Summary
Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.
Abstract
Patiënt afgeleide xenograft modellen zijn van cruciaal belang bij het definiëren van hoe verschillende vormen van kanker reageren op medicamenteuze behandeling in een in vivo systeem. Muis modellen zijn de standaard in het veld, maar zebravis zijn ontstaan als een alternatief model met verschillende voordelen, waaronder de mogelijkheid voor high-throughput en low-cost drug screening. Zebravissen maken ook in vivo drug screening met grote repliceren nummers die voorheen alleen verkrijgbaar waren met in vitro systemen. De mogelijkheid om snel uit te voeren grootschalige drug schermen kan openen de mogelijkheid voor gepersonaliseerde geneeskunde met een snelle vertaling van de resultaten terug naar de kliniek. Zebrafish xenograft modellen kunnen ook worden gebruikt om snel te screenen op bruikbare mutaties op basis van tumor respons op gerichte therapieën of om nieuwe anti-kanker verbindingen uit grote bibliotheken te identificeren. De huidige grote beperking in het veld is het kwantificeren en automatiseren van het proces, zodat drug schermen kunnen worden gedaan op grotere schaal en minder arbeidsintensief. We hebben een workflow ontwikkeld voor het xenograften van primaire patiëntmonsters in zebravissenlarven en het uitvoeren van grootschalige drugsschermen met behulp van een met fluorescentiemicroscoop uitgeruste beeldverwerkingseenheid en geautomatiseerde sampler-eenheid. Deze methode maakt standaardisatie en kwantificering van geënte tumorgebied en reactie op de behandeling van geneesmiddelen in grote aantallen zebravissen larven. Over het algemeen is deze methode voordelig ten opzichte van traditionele celkweekmedicijnscreening, omdat het de groei van tumorcellen in een in vivo-omgeving tijdens de behandeling van geneesmiddelen mogelijk maakt en praktischer en kosteneffectiever is dan muizen voor grootschalige in vivo-medicijnschermen.
Introduction
Xenografting van primaire patiëntkankerof menselijke kankercellijnen in modelorganismen is een veel gebruikte techniek om tumorprogressie en gedrag in vivo, tumorreactie op de behandeling van geneesmiddelen en de interactie van kankercellen met de micro-omgeving te bestuderen. Traditioneel worden cellen xenografted in immuun-gecompromitteerde muizen, en dit blijft de standaard in het veld. Dit modelsysteem heeft echter verschillende beperkingen, zoals hoge kosten, lage replicerengetallen, moeilijkheden bij het nauwkeurig kwantificeren van tumorlast in vivo en de langere tijd die het kost om tumoren te laten enten en medicijntests te voltooien. In de afgelopen jaren, zebravis zijn ontstaan als een alternatieve xenograft model, met de eerste wordt gemeld in 2005, met groene fluorescerende eiwitten (GFP) gelabeld menselijke melanoom cellijnen getransplanteerd in blastula-stadium embryo's1,2. Meer recent, 2 dagen na de bevruchting (dpf) zebravis larven zijn gebruikt als xenograft ontvangers om controle van anatomische locatie van injectie en voor gebruik in hoge resolutie in vivo beeldvorming van tumor interactie met de omringende micro-omgeving3,4.
Zebravissen bieden vele voordelen als een xenograft model. Ten eerste kunnen volwassen zebravis worden gehuisvest en snel worden gekweekt in grote hoeveelheden tegen relatief lage kosten. Elk paar volwassen zebravis kan honderden larvevissen per week produceren. Vanwege hun kleine omvang kunnen deze larve zebravissen worden onderhouden in 96-putplaten voor high-throughput drug screening. Larven hoeven niet te worden gevoed tijdens een typisch xenograft-experiment, omdat hun dooierzak de voedingsstoffen biedt om ze hun eerste week van het leven te ondersteunen. Bovendien hebben zebravissen pas om 7 dpf een volledig functioneel immuunsysteem, wat betekent dat ze geen bestraling of immunosuppressieve regimes nodig hebben voorafgaand aan de xenograft-injectie. Ten slotte zorgen optisch heldere zebravislijnen voor hoge resolutie beeldvorming van tumor-micro-omgeving interacties.
Misschien wel de meest veelbelovende toepassing van zebravissen als een xenograft model is de mogelijkheid om high-throughput drug screening uit te voeren op menselijke kanker monsters op een manier die niet mogelijk is met behulp van een ander model organisme. Larven absorberen medicijnen uit het water via de huid, waardoor het gemak van toediening van geneesmiddelenwordt verbeterd 5. Omdat dieren worden onderhouden in 96-put platen, meestal in 100−300 μL water, schermen vereisen kleinere hoeveelheden drugs in vergelijking met muizen. Momenteel zijn er verschillende methoden voor standaardisatie en kwantificering van het effect van geneesmiddelen op de menselijke tumorlast bij zebravissen, waarvan sommige praktischer zijn dan andere voor het opschalen van enkelvoudige medicijntests tot screening met een hoge doorvoer. Sommige groepen scheiden bijvoorbeeld vis in eencellige suspensie en kwantificeren fluorescerende of gekleurde tumorcellen door individuele druppels van de suspensie te beeldvorming en fluorescentie te kwantificeren met behulp van een semi-geautomatiseerde ImageJ-macro4. Een semi-geautomatiseerde whole-larimaging methode werd ontwikkeld waarin larve vissen werden vastgesteld in 96-put platen en afgebeeld met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop voor de herschikking van samengestelde beelden en kwantificering van tumorcel foci6. Beide testen zijn vrij arbeidsintensieve methoden voor kwantificering, die heeft gemaakt echt high-throughput drug screening in zebrafish xenograft modellen onpraktisch.
Dit probleem is aangepakt door de ontwikkeling van de Vertebrate Automated Screening Technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, een fluorescentiemicroscoop uitgeruste beeldverwerkingseenheid en geautomatiseerde sampler unit (Figuur 1 en Tabel van Materialen), dat is een echt geautomatiseerde methode voor high-throughput beeldvorming van zebravissen larven7,8,9. Met deze eenheid worden vissen verdoofd, automatisch bemonsterd van een 96-well plaat, gepositioneerd in een capillaire en gedraaid in de ingestelde oriëntatie op basis van een vooraf ingestelde gebruiker voorkeur, afgebeeld, en vervolgens ofwel terug geplaatst in dezelfde put van een nieuwe 96-well plaat voor verdere studies of weggegooid. Het combineren van deze beeldvormende technologie met zebravissen xenografts kan zorgen voor de mogelijkheid van gepersonaliseerde geneeskunde die high-throughput drug screening van grote drug samengestelde bibliotheken tegen individuele patiënt tumoren gebruikt. Zebrafish xenografts bieden ook een grootschalige en goedkope methode voor het testen van zowel toxiciteit en werkzaamheid van nieuwe verbindingen in vivo. Zebravissen kunnen worden gebruikt als een voorlopige screening stap alvorens over te gaan tot muis xenograft modellen.
We hebben een gestroomlijnde workflow ontwikkeld voor xenografting primary patient leukemie cellen in zebravissen en het uitvoeren van high-throughput drug schermen met geautomatiseerde beeldvorming en kwantificering, die kan worden toegepast op elke andere primaire patiënt tumorcellen of kankercelllijn. Deze workflow maakte gebruik van een fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit en geautomatiseerde sampler unit om te verbeteren op de huidige standaardisatie en kwantificering methoden en biedt een geautomatiseerd alternatief voor eerdere, meer arbeidsintensieve methoden voor het kwantificeren van tumormassa in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Kentucky (protocol 2015-2225). Patiënt monsters werden verzameld onder de Universiteit van Kentucky's Institutional Review Board (protocol 44672). Alle dierproeven die volgens dit protocol worden uitgevoerd, moeten worden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de gebruiker.
1. Ontdooien primaire patiënt acute lymfooblastische leukemie cellen
- Ontdooi primaire patiënt perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) uit bevroren voorraad in een 37 °C waterbad. Onmiddellijk nadat de cellen ontdooid zijn, brengen cellen in hun vriesmedia (90% FBS + 10% dimethylsulfoxide [DMSO]) naar een 15 mL conische buis met langzame pipetateren, het vermijden van luchtbellen. Voeg 10 mL voorverwarmde 37 °C ontdooiende media (25% foetale runderserum [FBS] toe in het gemodificeerde Dulbecco medium [IMDM]) van Iscove( puntige ierij (ongeveer 2-3 s per mL) aan de cellen in de conische buis van 15 mL.
OPMERKING: PbMC's werden verzameld uit bloedmonsters van patiënten op het moment van diagnose. De buffy coat werd gescheiden door dichtheid srifugatie en cellen werden gewassen 2x in RPMI 1640 + 10% FBS. Cellen werden geteld en 107 cellen werden bevroren per cryoviale in 1 mL van de bevriezing media, en opgeslagen bij -80 °C. - Centrifugeer cellen op 100 x g gedurende 10 min en aanzuigen media uit de cel pellet. Herhaal de toevoeging van dooimedia, centrifugering en aspiratie nog een extra tijd om eventuele resterende DMSO te verwijderen.
- Cellen opnieuw opschorten in 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 10 μL verwijderen voor het tellen op een geautomatiseerd celteller of hemocytometer. Voeg 10 μL trypanblauw toe aan 10 μL cellen die voor het tellen zijn verwijderd. Aantal cellen per mL tellen en registreren om later het volume te berekenen om cellen opnieuw op te schorten voor xenografting (zie stap 2.5).
LET OP: Typisch, 500 cellen zijn xenografted per larve zebravissen. Zo zijn er 5 x 105 cellen nodig om 1.000 zebravissen te injecteren. Levensvatbaarheid moet >85% te gebruiken voor xenografting. In dit experiment, cel levensvatbaarheid was 96% na ontdooien, beoordeeld door trypan blauwe vlekken.
2. Fluorescerende labelencellen met DiI
- Centrifugeer het gewenste celnummer in 5 mL PBS op 200 x g voor 5 min en aangezogen supernatant. Vlek minimaal 2 x 106 cellen in geval van klonteren of problemen met het laden van de naald tijdens de injectie.
- Maak 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) bevlekoplossing (5 mL PBS met 4 μL per mL DiI-vlek, Materiaaltafel)en storing de celpellet in de kleuroplossing opnieuw op.
LET OP: De celdichtheid mag niet meer bedragen dan 2 x 106 cellen/mL wanneer deze opnieuw in de kleuringsoplossing worden opgehangen. - Incubeercellen bij 37 °C beschermd tegen licht gedurende 20 min, vortex zachtjes, dan incubeercellen op ijs gedurende 15 min beschermd tegen licht.
- Centrifugeer cellen op 200 x g voor 5 min en aanzuigen supernatant. Was cellen met 5 mL PBS, centrifugeer op 200 x g voor 5 min en aangezogen supernatant. Herhaal wassen, centrifugeren en aspiratie een extra tijd.
- Schorscellen in 1 μL PBS per 250.000 levende cellen en breng over op een 1,5 mL microcentrifugebuis. Houd geresuspendeerde cellen op ijs in het donker en onmiddellijk doorgaan met micro-injecties.
LET OP: Dit zorgt ervoor dat 500 patiëntcellen in de zebravis worden geïnjecteerd met elke injectiepomp van 2 nL volume.
3. Microinjecting Zebrafish Larven
LET OP: Micro-injecties moeten worden voltooid binnen 1-3 uur van kleuring om de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren.
- Voorafgaand aan het kleuren van cellen en injecteren, maak agarose platen voor het injecteren door het gieten van 25 mL van 3% agarose in 1x Tris / borate / EDTA (TBE) in een petrischaalen en laat het stollen. Bewaar platen tot 2 weken bij 4 °C.
- Ook voorafgaand aan het bevlekken van cellen en injecteren, dechorionate 2 dpf zebravissen met behulp van tangen onder een ontleden microscoop. Voor handmatige dechorionatie, trek aan tegenovergestelde uiteinden van de beschermende chorion van de zebravis met tang totdat de chorion tranen en de zebravis wordt unenveloped10.
LET OP: Dechorionatie kan ook worden uitgevoerd met behulp van enzymatische behandeling met pronase, zoals eerder beschreven10. Casper (roy-/-;nacre-/-zebravissen werden gebruikt voor deze experimenten11. Elke zebravis larve stam kan worden gebruikt voor xenografting. Als pigment interfereert met beeldvorming of visualisatie, propylthiouracil (PTU) behandeling kan worden gebruikt om melanine synthese te blokkeren als optisch duidelijke zebravissen stammen zijn niet beschikbaar12. - Prechill naalden bij 4 °C of op ijs om samenklonteren van cellen tijdens micro-injectie te voorkomen. Laad 5 μL gekleurde cellen in een gekoelde niet-filamenteuze borosilicaatglazen naald met behulp van microloader pipettips.
LET OP: Microinjector en naald setup methoden zijn eerder gepubliceerd13. - Laad de naald in de microinjectorarm. Schuine kant de naald tip met behulp van een steriel scheermesje. Meet de druppelgrootte in minerale olie met behulp van een fase micrometer, waarbij druppelvolume consistent op 2 nL (~ 0,15 mm diameter) gedurende.
- Gebruik 350 μL van 4 mg/mL tricaine-S om ~ 30 gedeorioneerde 2 dpf zebravissen te verdoven in een petrischaal met 25 mL E3-media. Na ~1 min overdracht verdoofde larven naar een vlakke-oppervlakte injectieplaat (3% agarose in een petrischaaltje) en injecteer larven met één pomp van bevlekte cellen op de gewenste injectieplaats (bijvoorbeeld de dooier of het hartzakje; zie figuur 2A,B).
LET OP: Injectieplaats moet worden gekozen op basis van het doel van het experiment. De meest voorkomende injectieplaats is de dooier. Om cellen circuleren in de bloedbaan, het hartzakje, kanaal van Cuvier, perivitelline ruimte, of retro-orbitale ruimte kan worden gebruikt als injectieplaatsen. Orthotopische injectieplaatsen kunnen ook worden gebruikt, zoals de hersenen. - Was larven van de injectieplaat in een petrischaal van 10 cm2 (30 larven per plaat) met E3-media14 zonder methyleenblauw en incubeer bij 28 °C gedurende een herstelperiode van 1 uur. Blijf injecteren totdat een gewenst aantal larven is geïnjecteerd.
LET OP: In het ideale geval injecteer je 2−2,5 keer het aantal larven dat nodig is voor experimenten. Er zal enige afsterven van larven als gevolg van stress van injectie en de verhoogde incubatietemperatuur. Typisch, na de praktijk met de techniek, 800−1.500 zebravis larven kunnen worden geïnjecteerd door een enkele persoon binnen de 1-3 uur wanneer gekleurde cellen moeten worden geïnjecteerd. - Verplaats platen van geïnjecteerde larven naar een couveuse van 34 °C. Plaats de petrischaaltjes van larven niet direct op een metalen plank in de couveuse om oververhitting van het E3-water te voorkomen. Plaats bijvoorbeeld een lege petrischaal tussen het schap en petrischaalvan larven om als buffer op te treden. Verwijder dode zebravislarven na 24 en 48 uur na injectie (hpi).
4. Het opzetten van drug scherm met Xenografted Zebrafish
-
Bij 48 pki, scherm zebravis larven voor fluorescentie / tumor engraftment en gezondheid (Figuur 2C, D). Verwijder dode of misvormde zebravis en selecteer zebravis met een vergelijkbare engraftment(figuur 2C, D, 1−3 en 1'−3'). Verwijder ongeënte zebravissen(figuur 2C, D, 5 en 5').
- Voor dooier geïnjecteerde vis, verwijder vis waar de grenzen van de dooier niet kan worden gezien rond engrafted celmassa (Figuur 2C, 4) als het maakt kwantificering moeilijk. Voor pericardium geïnjecteerde vis, verwijder vis waar geïnjecteerde celmassa encroaches in de dooierzak (Figuur 2D, 4').
- Voeg zebravis toe aan een 96-well plaat. Om dit te doen, snijd de tip af van een 200 μL pipet tip, net groot genoeg voor een 4 dpf zebrafish te passen door. Aanzuigen 150 μL van E3 media met een zebravis van de plaat met behulp van een P200 pipet, en toe te voegen aan een lege put van een platte bodem 96-well plaat.
- Verdun het te testen medicijn in het vereiste volume E3-media, met 150 μL per put. Bereid het medicijn voor bij 2-voudige de gewenste concentratie. Bereid bijvoorbeeld 20 μM medicijn in E3 voor als de gewenste eindconcentratie 10 μM is, omdat de helft van het totale volume in elke put uit de medicijnoplossing bestaat. Voor de DMSO-controlegroep voegt u DMSO toe op hetzelfde volume als het medicijn.
- Voeg 150 μL van 2x verdunde medicijnoplossing toe aan elke put die zebravislarven bevat in 150 μL E3, voor een eindvolume van 300 μL met 1x medicijnoplossing per put.
- De plaat uitbroeden bij 34 °C. Controleer dagelijks op dode zebravissen. Na 2 dagen, indien gewenst, vernieuw het medicijn door 200 μL vloeistof uit elke put van de 96-putplaat te verwijderen en te vervangen door 200 μL 1x verdunde medicijnoplossing of DMSO in E3-media.
LET OP: De beste resultaten werden gevonden na 3 dagen van medicamenteuze behandeling voor dit experiment; de duur van de behandeling van geneesmiddelen kan echter variëren tussen 2−4 dagen en moet mogelijk worden geoptimaliseerd op basis van het experiment dat wordt uitgevoerd of drugs die worden gebruikt.
5. Imaging Xenografted Zebrafish Using a Fluorescentescence Microscope Equipped Imaging Unit and Automated Sampler Unit
- Bereid 1 L verse 4 mg/mL tricaine en 1,5 L E3-media. Vul mediafles 1 met E3 media en mediafles 2 met tricaine.
- Verwijder alle ongewenste fluorescerende kanalen in de imaging software en voeg het gewenste kanaal (DiI voor dit experiment). Controleer het gewenste tl-kanaal als een beeld zal alleen worden genomen voor de kanalen met een vinkje. Selecteer ook hoe de foto's worden genomen (z-stacks, automatisering, lussen in serie, enz.).
LET OP: Voor dit experiment werd de focus handmatig ingesteld voor elke vis die wordt afgebeeld om het hoogste aantal afbeeldingen met optimale focus te verkrijgen. - Beeld de DMSO-controlevis vóór de met drugs behandelde vis, zodat de juiste belichtingstijd kan worden ingesteld in de beeldvormingssoftware. Zodra de blootstelling is ingesteld, wijzigt u de belichtingstijd voor de duur van het experiment niet.
LET OP: De focus kan handmatig worden aangepast voor elke zebravis om ervoor te zorgen dat er geen onscherp beelden, of voor volledig geautomatiseerde beeldvorming, dezelfde focus kan worden gebruikt tussen vis met onscherp beelden worden weggegooid of vis opnieuw afgebeeld voorafgaand aan het uitvoeren van analyse. Bovendien kan dit experiment worden uitgevoerd met behulp van elke fluorescerende imager, gevolgd door kwantificering van fluorescentie met behulp van de ImageJ-software.
6. Fluorescentie kwantificeren met ImageJ
- Open ImageJ-software.
-
Ga naar Bestand | Open en selecteer het gewenste CZI-bestand. De software zal brengen een import opties venster.
- Schakel Afzonderlijk bestanden openen,controleer Automatisch schalenen controleer Splitkanalenvoor het bekijken van de stapel met geselecteerde Hyperstacks. Selecteer Kleur .
- Klik op Plug-ins | Macro's | Record.
- Klik op Afbeelding | Aanpassing | Drempel . Selecteer afbeeldingstype als rood in het vervolgkeuzemenu aan de rechterkant van het drempelvenster. Pas de minimumdrempel aan totdat de software alleen gebieden met fluorescentie(figuur 3A)markeert en klik op Toepassen. De software zet de foto om in zwart-wit, met het geselecteerde gebied in het zwart.
LET OP: Gebruik dezelfde drempel voor elke afbeelding in het medicijnscherm om resultaten gestandaardiseerd en vergelijkbaar te houden. - Klik op Analyseren | Maatregel. De software zal trekken een resultaten venster met de fluorescerende gebied voor dat beeld.
- Klik op Maken in het venster Macrorecorder. Hiermee wordt een nieuw venster geopend met de code voor de macro. Markeer alle gewenste afbeeldingen voor analyse en open als in stap 6.2.
- Selecteer Uitvoeren in het venster met de macro. Het resultatenvenster bevat nu het gebied voor elke afbeelding.
LET OP: De beeldanalyse kan individueel worden uitgevoerd zonder het opnemen en uitvoeren van een macro en door de bovenstaande stappen voor elke afbeelding te herhalen. - Kopieer de gemeten gegevens naar een spreadsheet. Gemiddelde de totale fluorescentie van alle controle (DMSO) monsters. Bereken het procentenverschil met de volgende formule: –[(gemiddeld DMSO-gebied – experimenteel gebied)/gemiddeld DMSO-gebied] x 100% (figuur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het hierboven beschreven protocol werden zebravissen xenografted in de dooier en het hartzakje met primaire patiënt PBMC's die oorspronkelijk werden geïsoleerd van een T-cel acute lymfolastische leukemie (T-ALL) patiënt bij diagnose en gebanked als een levensvatbaar, bevroren monster. Bij 48 pki werden xenografted vissen gescreend op fluorescerende tumorcellen (Figuur 2C,D) en behandeld met chemotherapie (dexamethason of vincristine) of DMSO. Vissen werden afgebeeld op 7 dpi, na 3 dagen op de behandeling van drugs met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerustie imaging unit en geautomatiseerde sampler eenheid (Figuur 3A).
De fluorescerende gebied /tumor last werd gemeten voor elke vis afgebeeld met behulp van ImageJ en vergeleken tussen de verschillende drugsbehandeling groepen en DMSO (Figuur 3B). Over het geheel genomen vertoonden xenografted vis die met vincristine werd behandeld de grootste en meest consistente afname van xenografted celmassa in vergelijking met met DMSO behandelde vis. Dexamethason behandelde vis toonde ongeveer de helft van de vermindering van het tumorgebied in vergelijking met vincristine, maar toonde nog steeds een afname van het tumorgebied in vergelijking met DMSO (Figuur 3). Dit bootste wat werd gezien in de patiënt, als hun leukemie snel gereageerd op de therapie met een combinatie van dexamethason en vincristine. Deze resultaten tonen het vermogen van zebravissen xenograft modellen om vatbaar te zijn voor drug screening en geautomatiseerde beeldvorming en kwantificering, het verstrekken van een platform voor het testen van verschillende patiënt monsters of cellijnen met verschillende drugs of drugscombinaties.
Figuur 1: Xenograft drug screen en imaging workflow. Schema van workflow van xenografting zebravislarven en het uitvoeren van drugscherm, met inbegrip van imaging op een fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging eenheid en geautomatiseerde sampler eenheid. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Injectieplaats en representatieve afbeeldingen van het vertonen van xenografted vis. Afbeeldingen van microinjectornaald op het moment van injectie in de dooier (A) of pericardium(B) van 2 dpf zebravissen larven. Representatieve beelden van screening op 2 dpi verbeelden selectie van zebravis voor drug scherm (C,D). Zebravissen met een vergelijkbare engraftment (1−3 en 1'−3') moeten worden geselecteerd, ongeënte zebravissen (5 en 5') moeten worden verwijderd. Voor dooier geïnjecteerde vis, verwijder vis waar de grenzen van de dooier niet kan worden gezien rond engrafted celmassa (4), omdat het kwantificering moeilijk maakt. Voor pericardium geïnjecteerde vis, verwijder vis waar geïnjecteerde celmassa in dooierzak indringt (4'). Schaalbalk = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Medicamenteuze behandeling kan xenografted tumor gebied in vivo verminderen. Representatieve afbeeldingen van zebravissen geïnjecteerd in het hartzakje of dooier na 3 dagen behandeling met DMSO of drugs, vincristine of dexamethason. Gebied van geënte tumormassa werd gekwantificeerd door het instellen van een fluorescentiedrempel met behulp van ImageJ, het selecteren van alle pixels boven de ingestelde drempel, en het meten van het gebied en de gemiddelde fluorescentie van de geselecteerde gebieden. Pixels boven de geselecteerde drempelworden in het zwart weergegeven, terwijl pixels onder de drempelwaarde in wit worden weergegeven. Pixels werden gemeten in zowel de dooier en hartzakje geïnjecteerd zebravis beelden (A). Behandeling met vincristine leidde tot een afname van het engeënte tumorgebied in vergelijking met DMSO-bestrijding met n = 4 behandelde vissen per groep (B). SD = standaarddeviatie. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie demonstreerden we een gestandaardiseerde methode voor ontdooien en injecteren van primaire patiëntenleukemiecellen in zebravissen als xenograft-model. We hebben ook een protocol opgesteld voor high-throughput drug screening van xenografted zebrafish met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit en geautomatiseerde sampler unit. Eerder, xenografts zijn gemeld met menselijke cellijnen, en kwantificering van xenografted tumoren in een high-throughput manier is een uitdaging in het veld. Deze methode dient als basis voor studies om een fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging eenheid en geautomatiseerde sampler eenheid te gebruiken als een manier om beeldvorming van xenografted zebrafish te automatiseren, met het uiteindelijke doel van het uitvoeren van high-throughput drug schermen om te voorspellen welke geneesmiddelen van een specifieke patiënt kanker kan reageren op, het openen van de mogelijkheid voor meer gepersonaliseerde geneeskunde.
Ondanks de mogelijkheid om veel van dit protocol te automatiseren, zijn er nog steeds veel technische uitdagingen die niet over het hoofd mogen worden gezien. Ten eerste is het van cruciaal belang dat cellen zo snel mogelijk na vlekken in zebravissen worden geïnjecteerd om celklonteren en celdood te voorkomen. Larven moeten worden gedeorioneerd voordat het celkleuringsprotocol wordt uitgevoerd. Glazen filamentnaalden moeten ook koud worden gehouden voordat de naald wordt geladen om de verstopping van de naald te verminderen. Bovendien is het gebruik van embryo's geproduceerd door gezonde volwassen zebravissen in de leeftijd van 6 maanden tot 1 jaar van cruciaal belang om de beste levensvatbaarheid van xenografted larven te garanderen. Ten slotte moeten xenografted vissen zorgvuldig worden gescreend op tumorengraftment, en alleen degenen met vergelijkbare tumorvolumes moeten worden gebruikt bij medicijnscreening om variabiliteit in de uiteindelijke resultaten te verminderen.
Hoewel we primaire patiënt leukemie PBMC's gebruikt voor onze experimenten, dit protocol kan worden uitgevoerd met elk type tumor of kanker cel lijn. Voor cellijnen in de kweek moeten aanhangende cellen worden trypsiniseerd en vervolgens in PBS worden gewassen voordat ze verder gaan met het kleurprotocol. Het is ook belangrijk op te merken dat de engraftmentrates kunnen variëren van het ene monster tot het volgende en tussen de typen15. Bijvoorbeeld, in onze PBMC monster, >90% van de circulerende PBMC's waren leukemie ontploffing, maar dit aantal kan aanzienlijk variëren van de ene patiënt naar de volgende, die van invloed kunnen zijn engraftment rate. Omdat de resultaten worden vergeleken met een DMSO-controle binnen hetzelfde monstertype, is er een interne controle voor engraftment-snelheid, maar deze variatie moet in aanmerking worden genomen bij de beslissing hoeveel cellen per zebravis moeten worden geïnjecteerd. We hebben succes gevonden bij het gebruik van 250−1.000 cellen geïnjecteerd per dier, met 500 optimaal voor onze studies. Terwijl onze experimenten concludeerden toen larven 7 dpf waren, zouden we niet verwachten dat xenografts langer in de dieren zullen overleven, omdat het immuunsysteem zich op dit punt begint te ontwikkelen en waarschijnlijk afstoting van menselijke cellen zou veroorzaken. Immuun gecompromitteerde zebravis lijnen zijn gemaakt, met prkdc-/-;il2rga-/- zebravissen in staat om menselijke kankercellen te enten16,17, die nuttig kunnen zijn voor de langere termijn xenografts of de beoordeling van tumor recidief na de behandeling van drugs. Deze immunodeficiënte lijnen moeten echter als heterozygoten worden gehandhaafd, zodat larven vóór gebruik moeten worden gegenotypeerd. Homozygousvissen moeten ook worden behandeld met geneesmiddelen om macrofagen uit te putten om betrouwbare engraftment van menselijke cellen mogelijk te maken, wat de resultaten van de screening van geneesmiddelen kan bemoeilijken. Momenteel zijn deze lijnen niet praktisch of noodzakelijk voor grootschalige medicijnscreening op larven, die kunnen worden voltooid voordat het immuunsysteem volledig functioneel is bij 7 dpf18.
Onze representatieve resultaten richten zich op het injecteren van cellen in het hartzakje en dooier voor gemak en snelheid van injectie en verhoogde levensvatbaarheid; kankercellen kunnen echter worden geïnjecteerd in vele andere anatomische locaties en we hebben succes gehad met behulp van deze workflow op andere locaties, waaronder het kanaal van Cuvier, hersenen, retro-orbitale, en de perivitelline zak. Bovendien is het moeilijk in te schatten hoeveel van elk medicijn de larvevissen absorberen; als er weinig geneesmiddelen worden gebruikt, zal idealiter een toxiciteitsscherm met een reeks doses (meestal 0,1 tot 25 μM) voorafgaand aan de grootschalige test worden uitgevoerd om de maximale getolereerde dosis (MTD) te bepalen. We kozen ervoor om de MTD te gebruiken voor elke drug voor onze test, echter, 10 μM van de drug wordt vaak gebruikt in de zebravis veld als een startconcentratie voor high-throughput drug screening en wordt over het algemeen goed verdragen. Combinaties van geneesmiddelen in zwembaden kunnen worden gebruikt als een eerste scherm, als goed, om de efficiëntie van screening te verhogen door middel van een groot volume samengestelde bibliotheek19.
Hoewel deze aanpak is meer geautomatiseerd en efficiënter dan eerder gemelde workflows, dit is nog steeds een arbeidsintensief en technisch uitdagend protocol voor iedereen zonder eerdere ervaring in microininjecterende zebravissen. Drug screening in zebravissen xenografts is het onwaarschijnlijk dat ooit het gemak en de werkzaamheid van in vitro screening van samengestelde bibliotheken te bereiken en mist een aantal voordelen van muis xenograft modellen. Een belangrijke beperking bij zebravisxenografts is bijvoorbeeld dat kankercellen niet gemakkelijk uit vis kunnen worden gehaald na xenografting op nuttige aantallen voor celbankieren of de meeste downstream-experimenten. Zelfs als dit mogelijk zou zijn, zouden de menselijke kankercellen enkele dagen zijn gegroeid in niet-fysiologische temperaturen en omgevingen en zouden ze niet praktisch zijn voor gebruik in latere toepassingen. De effecten van een iets lagere dan fysiologische temperatuur op de kinetische geneesmiddelen en tumorcelrespons is ook niet bekend en kan verstorende resultaten opleveren. Ondanks deze kanttekeningen vullen zebravissen xenografts een leegte door een meer praktische en kostenefficiënte methode te zijn voor het uitvoeren van grotere schaal in vivo drugsschermen dan mogelijk is in muis xenograft-modellen. Bovendien, zebravissen xenografts vereisen veel minder cellen voor injectie dan muis modellen, dus een kleine hoeveelheid van de patiënt monster kan worden verspreid onder honderden tot duizenden zebravissen, waardoor voor drugsschermen met grote steekproefnummers. Met fluorescerende etikettering, tumorcellen kunnen worden gecontroleerd vanaf het moment dat ze xenografted in de larve zebravis, het verstrekken van enige standaardisatie tussen de dieren die worden gebruikt in drug schermen. Het combineren van deze voordelen van zebravissen xenografts met de mogelijkheid van geautomatiseerde beeldvorming en kwantificering van engrafted cellen opent vele mogelijkheden voor het maken van high-throughput drug screening van patiënt tumoren voor gepersonaliseerde geneeskunde een realiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door een V Foundation V Scholar Award en NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (aan J.S. Blackburn) en NIH Training Grant T32CA165990 (aan M.G. Haney).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
