifugation getrennt und Zellen wurden 2x in RPMI 1640 + 10% FBS gewaschen. Die Zellen wurden gezählt und 107 Zellen wurden pro Kryovial in 1 ml Gefriermedium eingefroren und bei -80 °C gelagert. - Zentrifugenzellen bei 100 x g für 10 min und Saugmedien aus dem Zellpellet. Wiederholen Sie die Zugabe von Taumedien, Zentrifugation und Aspiration ein weiteres Mal, um restliche DMSO zu entfernen.
- Zellen in 5 ml phosphatgepufferter Saline (PBS) wieder aufsetzen und 10 l entfernen, um auf einen automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer zu zählen. Fügen Sie 10 l Trypan blau zu 10 l der Zellen, die zur Zählung entfernt werden, hinzu. Anzahl der Zellen pro ml und Datensatz, um später das Volumen zu berechnen, um Zellen für die Xenogierung wieder auszusetzen (siehe Schritt 2.5).
HINWEIS: Typischerweise werden 500 Zellen pro Larvenzebrafisch xenografted. Zum Beispiel werden 5 x 105 Zellen benötigt, um 1.000 Zebrafische zu injizieren. Die Lebensfähigkeit sollte >85% für Xenografting verwendet werden. In diesem Experiment betrug die Zelllebensfähigkeit 96 % nach dem Auftauen, bewertet durch Trypanblaufärbung.
2. Fluoreszierende Zellen mit DiI
- Zentrifugieren Sie die gewünschte Zellzahl in 5 ml PBS bei 200 x g für 5 min und aspirieren Sie überstand. Bei Verklumpung oder Problemen beim Beladen der Nadel während der Injektion mindestens 2 x 106 Zellen färben.
- 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin (DiI) Färbungslösung (5 ml PBS mit 4 l l pro ml DiI-Färbung, Materialtabelle)herstellen und das Zellpellet in der Färbelösung wieder aufhängen.
HINWEIS: Die Zelldichte sollte 2 x 106 Zellen/ml nicht überschreiten, wenn sie in der Färbelösung resuspendiert wird. - Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C 20 min vor Licht geschützt, wirbeln Sie sanft, dann brüten Sie Zellen auf Eis für 15 min vor Licht geschützt.
- Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min und Aspirat Überstand. Waschzellen mit 5 ml PBS, Zentrifuge bei 200 x g für 5 min und Aspirat-Überstand. Waschen, Zentrifugieren und Aspiration ein weiteres Mal wiederholen.
- Die Zellen in 1 L PBS pro 250.000 lebenden Zellen wieder aufsetzen und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Resuspendierte Zellen im Dunkeln auf Eis halten und sofort mit Mikroinjektionen fortfahren.
HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass mit jeder Injektionspumpe mit 2 nL Volumen 500 Patientenzellen in den Zebrafisch injiziert werden.
3. Mikroinjizierende Zebrafischlarven
HINWEIS: Mikroinjektionen sollten innerhalb von 1-3 h Färbung abgeschlossen werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.
- Vor dem Färben von Zellen und Der Injektion, machen Agarose-Platten für die Injektion durch Gießen 25 ml 3% Agarose in 1x Tris/borate/EDTA (TBE) in eine Petrischale und lassen Sie es verfestigen. Platten bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.
- Auch vor der Färbung von Zellen und Injektion, Dechorionate 2 dpf Zebrafische mit Zangen unter einem Sezieren Mikroskop. Für die manuelle Dechorionation ziehen Sie von den gegenüberliegenden Enden der schützenden Chorion des Zebrafisches mit Zangen, bis der Chorion reißt und der Zebrafisch wird ungehüllt10.
HINWEIS: Die Dechorionation kann auch mit enzymatischer Behandlung mit Pronase durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben10. Casper (roy-/-;nacre-/-) Zebrafische wurden für diese Experimente verwendet11. Jeder Zebrafisch Larvenstamm kann für Xenografting verwendet werden. Wenn Pigment die Bildgebung oder Visualisierung stört, kann die Propylthiouracil -Behandlung (PTU) verwendet werden, um die Melaninsynthese zu blockieren, wenn optisch klare Zebrafischstämme nicht verfügbar sind12. - Prechill-Nadeln bei 4 °C oder auf Eis, um das Verklumpen von Zellen während der Mikroinjektion zu verhindern. Mit Mikrolader-Pipettenspitzen 5 L der gebeizten Zellen in eine gekühlte, nichtfilamentöse Borosilikat-Glasnadel geben.
HINWEIS: Mikroinjektor- und Nadeleinrichtungsmethoden wurden bereits veröffentlicht13. - Laden Sie die Nadel in den Mikroinjektorarm. Verschrägen Sie die Nadelspitze mit einer sterilen Rasierklinge. Messen Sie die Tröpfchengröße in Mineralöl mit einem Bühnenmikrometer, wobei das Tröpfchenvolumen konstant bei 2 nL (durchmesser 0,15 mm) bleibt.
- Verwenden Sie 350 l von 4 mg/ml Tricain-S, um 30 dechorionierte 2 dpf Zebrafische in einer Petrischale mit 25 ml E3-Medien zu anästhesieren. Nach 1 min anästhesierte Larven auf eine flacher Injektionsplatte (3% Agarose in einer Petrischale) übertragen und Larven mit einer Pumpe von gebeizten Zellen an der gewünschten Injektionsstelle (z.B. das Eigelb oder das Perikard) injizieren; siehe Abbildung 2A,B).
HINWEIS: Die Injektionsstelle sollte auf der Grundlage des Ziels des Experiments ausgewählt werden. Die häufigste Injektionsstelle ist das Eigelb. Um Zellen im Blutkreislauf zirkulieren zu lassen, kann das Perikard, der Kanal von Cuvier, der Perivitelinraum oder der retroorbitale Raum als Injektionsstellen verwendet werden. Orthotopische Injektionsstellen können auch verwendet werden, wie das Gehirn. - Larven von der Injektionsplatte in eine 10 cm2 Petrischale (30 Larven pro Platte) mit E3-Medien14 ohne Methylenblau waschen und bei 28 °C für eine Erholungszeit von 1 h inkubieren. Setzen Sie die Injektion fort, bis eine gewünschte Anzahl von Larven injiziert wurde.
HINWEIS: Im Idealfall injizieren Sie 2-2,5-fache Anzahl von Larven, die für Experimente benötigt werden. Es wird einige Absterben von Larven aufgrund von Stress durch Injektion und die erhöhte Inkubationstemperatur. Typischerweise können nach dem Üben mit der Technik 800 bis 1.500 Zebrafischlarven von einer einzigen Person innerhalb der 1 x 3 h injiziert werden, wenn gefärbte Zellen injiziert werden sollten. - Platten von injizierten Larven in einen 34 °C-Inkubator verschieben. Legen Sie die Petrischalen der Larven nicht direkt auf ein Metallregal im Brutkasten, um eine Überhitzung des E3-Wassers zu verhindern. Legen Sie beispielsweise eine leere Petrischale zwischen das Regal und die Petrischale von Larven, um als Puffer zu fungieren. Entfernen Sie tote Zebrafischlarven nach 24 und 48 Stunden nach der Injektion (hpi).
4. Einrichten von Drogen-Bildschirm mit Xenografted Zebrafish
-
Bei 48 PSi, Sieb ZebrafischLarven für Fluoreszenz/Tumor-Engraftment und Gesundheit(Abbildung 2C,D). Entfernen Sie alle toten oder missgebildeten Zebrafische und wählen Sie Zebrafische mit ähnlicher Vermehrung aus(Abbildung 2C, D, 13 und 1''3'). Entfernen Sie nicht transplantierte Zebrafische(Abbildung 2C, D, 5 und 5').
- Entfernen Sie bei injizierten Fischen Fische, bei denen die Grenzen des Dotters nicht um die transplantierte Zellmasse herum gesehen werden können(Abbildung 2C, 4), da dieQuantifizierung erschwert wird. Entfernen Sie bei perikardinjiziertem Fisch Fische, wenn die injizierte Zellmasse in den Eigelbsack eindringt(Abbildung 2D, 4').
- Zebrafisch zu einer 96-Well-Platte hinzufügen. Schneiden Sie dazu die Spitze einer 200-L-Pipette-Spitze ab, die gerade groß genug ist, damit ein 4 dpf Zebrafisch durchpasst. Mit einer P200-Pipette 150 l E3-Medien mit einem Zebrafisch von der Platte ansaugen und zu einem leeren Brunnen einer flachen 96-Well-Platte hinzufügen.
- Verdünnen Sie das zu prüfende Medikament in der erforderlichen Menge an E3-Medien bei 150 l pro Brunnen. Bereiten Sie das Medikament mit der 2-fachen der gewünschten Konzentration vor. Bereiten Sie z. B. 20 M Medikament in E3 vor, wenn die gewünschte Endkonzentration 10 m beträgt, da die Hälfte des Gesamtvolumens in jedem Brunnen aus der Arzneimittellösung besteht. Für die DMSO-Kontrollgruppe DMSO im gleichen Volumen wie das Medikament hinzufügen.
- Fügen Sie jedem Brunnen, der Zebrafischlarven enthält, 150 l 2x verdünnte Arzneimittellösung in 150 l E3 zu, für ein Endvolumen von 300 l mit 1x Medikamentenlösung pro Bohrgut.
- Inkubieren Sie die Platte bei 34 °C. Überprüfen Sie täglich nach toten Zebrafischen. Nach 2 Tagen, falls gewünscht, das Medikament erfrischen, indem Sie 200 l Flüssigkeit aus jedem Brunnen der 96-Well-Platte entfernen und durch 200 l 1x verdünnte Arzneimittellösung oder DMSO in E3-Medien ersetzen.
HINWEIS: Die besten Ergebnisse wurden nach 3 Tagen der medikamentösen Behandlung für dieses Experiment gefunden; jedoch kann die Dauer der medikamentösen Behandlung zwischen 2-4 Tagen variieren und muss möglicherweise optimiert werden, basierend auf dem Experiment, das durchgeführt wird oder Drogen verwendet werden.
5. Bildgebung Xenografted Zebrafish mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgestattet Imaging Unit und automatisierte Sampler-Einheit
- Bereiten Sie 1 L frisches 4 mg/ml Tricain und 1,5 l E3-Medien vor. Medienflasche 1 mit E3-Medien und Medienflasche 2 mit Tricain füllen.
- Entfernen Sie alle unerwünschten Fluoreszenzkanäle in der Bildverarbeitungssoftware und fügen Sie den gewünschten Kanal hinzu (DiI für dieses Experiment). Überprüfen Sie den gewünschten Fluoreszenzkanal, da ein Bild nur für die Kanäle mit einem Häkchen aufgenommen wird. Wählen Sie auch aus, wie die Bilder aufgenommen werden sollen (Z-Stacks, Automatisierung, Loops in Reihe usw.).
HINWEIS: Für dieses Experiment wurde der Fokus manuell für jeden abgebildeten Fisch festgelegt, um die höchste Anzahl von Bildern mit optimalem Fokus zu erhalten. - Stellen Sie sich die DMSO-Kontrollfische vor den medikamentösen Fischen vor, so dass die entsprechende Belichtungszeit in der Bildgebungssoftware eingestellt werden kann. Ändern Sie nach der Einstellung der Belichtung sendeZeit die Belichtungszeit für die Dauer des Experiments nicht.
HINWEIS: Der Fokus kann entweder manuell für jeden Zebrafisch angepasst werden, um sicherzustellen, dass es keine nicht mehr fokussierten Bilder gibt, oder für eine vollautomatische Bildgebung kann derselbe Fokus zwischen Fischen verwendet werden, bei denen Bilder a-fokus-Bilder verworfen oder Fische vor der Analyse neu abgebildet werden. Darüber hinaus könnte dieses Experiment mit einer beliebigen fluoreszierenden Bildrin durchgeführt werden, gefolgt von der Quantifizierung der Fluoreszenz mit der ImageJ-Software.
6. Fluoreszenzquantifizieren mit ImageJ
- Öffnen Sie die ImageJ-Software.
-
Gehen Sie zu Datei | Öffnen Sie die gewünschte .czi-Datei, und wählen Sie sie aus. Die Software öffnet ein Importoptionen-Fenster.
- Für die Stapelanzeige wählen Sie Hyperstacks, überprüfen Sie Dateien einzeln öffnen, aktivieren Sie Autoscale, und aktivieren Sie Split Channels. Wählen Sie für die Farboption Farbige.
- Klicken Sie auf Plugins | Makros | Datensatz.
- Klicken Sie auf Bild | Anpassen | Schwellenwert. Wählen Sie den Bildtyp rot im Dropdown-Menü auf der rechten Seite des Schwellenwertfensters aus. Passen Sie den Mindestschwellenwert an, bis die Software nur Bereiche mit Fluoreszenz hervorhebt (Abbildung 3A) und klicken Sie auf Anwenden. Die Software konvertiert das Foto in Schwarzweiß, wobei der ausgewählte Bereich schwarz ist.
HINWEIS: Verwenden Sie den gleichen Schwellenwert für jedes Bild im Arzneimittelbildschirm, um die Ergebnisse standardisiert und vergleichbar zu halten. - Klicken Sie auf Analysieren | Maßnahme. Die Software zieht ein Ergebnisfenster hoch, das den fluoreszierenden Bereich für dieses Bild enthält.
- Klicken Sie im Makro-Recorder-Fenster auf Erstellen. Dadurch wird ein neues Fenster mit dem Code für das Makro geöffnet. Markieren Sie alle gewünschten Bilder für die Analyse und öffnen Sie sie wie in Schritt 6.2.
- Wählen Sie Ausführen im Fenster mit dem Makro aus. Das Ergebnisfenster enthält nun den Bereich für jedes Bild.
HINWEIS: Die Bildanalyse kann einzeln ohne Aufnahme und Ausführung eines Makros sowie durch Wiederholen der obigen Schritte für jedes Bild durchgeführt werden. - Kopieren Sie die gemessenen Daten in eine Kalkulationstabelle. Durchschnittlich die Gesamtfluoreszenz aller Kontrollproben (DMSO). Berechnen Sie die prozentuale Differenz nach folgender Formel: –[(durchschnittliche DMSO-Fläche – Versuchsfläche)/durchschnittliche DMSO-Fläche] x 100% (Abbildung 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurden Zebrafische bei der Diagnose in das Eigelb und Perikard mit primären Patienten-PBMCs xenografiert, die ursprünglich von einem T-Zell-Patienten der akuten lymphatischen Leukämie (T-ALL) isoliert wurden, und als lebensfähige, gefrorene Probe gebrandmarkt. Bei 48 PSi wurden xenografierte Fische auf fluoreszierend markierte Tumorzellen untersucht (Abbildung 2C,D) und mit Chemotherapie (Dexamethason oder Vincristin) oder DMSO behandelt. Fische wurden bei 7 dpi abgebildet, nach 3 Tagen auf Drogenbehandlung mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgestattet Bildgebungseinheit und automatisierte Probenahmeeinheit(Abbildung 3A).
Die fluoreszierende Flächen-/Tumorbelastung wurde für jeden mit ImageJ abgebildeten Fisch gemessen und zwischen den verschiedenen medikamentösen Behandlungsgruppen und DMSO verglichen (Abbildung 3B). Insgesamt zeigten xenografierte Fische, die mit Vincristin behandelt wurden, die größte und beständigste Abnahme der xenografierten Zellmasse im Vergleich zu DMSO-behandelten Fischen. Dexamethason behandelte Fische zeigten etwa die Hälfte der Reduktion der Tumorfläche im Vergleich zu Vincristin, zeigten aber immer noch eine Reduktion des Tumorbereichs im Vergleich zu DMSO (Abbildung 3). Dies imitierte, was beim Patienten gesehen wurde, da ihre Leukämie schnell auf die Therapie mit einer Kombination aus Dexamethason und Vincristin reagierte. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von Zebrafisch-Xenograft-Modellen, für Dasdrug Screening und automatisierte Bildgebung und Quantifizierung zugänglich zu sein und eine Plattform für die Prüfung verschiedener Patientenproben oder Zelllinien mit verschiedenen Medikamenten oder Medikamentenkombinationen zu bieten.
Abbildung 1: Xenograft-Arzneimittelbildschirm und Imaging-Workflow. Schematisch erdender Arbeitsablauf für Xenografting-Zebrafischlarven und Durchführung von Medikamentenbildschirmen, einschließlich Bildgebung auf einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Bildeinheit ausgestattet ist, und einer automatisierten Probenehmereinheit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Injektionsstelle und repräsentative Bilder von xenografierten Fischen. Bilder der Mikroinjektornadel zum Zeitpunkt der Injektion in das Eigelb (A) oder Perikard (B) von 2 dpf Zebrafischlarven. Repräsentative Bilder des Screenings bei 2 dpi zeigen die Auswahl von Zebrafischen für Drogen-Bildschirm (C,D). Zebrafische mit ähnlicher Engraftmentierung (1,3 und 1'3') sollten ausgewählt werden, untransplantierte Zebrafische (5 und 5') sollten entfernt werden. Entfernen Sie bei injizierten Fischen Fische, bei denen die Grenzen des Dotters um die transplantierte Zellmasse (4) nicht zu sehen sind, da diequantifizierung dadurch erschwert wird. Für perikardinjizierte Fische, entfernen Sie Fische, wo injizierte Zellmasse in den Dottersack eindringt (4'). Maßstabsleiste = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die medikamentöse Behandlung kann den xenotransplantierten Tumorbereich in vivo reduzieren. Repräsentative Bilder von Zebrafischen, die nach 3 Tagen Behandlung mit DMSO oder Medikamenten, entweder Vincristin oder Dexamethason, in das Perikard oder Eigelb injiziert werden. Die Fläche der transplantierten Tumormasse wurde quantifiziert, indem ein Fluoreszenzschwellenwert mithilfe von ImageJ festgelegt, alle Pixel über dem festgelegten Schwellenwert ausgewählt und die Fläche und die mittlere Fluoreszenz der ausgewählten Regionen gemessen wurden. Pixel über dem ausgewählten Schwellenwert werden schwarz angezeigt, während Pixel unterhalb des Schwellenwerts weiß angezeigt werden. Pixel wurden sowohl in den Injizium und Perikard injizierten Zebrafischbildern gemessen (A). Die Behandlung mit Vincristin führte zu einer Abnahme des transplantierten Tumorbereichs im Vergleich zur DMSO-Kontrolle mit n = 4 behandelten Fischen pro Gruppe (B). SD = Standardabweichung. Maßstabsleiste = 250 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dieser Studie haben wir eine standardisierte Methode zum Auftauen und Einspritzen von primären Leukämiezellen bei Patienten in Zebrafische als Xenograft-Modell demonstriert. Wir haben auch ein Protokoll für das Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening von xenografierten Zebrafischen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Bildgebungseinheit und einer automatisierten Probenehmereinheit erstellt. Bisher wurden Xenografts mit menschlichen Zelllinien berichtet, und die Quantifizierung von xenografted Tumoren in einer Hochdurchsatz-Manier war eine Herausforderung auf dem Gebiet. Diese Methode dient als Grundlage für Studien zur Nutzung einer mit Fluoreszenzmikroskop ausgestatteten Bildgebungseinheit und einer automatisierten Probenehmereinheit als Möglichkeit zur Automatisierung der Bildgebung von xenografierten Zebrafischen, mit dem ultimativen Ziel, hochdurchsatzige Arzneimittel-Screens durchzuführen, um vorherzusagen, auf welche Medikamente der Krebs eines bestimmten Patienten reagieren kann, was die Möglichkeit für eine personalisiertere Medizin eröffnet.
Trotz der Fähigkeit, einen Großteil dieses Protokolls zu automatisieren, gibt es immer noch viele technische Herausforderungen, die nicht übersehen werden sollten. Erstens ist es wichtig, dass Zellen so schnell wie möglich nach der Färbung in Zebrafische injiziert werden, um Zellverklumpung und Zelltod zu verhindern. Larven müssen vor der Durchführung des Zellfärbeprotokolls dechorioniert werden. Glasfilamentnadeln sollten auch vor dem Beladen der Nadel kalt gehalten werden, um die Nadelverstopfung zu reduzieren. Darüber hinaus ist die Verwendung von Embryonen, die von gesunden erwachsenen Zebrafischen im Alter von 6 Monaten bis 1 Jahr produziert werden, entscheidend, um die beste Lebensfähigkeit von xenografted Larven zu gewährleisten. Schließlich sollten xenografierte Fische sorgfältig auf Tumortransplantation untersucht werden, und nur solche mit ähnlichen Tumorvolumina sollten im Arzneimittelscreening verwendet werden, um die Variabilität in den Endergebnissen zu reduzieren.
Obwohl wir primäre Patient Leukämie PBMCs für unsere Experimente verwendet haben, kann dieses Protokoll mit jedem Tumortyp oder Krebszelllinie durchgeführt werden. Bei Zelllinien in der Kultur sollten anhaftende Zellen versucht und dann in PBS gewaschen werden, bevor sie mit dem Färbeprotokoll fortfahren. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Einpfropfraten von einer Stichprobe zur nächsten und zwischen den Stichprobentypen15variieren können. In unserer PBMC-Probe waren beispielsweise >90% der zirkulierenden PBMCs leukämische Explosionen, aber diese Zahl kann von Patient zu Patient erheblich variieren, was sich auf die Transplantationsrate auswirken kann. Da die Ergebnisse mit einem DMSO-Steuerelement innerhalb desselben Stichprobentyps verglichen werden, gibt es eine interne Kontrolle für die Engraftmentrate, aber diese Variation sollte bei der Entscheidung berücksichtigt werden, wie viele Zellen pro Zebrafisch injiziert werden sollen. Wir haben Erfolg bei der Verwendung von 250 bis 1.000 Zellen pro Tier injiziert, wobei 500 optimal für unsere Studien sind. Während unsere Experimente endeten, wenn Larven 7 dpf waren, würden wir nicht erwarten, dass Xenografts bei den Tieren länger überleben, da das Immunsystem an diesem Punkt zu entwickeln beginnt und wahrscheinlich eine Abstoßung menschlicher Zellen verursachen würde. Immungeschwächte Zebrafischlinien wurden erstellt, mit prkdc-/-;il2rga-/- Zebrafischen, die in der Lage sind, menschliche Krebszellen zu verfestigen16,17, die für längerfristige Xenografts oder die Beurteilung des Tumorrezidivs nach medikamentöser Behandlung nützlich sein können. Diese immundefizienten Linien müssen jedoch als Heterozygoten beibehalten werden, so dass Larven vor der Verwendung genotypisiert werden müssen. Homozygote Fische müssen auch mit Medikamenten behandelt werden, um Makrophagen zu erschöpfen, um eine zuverlässige Engraftmentierung menschlicher Zellen zu ermöglichen, was die Ergebnisse des Arzneimittelscreenings erschweren kann. Derzeit sind diese Linien weder praktisch noch notwendig für großangelegtes Arzneimittelscreening an Larven, das abgeschlossen werden kann, bevor das Immunsystem bei 7 dpf18voll funktionsfähig ist.
Unsere repräsentativen Ergebnisse konzentrieren sich auf die Injektion von Zellen in das Perikard und Eigelb für eine einfache und Geschwindigkeit der Injektion und erhöhte Lebensfähigkeit; Krebszellen können jedoch in viele andere anatomische Orte injiziert werden, und wir hatten Erfolg mit diesem Workflow an anderen Standorten, einschließlich des Kanals von Cuvier, Gehirn, Retro-Orbital und dem Perivitelline-Sac. Darüber hinaus ist es schwierig abzuschätzen, wie viel von jedem Medikament die Larvenfische absorbieren; Wenn nur wenige Medikamente verwendet werden, wird idealerweise ein Toxizitäts-Screen in einem Dosisbereich (in der Regel 0,1 bis 25 M) vor dem groß angelegten Test durchgeführt, um die maximal tolerierte Dosis (MTD) zu bestimmen. Wir haben uns entschieden, die MTD für jedes Medikament für unseren Test zu verwenden, jedoch werden 10 M Medikament häufig im Zebrafischfeld als Startkonzentration für das Hochdurchsatz-Drogenscreening verwendet und sind im Allgemeinen gut verträglich. Kombinationen von Medikamenten in Pools können auch als Erstbildschirm verwendet werden, um die Effizienz des Screenings durch eine großvolumige Zusammengesetzte Bibliothek zu erhöhen19.
Obwohl dieser Ansatz automatisierter und effizienter ist als bisher gemeldete Workflows, ist dies immer noch ein arbeitsintensives und technisch anspruchsvolles Protokoll für alle, die keine Vorerfahrung in der Mikroinjektion von Zebrafischen haben. Das Arzneimittelscreening bei Zebrafisch-Xenografts wird wahrscheinlich nie die Leichtigkeit und Wirksamkeit des In-vitro-Screenings von ZusammengesetztenBibliotheken erreichen und es fehlen einige Vorteile von Maus-Xenograft-Modellen. Eine wichtige Einschränkung bei Zebrafisch-Xenografts ist beispielsweise, dass Krebszellen nach der Xenografting-Xenogonion nicht ohne weiteres aus Fischen entnommen werden können, und das zu nützlichen Zahlen für das Zellbanking oder die meisten nachgelagerten Experimente. Selbst wenn dies möglich wäre, hätten die menschlichen Krebszellen mehrere Tage lang in nicht-physiologischen Temperaturen und Umgebungen gealtert und wären für den Einsatz in späteren Anwendungen nicht praktikabel. Die Auswirkungen einer etwas niedrigeren als physiologischen Temperatur auf die Arzneimittelkinetik und tumorzellige Reaktion sind ebenfalls nicht bekannt und können verwirrende Ergebnisse hervorrufen. Trotz dieser Vorbehalte füllen Zebrafisch-Xenografts eine Lücke, indem sie eine praktischere und kostengünstigere Methode zur Durchführung von in vivo-Medikamenten-Bildschirmen größeren Maßstäben darstellen, als dies bei Maus-Xenograft-Modellen möglich ist. Darüber hinaus benötigen Zebrafisch-Xenografts viel weniger Injektionszellen als Mausmodelle, so dass eine kleine Menge an Patientenproben unter Hunderten bis Tausenden von Zebrafischen verteilt werden kann, was Drogen-Screens mit großen Probenzahlen ermöglicht. Mit fluoreszierender Kennzeichnung können Tumorzellen von dem Moment an überwacht werden, in dem sie in den Larvenzebrafisch gexpfropft werden, was eine gewisse Standardisierung zwischen den Tieren bietet, die in Drogen-Screens verwendet werden. Die Kombination dieser Vorteile von Zebrafisch-Xenografts mit der Möglichkeit der automatisierten Bildgebung und Quantifizierung von transplantierten Zellen eröffnet viele Möglichkeiten, das hochdurchsatzige Arzneimittelscreening von Patiententumoren für die personalisierte Medizin Wirklichkeit werden zu lassen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch einen V Foundation V Scholar Award und NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (zu J.S. Blackburn) und NIH Training Grant T32CA165990 (an M.G. Haney) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
