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Cancer Research

जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट की दवा जांच

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/60996
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, University of Kentucky

Summary

जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा मॉडल वीवो माइक्रोएनवायरमेंट में मानव कैंसर कोशिकाओं की उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और फ्लोरोसेंट इमेजिंग की अनुमति देते हैं। हमने एक स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप लैस इमेजिंग यूनिट का उपयोग करके जेब्राफिश में रोगी-व्युत्पन्न ल्यूकेमिया नमूनों पर बड़े पैमाने पर, स्वचालित दवा स्क्रीनिंग के लिए एक कार्यप्रवाह विकसित किया।

Abstract

रोगी व्युत्पन्न विद्वेष मॉडल कैसे विभिन्न कैंसर एक वीवो प्रणाली में दवा के इलाज का जवाब परिभाषित करने में महत्वपूर्ण हैं। माउस मॉडल क्षेत्र में मानक हैं, लेकिन जेब्राफिश कई फायदों के साथ एक वैकल्पिक मॉडल के रूप में उभरा है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट और कम लागत वाली दवा स्क्रीनिंग की क्षमता शामिल है। जेब्राफिश भी बड़ी नकल संख्या है कि पहले केवल इन विट्रो सिस्टम के साथ प्राप्य थे के साथ वीवो दवा स्क्रीनिंग में के लिए अनुमति देते हैं । तेजी से बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता क्लिनिक के लिए वापस परिणामों के तेजी से अनुवाद के साथ व्यक्तिगत दवा के लिए संभावना खुल सकती है । ज़ेब्राफिश विद्वेष मॉडल का उपयोग लक्षित उपचारों के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के आधार पर कार्रवाई योग्य उत्परिवर्तनों के लिए तेजी से स्क्रीन करने या बड़े पुस्तकालयों से नए कैंसर रोधी यौगिकों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है। क्षेत्र में वर्तमान प्रमुख सीमा मात्रा और प्रक्रिया को स्वचालित किया गया है ताकि दवा स्क्रीन एक बड़े पैमाने पर किया जा सकता है और कम श्रम गहन हो । हमने जेब्राफिश लार्वा में प्राथमिक रोगी नमूनों को जेब्राफ़िश लार्वा में xenografting और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप लैस इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई का उपयोग करके बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक कार्यप्रवाह विकसित किया है। यह विधि एंग्राफ्ड ट्यूमर क्षेत्र के मानकीकरण और मात्राकरण और बड़ी संख्या में जेब्राफिश लार्वा में दवा उपचार के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति देती है। कुल मिलाकर, यह विधि पारंपरिक सेल संस्कृति दवा स्क्रीनिंग पर लाभप्रद है क्योंकि यह दवा उपचार के दौरान वीवो वातावरण में ट्यूमर कोशिकाओं के विकास के लिए अनुमति देता है, और वीवो ड्रग स्क्रीन में बड़े पैमाने पर चूहों की तुलना में अधिक व्यावहारिक और लागत प्रभावी है।

Introduction

प्राथमिक रोगी कैंसर या मॉडल जीवों में मानव कैंसर सेल लाइनों के Xenografting एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक के लिए ट्यूमर प्रगति और वीवो में व्यवहार का अध्ययन, दवा के इलाज के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया, और माइक्रोपर्यावरण के साथ कैंसर सेल बातचीत, दूसरों के बीच है । परंपरागत रूप से, कोशिकाओं को प्रतिरक्षा-समझौता चूहों में xenografted किया जाता है, और यह क्षेत्र में मानक बना हुआ है। हालांकि, इस मॉडल प्रणाली में कई सीमाएं हैं, जैसे कि उच्च लागत, कम दोहराने की संख्या, वीवो में ट्यूमर के बोझ को सही मात्रा में डालने में कठिनाइयां, और ट्यूमर को एन्बेड़ा और दवा परीक्षण पूरा करने में लगने वाला विस्तारित समय। हाल के वर्षों में, जेब्राफिश एक वैकल्पिक विद्वेष मॉडल के रूप में उभरा है, जिसमें पहली बार 2005 में रिपोर्ट किया गया था, जिसमें ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) - लेबल वाली मानव मेलानोमा सेल लाइनें ब्लास्टुला-स्टेज भ्रूण1,,2में प्रत्यारोपित की गई थीं। हाल ही में, इंजेक्शन के शारीरिक स्थान के नियंत्रण के लिए और आसपास के माइक्रोएनवायरमेंट3,,4के साथ ट्यूमर इंटरैक्शन के वीवो इमेजिंग में उच्च संकल्प में उपयोग के लिए अनुनोग्राफ प्राप्तकर्ताओं के रूप में 2 दिन के बाद निषेचन (डीपीएफ) ज़ेब्राफिश लार्वा का उपयोग किया गया है।

जेब्राफिश एक ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल के रूप में कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, वयस्क ज़ेब्राफिश को अपेक्षाकृत कम लागत पर बड़ी मात्रा में रखे और तेजी से पैदा किया जा सकता है। वयस्क ज़ेब्राफिश की प्रत्येक संभोग जोड़ी प्रति सप्ताह लार्वा मछली के सैकड़ों का उत्पादन कर सकती है। उनके छोटे आकार के कारण, इन लार्वा जेब्राफिश को उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए 96-वेल प्लेटों में बनाए रखा जा सकता है। लार्वा को एक विशिष्ट विद्वेष प्रयोग के दौरान खिलाया जाना नहीं है, क्योंकि उनकी जर्दी-थैली जीवन के अपने पहले सप्ताह के लिए उन्हें बनाए रखने के लिए पोषक तत्व प्रदान करती है। इसके अलावा, जेब्राफिश में 7 डीपीएफ तक पूरी तरह से कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं है, जिसका अर्थ है कि उन्हें ज़ेनोग्राफ्ट इंजेक्शन से पहले विकिरण या इम्यूनोप्रेसिव रेजीडेंस की आवश्यकता नहीं होती है। अंत में, ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट ज़ेब्राफिश लाइनें ट्यूमर-माइक्रोएनवायरमेंट इंटरैक्शन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अनुमति देती हैं।

शायद एक विद्वेष मॉडल के रूप में ज़ेब्राफिश का सबसे आशाजनक अनुप्रयोग मानव कैंसर के नमूनों पर उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग करने की क्षमता है जो किसी अन्य मॉडल जीव का उपयोग करना संभव नहीं है। लार्वा त्वचा के माध्यम से पानी से दवाओं को अवशोषित करता है, जिससे दवा प्रशासन की आसानी को बढ़ाया जाता है5। क्योंकि जानवरों को 96-अच्छी प्लेटों में बनाए रखा जाता है, आमतौर पर 100−300 माइक्रोन पानी में, स्क्रीन को चूहों की तुलना में छोटी दवा मात्रा ओं की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, जेब्राफिश में मानव ट्यूमर के बोझ पर दवाओं के प्रभाव के मानकीकरण और मात्राकरण के लिए कई अलग-अलग तरीके हैं, जिनमें से कुछ उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए स्केलिंग-अप एकल दवा परीक्षण के लिए दूसरों की तुलना में अधिक व्यावहारिक हैं। उदाहरण के लिए, कुछ समूह मछली को एकल सेल निलंबन में अलग करते हैं, और निलंबन की व्यक्तिगत बूंदों की इमेजिंग करके फ्लोरोसेंटी लेबल या दाग ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करते हैं और अर्ध-स्वचालित इमेजजे मैक्रो4का उपयोग करके फ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित करते हैं। एक अर्ध-स्वचालित संपूर्ण लार्वा इमेजिंग विधि विकसित की गई थी जिसमें लार्वा मछली को 96-अच्छी प्लेटों में तय किया गया था और समग्र छवियों के पुनर्संरेखण और ट्यूमर सेल फोसी6के परिमाणीकरण से पहले एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि बनाई गई थी। इन परखों के दोनों काफी श्रम-मात्रा के लिए गहन तरीके हैं, जो वास्तव में जेब्राफिश विद्वेष मॉडल अव्यावहारिक में उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग बना दिया है ।

इस मुद्दे को कशेरुकी स्वचालित स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी (VAST) बायोइमेजर और लार्ज पार्टिकल (एलपी) पारखी, एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सुसज्जित इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई(चित्रा 1 और, सामग्री की तालिका)के विकास द्वारा संबोधित किया गया है, जो जेब्राफिश लार्वा7,8,89के उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग के लिए वास्तव में एक स्वचालित तरीका है। इस इकाई के साथ, मछली को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है, एक केशिका में तैनात 96-अच्छी प्लेट से स्वचालित रूप से नमूना लिया जाता है, एक केशिका में तैनात किया जाता है और पूर्व निर्धारित उपयोगकर्ता वरीयता के आधार पर सेट ओरिएंटेशन में घुमाया जाता है, इमेजड, और फिर या तो आगे की पढ़ाई के लिए एक नई 96-अच्छी प्लेट के समान कुएं में वापस रखा जाता है या त्याग दिया जाता है। जेब्राफिश विद्वेष के साथ इस इमेजिंग तकनीक का संयोजन व्यक्तिगत दवा की संभावना के लिए अनुमति दे सकता है जो व्यक्तिगत रोगी ट्यूमर के खिलाफ बड़े दवा यौगिक पुस्तकालयों की उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग का उपयोग करता है। जेब्राफ़िश ज़ेनोग्राफ्ट वीवो में उपन्यास यौगिकों की विषाक्तता और प्रभावकारिता दोनों का परीक्षण करने के लिए एक बड़े पैमाने पर और कम लागत वाली विधि भी प्रदान करते हैं। ज़ेब्राफिश माउस विद्वेष मॉडल के लिए आगे बढ़ने से पहले एक प्रारंभिक स्क्रीनिंग कदम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

हमने जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी ल्यूकेमिया कोशिकाओं को ज़ेनोग्राफिंग करने और स्वचालित इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन के साथ उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीन के प्रदर्शन के लिए एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह विकसित किया है, जिसे किसी अन्य प्राथमिक रोगी ट्यूमर कोशिकाओं या कैंसर सेल लाइन पर लागू किया जा सकता है। इस कार्यप्रवाह ने वर्तमान मानकीकरण और मात्राकरण विधियों में सुधार करने के लिए एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सुसज्जित इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई का उपयोग किया और वीवो में ट्यूमर द्रव्यमान को मात्रा निर्धारित करने के पिछले, अधिक श्रम-गहन तरीकों के लिए एक स्वचालित विकल्प प्रदान करता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को केंटकी विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल 2015-2225) द्वारा अनुमोदित किया गया है। यूनिवर्सिटी ऑफ केंटकी के इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (प्रोटोकॉल 44672) के तहत मरीज के नमूने एकत्र किए गए। इस प्रोटोकॉल के बाद किए गए सभी पशु प्रयोगों को उपयोगकर्ता की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए।

1. विगलन प्राथमिक रोगी एक्यूट लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया कोशिकाएं

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जमे हुए स्टॉक से गल प्राथमिक रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी)। कोशिकाओं के गल जाने के तुरंत बाद, उनके ठंड मीडिया (90% एफबीएस + 10% डिमेथिल सल्फासऑक्साइड [डीएमएसओ]) में कोशिकाओं को धीमी पाइपिंग के साथ 15 मिलील शंकुट्यूब पर स्थानांतरित करें, हवा के बुलबुले से बचें। इस्कोव के संशोधित डुल्बेकको के माध्यम [आईएमएम]) में प्रीवार्म्ड 37 डिग्री सेल्सियस विगविंग मीडिया (25% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] के 10 मिलील जोड़ें 15 मिलील शंकुई ट्यूब में कोशिकाओं में ड्रॉपवाइज (लगभग 2−3 एस प्रति एमएम) जोड़ें।
    नोट: निदान के समय रोगी के रक्त नमूनों से पीबीएमसी एकत्र किए गए थे। बफी कोट घनत्व अपन्तिफेशन से अलग हो गया था और कोशिकाओं को आरपीएमआई 1640 + 10% एफबीएस में 2x धोया गया था। कोशिकाओं की गणना की गई और 107 कोशिकाओं को ठंड मीडिया के 1 मिलील में प्रति क्रायोवियल जमे हुए थे, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
  2. सेल पैलेट से 10 मिन और एस्पिरेट मीडिया के लिए 100 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। गल मीडिया, केंद्रीकरण, और आकांक्षा के अलावा दोहराने के लिए एक अतिरिक्त समय के लिए किसी भी अवशिष्ट DMSO हटा दें ।
  3. फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) के 5 मिलील में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर पर गिनती के लिए 10 माइक्रोन हटा दें। मतगणना के लिए हटाए गए कोशिकाओं के 10 माइक्रोन में ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन जोड़ें। बाद में एक्सोग्राफ्टिंग के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए मात्रा की गणना करने के लिए प्रति एमसीएल और रिकॉर्ड की संख्या की गणना करें (चरण 2.5 देखें)।
    नोट: आमतौर पर, 500 कोशिकाओं को प्रति लार्वा जेब्राफिश को ज़ेनोग्राफेड किया जाता है। उदाहरण के लिए, 1,000 जेब्राफिश इंजेक्ट करने के लिए 5 x 105 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। एक्सोग्राफ्टिंग के लिए उपयोग करने के लिए व्यवहार्यता और 85% होनी चाहिए। इस प्रयोग में, सेल व्यवहार्यता विगलन के बाद 96% थी, जिसका मूल्यांकन ट्राइपैन ब्लू धुंधला द्वारा किया गया था।

2. DiI के साथ फ्लोरोसेंटली लेबलिंग कोशिकाएं

  1. 5 मिन और एस्पिरेट सुपरनेटेंट के लिए 200 x ग्राम पर पीबीएस के 5 एमएल में वांछित सेल नंबर को सेंट्रलाइज करें। इंजेक्शन के दौरान सुई लोड करने या समस्याओं के मामले में कम से कम 2 x 106 कोशिकाओं को दाग दें।
  2. 1,1'-डिऑक्टाडेसिल-3,3,3,3', 3'-टेट्रामेथिलिंगडोकार्बोकियानाइन परक्लोरेट (डीआईआई) धुंधला समाधान (डीआई दाग के 4 माइक्रोन प्रति एमएल युक्त पीबीएस का 5 एमएल, टेबल ऑफ मैटेरियल्स)बनाएं और धुंधला समाधान में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    नोट: धुंधला समाधान में पुनर्निलंबित होने पर सेल घनत्व 2 x 106 कोशिकाओं/mL से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं को 20 मिन, भंवर धीरे के लिए प्रकाश से संरक्षित, फिर प्रकाश से संरक्षित 15 किमी के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट कोशिकाओं को इनक्यूबेट।
  4. 5 मिन और एस्पिरेट सुपरनेटेंट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। पीबीएस के 5 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं, 5 मिन और एस्पिरेट सुपरनेटेंट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्री। धोने, केंद्रीकरण दोहराएं, और आकांक्षा एक अतिरिक्त समय।
  5. प्रति 250,000 लाइव कोशिकाओं के पीबीएस के 1 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 1.5 मीटर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अंधेरे में बर्फ पर पुनर्निलंबित कोशिकाओं को रखें और तुरंत माइक्रोइंजेक्शन जारी रखें।
    नोट: यह सुनिश्चित करता है कि 500 रोगी कोशिकाओं को 2 एनएल वॉल्यूम के प्रत्येक इंजेक्शन पंप के साथ जेब्राफिश में इंजेक्ट किया जाता है।

3. माइक्रोइंजेक्टिंग जेब्राफिश लार्वा

नोट: कोशिकाओं की व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए धुंधला के 1−3 घंटे के भीतर माइक्रोइंजेक्शन पूरा किया जाना चाहिए।

  1. धुंधला कोशिकाओं और इंजेक्शन से पहले, एक पेट्री डिश में 1x Tris/borate/EDTA (TBE) में 3% agarose के 25 mL डालने का कार्य करके इंजेक्शन के लिए अगारोज प्लेटें बनाने के लिए और यह जमना करने के लिए अनुमति देते हैं । 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटस्टोर करें।
  2. इसके अलावा कोशिकाओं धुंधला और इंजेक्शन से पहले, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत संदंश का उपयोग कर 2 डीपीएफ जेब्राफिश dechorionate । मैनुअल dechorionation के लिए, जब तक चोरियन आंसू और ज़ेब्राफिश10नहीं हो जाता है, तब तक संदंश के साथ ज़ेब्राफ़िश के सुरक्षात्मक चोरन के विपरीत सिरों से खींचें।
    नोट: पहलेवर्णित 10के रूप में, प्रोन्स के साथ एंजाइमैमेटिक उपचार का उपयोग करके भी किया जा सकता है। इनप्रयोगोंके लिए कैस्पर (रॉय/-नाक्रे-/)) जेब्राफिश का इस्तेमाल किया गया ।-/--/- किसी भी जेब्राफिश लार्वा तनाव का उपयोग ज़ेनोग्राफिंग के लिए किया जा सकता है। यदि वर्णक इमेजिंग या दृश्य के साथ हस्तक्षेप करता है, तो प्रोपिलथिओरासिल (पीटीयू) उपचार का उपयोग मेलेनिन संश्लेषण को अवरुद्ध करने के लिए किया जा सकता है यदि ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट ज़ेब्राफिश उपभेद उपलब्ध नहीं हैं12।
  3. माइक्रोइंजेक्शन के दौरान कोशिकाओं के झुरमुट को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर प्रीचिल सुई। माइक्रोलोडर पिपेट युक्तियों का उपयोग करके एक ठंडा नॉनफिलामेंटल बोरोसिलिकेट ग्लास सुई में सना हुआ कोशिकाओं का 5 μL लोड करें।
    नोट: माइक्रोइंजेक्टर और सुई सेटअप विधियों को पहले13प्रकाशित किया गया है ।
  4. सुई को माइक्रोइंजेक्टर आर्म में लोड कर लें। एक बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग कर सुई टिप बेवेल। एक चरण माइक्रोमीटर का उपयोग करखनिज तेल में बूंद आकार को मापने, बूंद की मात्रा लगातार 2 nL (~ 0.15 मिमी व्यास) भर में रखते हुए।
  5. E3 मीडिया के 25 मिलीग्राम युक्त पेट्री डिश में ~ 30 डिकोरिओनेट 2 डीपीएफ जेब्राफिश को एनेस्थेटाइज करने के लिए 4 मिलीग्राम/एमएल ट्राइकेन-एस के 350 माइक्रोन का उपयोग करें। ~ 1 मिन स्थानांतरण लार्वा के बाद एक फ्लैट सतह इंजेक्शन प्लेट (एक पेट्री डिश में 3% agarose) और वांछित इंजेक्शन साइट पर दाग कोशिकाओं के एक पंप के साथ लार्वा सुई (जैसे, जर्दी या पेरिकार्डियम; चित्रा 2ए, बीदेखें) ।
    नोट: प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर इंजेक्शन साइट को चुना जाना चाहिए। सबसे आम इंजेक्शन साइट जर्दी है। रक्त प्रवाह में घूम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, पेरिकार्डियम, क्यूवीयर की डक्ट, पेरिविटेलिन स्पेस, या रेट्रो-ऑर्बिटल स्पेस इंजेक्शन साइटों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन साइटों का भी उपयोग किया जा सकता है, जैसे मस्तिष्क।
  6. इंजेक्शन प्लेट से लार्वा को 10 सेमी2 पेट्री डिश (प्रति प्लेट 30 लार्वा) में धोएं जिसमें 1 घंटे की वसूली अवधि के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर मेथिलीन नीले और इनक्यूबेट के बिना E3 मीडिया14 युक्त है। इंजेक्शन तब तक जारी रखें जब तक कि वांछित संख्या में लार्वा इंजेक्ट न हो जाए।
    नोट: आदर्श रूप से, प्रयोगों के लिए आवश्यक लार्वा की संख्या को 2−2.5 गुना इंजेक्ट करें। इंजेक्शन से तनाव और बढ़ते ऊष्मायन तापमान के कारण लार्वा की कुछ मौत होगी। आमतौर पर, तकनीक के साथ अभ्यास के बाद, 800−1,500 जेब्राफिश लार्वा को 1−3 घंटे के भीतर एक व्यक्ति द्वारा इंजेक्ट किया जा सकता है जब दाग कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाना चाहिए।
  7. इंजेक्शन लार्वा की प्लेटों को 34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाएं। ई3 पानी के ओवरहीटिंग को रोकने के लिए लार्वा के पेट्री व्यंजन ों को सीधे इनक्यूबेटर में धातु शेल्फ पर न रखें। उदाहरण के लिए, एक बफर के रूप में कार्य करने के लिए लार्वा के शेल्फ और पेट्री डिश के बीच एक खाली पेट्री डिश रखें। इंजेक्शन (एचपीआई) के बाद 24 और 48 घंटे बाद मृत जेब्राफिश लार्वा निकालें।

4. Xenografted जेब्राफिश के साथ दवा स्क्रीन की स्थापना

  1. 48 एचपीआई में फ्लोरेसेंस/ट्यूमर एनग्राफमेंट एंड हेल्थ(चित्रा 2सी, डी) के लिए जेब्राफिश लार्वा स्क्रीन करें। किसी भी मृत या विकृत ज़ेब्राफ़िश को हटा दें और इसी तरह के एंब्रायडकेशन(चित्रा 2सी, डी, 1−3 और 1'−3') के साथ जेब्राफ़िश का चयन करें। अनेंगर्ड जेब्राफिश(चित्रा 2सी, डी, 5 और 5') निकालें।
    1. जर्दी इंजेक्शन मछली के लिए, मछली को हटा दें जहां जर्दी की सीमाओं को एनग्राफेड सेल द्रव्यमान(चित्रा 2 C,4) के आसपास नहीं देखा जा सकता है क्योंकि यह मात्राकरण को मुश्किल बनाता है। पेरिकार्डियम इंजेक्शन मछली के लिए, मछली को हटा दें जहां इंजेक्शन सेल द्रव्यमान जर्दी थैली(चित्रा 2D,4') में अतिक्रमण करता है।
  2. एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में ज़ेब्राफिश जोड़ें। ऐसा करने के लिए, एक 200 μL पिपेट टिप के टिप काट, बस एक 4 डीपीएफ जेब्राफिश के माध्यम से फिट करने के लिए काफी बड़ा। एक P200 पिपेट का उपयोग कर प्लेट से एक ज़ेब्राफिश के साथ E3 मीडिया के Aspirate १५० μL, और एक फ्लैट नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली के एक खाली कुएं में जोड़ें ।
  3. ई 3 मीडिया की आवश्यक मात्रा में परीक्षण की जाने वाली दवा को 150 माइक्रोन प्रति कुएं पर पतला करें। वांछित एकाग्रता को 2 गुना पर दवा तैयार करें। उदाहरण के लिए, ई 3 में 20 माइक्रोन तैयार करें यदि वांछित अंतिम एकाग्रता 10 माइक्रोन है, क्योंकि प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा का आधा दवा समाधान शामिल है। डीएमएसओ नियंत्रण समूह के लिए, दवा के समान मात्रा में डीएमएसओ जोड़ें।
  4. ई3 के 150 माइक्रोन में जेब्राफिश लार्वा युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से 2x पतला दवा समाधान के 150 माइक्रोन जोड़ें, प्रति अच्छी तरह से 1x दवा समाधान के साथ 300 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के लिए।
  5. थाली को 34 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कर लें। मृत ज़ेब्राफिश के लिए दैनिक जांच करें। 2 दिनों के बाद, यदि वांछित हो, तो 96-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं से 200 माइक्रोन तरल को हटाकर दवा को ताज़ा करें और ई 3 मीडिया में 1x पतला दवा समाधान या डीएमएसओ के 200 माइक्रोन के साथ प्रतिस्थापित करें।
    नोट: इस प्रयोग के लिए दवा उपचार के 3 दिनों के बाद सबसे अच्छा परिणाम पाए गए; हालांकि, दवा उपचार की लंबाई 2−4 दिनों के बीच भिन्न हो सकती है और किए जा रहे प्रयोग या दवाओं के उपयोग के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

5. इमेजिंग ज़ेनोग्राफ्ड जेब्राफिश एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप लैस इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई का उपयोग कर

  1. ताजा 4 मिलीग्राम/mL ट्राइकेन और E3 मीडिया के १.५ एल के 1 एल तैयार करें । Tricaine के साथ E3 मीडिया और मीडिया की बोतल 2 के साथ मीडिया की बोतल 1 भरें ।
  2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में सभी अवांछित फ्लोरोसेंट चैनल निकालें और वांछित चैनल (इस प्रयोग के लिए DiI) जोड़ें। वांछित फ्लोरोसेंट चैनल की जांच करें क्योंकि एक छवि केवल चेक मार्क वाले चैनलों के लिए ली जाएगी। इसके अलावा, छवियों को कैसे लिया जाएगा (जेड-स्टैक, ऑटोमेशन, श्रृंखला में लूप, आदि) का चयन करें।
    नोट: इस प्रयोग के लिए, इष्टतम फोकस के साथ छवियों की उच्चतम संख्या प्राप्त करने के लिए छवि वाली प्रत्येक मछली के लिए मैन्युअल रूप से ध्यान केंद्रित किया गया था।
  3. इमेज दवा का इलाज मछली से पहले डीएमएसओ नियंत्रण मछली ताकि इमेजिंग सॉफ्टवेयर में उचित एक्सपोजर समय सेट किया जा सके। एक बार एक्सपोजर सेट हो जाने के बाद, प्रयोग की अवधि के लिए एक्सपोजर समय न बदलें।
    नोट: ध्यान या तो प्रत्येक ज़ेब्राफिश के लिए मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ध्यान छवियों से बाहर नहीं हैं, या पूरी तरह से स्वचालित इमेजिंग के लिए, एक ही ध्यान का उपयोग मछली के बीच किया जा सकता है, जिसमें फोकस छवियों को छोड़ दिया जा रहा है या विश्लेषण करने से पहले मछली को फिर से चित्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रयोग इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस के परिमाणीकरण के बाद किसी भी फ्लोरोसेंट इमेजर का उपयोग करके आयोजित किया जा सकता है।

6. इमेजजे का उपयोग करके फ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित करना

  1. ओपन इमेजजे सॉफ्टवेयर।
  2. फाइल पर जाएं । वांछित .czi फ़ाइल खोलें और चुनें। सॉफ्टवेयर एक आयात विकल्प खिड़की लाएगा ।
    1. स्टैक देखने के लिए चुनिंदा हाइपरस्टैक, खुली फाइलों की व्यक्तिगत रूप सेजांच करें , ऑटोस्केलकी जांच करें और स्प्लिट चैनलोंकी जांच करें । रंग विकल्प के लिए Colorizedका चयन करें।
  3. क्लिक करें प्लगइन्स । मैक्रोन । रिकॉर्ड।
  4. क्लिक करें छवि । समायोजित करते हैं । दहलीज। दहलीज खिड़की के दाईं ओर ड्रॉपडाउन मेनू में लाल के रूप में छवि प्रकार का चयन करें। न्यूनतम सीमा को तब तक समायोजित करें जब तक कि सॉफ़्टवेयर केवल फ्लोरेसेंस(चित्रा 3A)वाले क्षेत्रों को हाइलाइट न कर रहा हो और आवेदन करें। सॉफ्टवेयर फोटो को ब्लैक एंड व्हाइट में बदल देगा, जिसमें चुनिंदा एरिया ब्लैक में होगा ।
    नोट: परिणामों को मानकीकृत और तुलनीय रखने के लिए दवा स्क्रीन में प्रत्येक छवि के लिए एक ही सीमा का उपयोग करें।
  5. क्लिक करें विश्लेषण करें । उपाय। सॉफ्टवेयर उस छवि के लिए फ्लोरोसेंट क्षेत्र युक्त एक परिणाम खिड़की खींच जाएगा ।
  6. मैक्रो रिकॉर्डर विंडो पर बनाएं पर क्लिक करें। इससे मैक्रो के लिए कोड के साथ एक नई विंडो खुलेगी। विश्लेषण के लिए वांछित छवियों के सभी हाइलाइट और चरण 6.2 में के रूप में खुला।
  7. मैक्रो के साथ खिड़की पर रन का चयन करें। परिणाम खिड़की अब प्रत्येक छवि के लिए क्षेत्र शामिल होंगे ।
    नोट: छवि विश्लेषण रिकॉर्डिंग और एक मैक्रो चलाने के साथ ही प्रत्येक छवि के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराकर व्यक्तिगत रूप से किया जा सकता है।
  8. मापा गया डेटा को स्प्रेडशीट में कॉपी करें। सभी नियंत्रण (DMSO) नमूनों की कुल फ्लोरेसेंस औसत। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके प्रतिशत अंतर की गणना करें: -(औसत डीएमएसओ क्षेत्र - प्रयोगात्मक क्षेत्र) /औसत डीएमएसओ क्षेत्र] x 100%(चित्रा 3 बी)।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, जेब्राफिश को प्राथमिक रोगी पीबीएमसी के साथ जर्दी और पेरिकार्डियम में ज़ेनोग्राफेट किया गया था जो मूल रूप से निदान में टी-सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (टी-ऑल) रोगी से अलग थे और एक व्यवहार्य, जमे हुए नमूने के रूप में बैंक थे। 48 एचपीआई में, ट्यूमर कोशिकाओं(चित्रा 2सी, डी)लेबल और कीमोथेरेपी (dexamethasone या vincristine) या DMSO के साथ इलाज के लिए फ्लोरोग्राफ्ड मछली की जांच की गई। मछली 7 डीपीआई पर छवि थे, दवा उपचार पर 3 दिनों के बाद एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सुसज्जित इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई(चित्रा 3A)का उपयोग कर ।

फ्लोरोसेंट क्षेत्र/ट्यूमर बोझ इमेजेज का उपयोग करके छवि वाली प्रत्येक मछली के लिए मापा गया था और विभिन्न दवा उपचार समूहों और DMSO(चित्रा 3B)के बीच तुलना में । कुल मिलाकर, विनक्रिटिन के साथ इलाज किया जाने वाला विद्वेष मछली ने डीएमएसओ द्वारा इलाज की गई मछली की तुलना में ज़ेनोग्राफेड सेल द्रव्यमान में सबसे बड़ी और सबसे लगातार कमी दिखाई। Dexamethasone इलाज मछली के बारे में आधी विन्क्रिस्टीन की तुलना में ट्यूमर क्षेत्र में कमी से पता चला है, लेकिन अभी भी DMSO(चित्रा 3)की तुलना में ट्यूमर क्षेत्र में कमी दिखाई । यह नकल करता था कि रोगी में क्या देखा गया था, क्योंकि उनके ल्यूकेमिया ने तेजी से डेक्सेथेथासोन और विनक्रिस्टिन के संयोजन के साथ चिकित्सा का जवाब दिया। ये परिणाम जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा मॉडल की दवा स्क्रीनिंग और स्वचालित इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन के लिए उत्तरदायी होने की क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जो विभिन्न रोगी नमूनों या विभिन्न दवाओं या दवा संयोजनों के साथ सेल लाइनों के परीक्षण के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ज़ेनोग्राफ्ट दवा स्क्रीन और इमेजिंग वर्कफ्लो। ज़ेनोग्राफिंग जेब्राफिश लार्वा के कार्यप्रवाह और दवा स्क्रीन का प्रदर्शन करने का योजनाबद्ध, जिसमें फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप लैस इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई पर इमेजिंग शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इंजेक्शन साइट और स्क्रीनिंग विद्वेष मछली के प्रतिनिधि छवियां। इंजेक्शन के समय माइक्रोइंजेक्टर सुई की छवियां या तो जर्दी(ए)या पेरिकार्डियम(बी)में 2 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा की छवियां। 2 डीपीआई पर स्क्रीनिंग के प्रतिनिधि छवियां दवा स्क्रीन(सी, डी)के लिए जेब्राफिश के चयन को दर्शाती हैं । इसी तरह के एंब्राशमेंट (1−3 और 1'−3') के साथ जेब्राफिश का चयन किया जाना चाहिए, अनफ्लंटजेफ़ (5 और 5') को हटा दिया जाना चाहिए। जर्दी इंजेक्शन मछली के लिए, मछली को हटा दें जहां जर्दी की सीमाओं को एनग्राफेड सेल द्रव्यमान (4) के आसपास नहीं देखा जा सकता है क्योंकि यह मात्राकरण को मुश्किल बनाता है। पेरिकार्डियम इंजेक्शन मछली के लिए, मछली को हटा दें जहां इंजेक्शन सेल द्रव्यमान जर्दी थैली (4') में अतिक्रमण करता है। स्केल बार = 0.5 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: दवा उपचार वीवो में विद्वेष ट्यूमर क्षेत्र को कम कर सकते हैं। डीएमएसओ या दवाओं के साथ उपचार के 3 दिनों के बाद पेरिकार्डियम या जर्दी में इंजेक्ट किए गए जेब्राफिश की प्रतिनिधि छवियां, या तो विनक्रिस्टीन या डेक्सेथेसोन। इमेजजे का उपयोग करके फ्लोरेसेंस सीमा स्थापित करके, निर्धारित सीमा से ऊपर सभी पिक्सेल का चयन करके, और क्षेत्र को मापने और चयनित क्षेत्रों के फ्लोरेसेंस का मतलब है। चयनित सीमा के ऊपर पिक्सल काले रंग में दिखाई देते हैं, जबकि दहलीज के नीचे पिक्सल सफेद में दिखाई देते हैं । पिक्सल दोनों जर्दी और पेरिकार्डियम इंजेक्शन जेब्राफिश छवियों(ए)में मापा गया । विनक्रिटिन के साथ उपचार एन = 4 मछली प्रति समूह(बी)के साथ DMSO नियंत्रण की तुलना में engrafted ट्यूमर क्षेत्र में कमी के लिए नेतृत्व किया । एसडी = मानक विचलन। स्केल बार = 250 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में, हमने एक ज़ेनोबेड़ा मॉडल के रूप में जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी ल्यूकेमिया कोशिकाओं के विगलन और इंजेक्शन के लिए एक मानकीकृत विधि का प्रदर्शन किया। हमने फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप लैस इमेजिंग यूनिट और स्वचालित पारखी इकाई का उपयोग करके ज़ेनोग्राफ्ड जेब्राफिश की उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल भी स्थापित किया। इससे पहले, मानव सेल लाइनों के साथ ज़ेनोग्राफ्ट की सूचना दी गई है, और उच्च-थ्रूपुट तरीके से विद्वेष ट्यूमर की मात्रा क्षेत्र में एक चुनौती रही है। यह विधि अध्ययन के लिए एक आधार के रूप में कार्य करता है एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सुसज्जित इमेजिंग इकाई और स्वचालित पारखी इकाई का उपयोग करने के लिए एक तरह से xenografted जेब्राफिश के इमेजिंग स्वचालित के रूप में, उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीन प्रदर्शन के अंतिम लक्ष्य के साथ भविष्यवाणी करने के लिए जो दवाओं एक विशिष्ट रोगी के कैंसर का जवाब कर सकते हैं, और अधिक व्यक्तिगत दवा के लिए संभावना खोलने ।

इस प्रोटोकॉल के बहुत स्वचालित करने की क्षमता के बावजूद, अभी भी कई तकनीकी चुनौतियां हैं जिन्हें अनदेखा नहीं किया जाना चाहिए। सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को सेल झुरमुट और सेल मौत को रोकने के लिए धुंधला करने के बाद जितनी जल्दी हो सके जेब्राफिश में इंजेक्ट किया जाता है। लार्वा को सेल धुंधला प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने से पहले डिकोरिओनेट करने की आवश्यकता होगी। सुई क्लोजिंग को कम करने के लिए सुई लोड करने से पहले ग्लास फिलामेंट सुइयों को भी ठंडा रखा जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, 6 महीने से 1 वर्ष की आयु की स्वस्थ वयस्क जेब्राफिश द्वारा उत्पादित भ्रूण का उपयोग करने के लिए विद्वेष लार्वा की सबसे अच्छी व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, विद्वेष मछली ध्यान से ट्यूमर engraftment के लिए जांच की जानी चाहिए, और केवल इसी तरह के ट्यूमर की मात्रा के साथ उन दवा स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जाना चाहिए अंतिम परिणामों में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए ।

यद्यपि हमने अपने प्रयोगों के लिए प्राथमिक रोगी ल्यूकेमिया पीबीएमसी का उपयोग किया, लेकिन यह प्रोटोकॉल किसी भी ट्यूमर प्रकार या कैंसर सेल लाइन के साथ किया जा सकता है। संस्कृति में सेल लाइनों के लिए, अनुयायी कोशिकाओं को ट्राइप्सिन किया जाना चाहिए और फिर धुंधला प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले पीबीएस में धोया जाना चाहिए। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एनग्राफमेंट की दरें एक नमूने से अगले और नमूना प्रकार15के बीच भिन्न हो सकती हैं । उदाहरण के लिए, हमारे पीबीएमसी नमूने में, और 90% परिसंचारी पीबीएमसी ल्यूकेमिक विस्फोट थे, लेकिन यह संख्या एक रोगी से अगले तक काफी भिन्न हो सकती है, जो एनग्राफमेंट दर को प्रभावित कर सकती है। क्योंकि परिणाम एक ही नमूना प्रकार के भीतर एक DMSO नियंत्रण की तुलना में कर रहे हैं, वहां engraftment दर के लिए एक आंतरिक नियंत्रण है, फिर भी इस भिन्नता को ध्यान में रखा जाना चाहिए जब तय कितने कोशिकाओं को जेब्राफिश प्रति सुई करने के लिए । हमने सफलता तब मिली है जब प्रति पशु इंजेक्शन 250−1,000 कोशिकाओं का उपयोग करके, 500 हमारे अध्ययन के लिए इष्टतम हैं। जबकि हमारे प्रयोगों का निष्कर्ष तब निकाला गया जब लार्वा 7 डीपीएफ थे, हम उम्मीद नहीं करेंगे कि ज़ेनोग्राफ लंबे समय तक जानवरों में जीवित रहेंगे, क्योंकि प्रतिरक्षा प्रणाली इस बिंदु पर विकसित होना शुरू हो जाती है, और संभावित रूप से मानव कोशिकाओं की अस्वीकृति का कारण बनेगी। प्रतिरक्षा समझौता जेब्राफिश लाइनें बनाई गई हैं, जिसमें पीआरकेडीसी-/-आईएल2आरजीए-/-जेब्राफिश-/--/- मानव कैंसर कोशिकाओंको 16,,17को एंटग्राफ करने में सक्षम है, जो दवा उपचार के बाद लंबी अवधि के विद्वेष या ट्यूमर पुनरावृत्ति का आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकती है । हालांकि, इन इम्यूनोडिफिएंट लाइनों को विषमताके रूप में बनाए रखा जाना चाहिए, इसलिए लार्वा को उपयोग से पहले जीनोटाइप किया जाना चाहिए। होमोज़िगौस मछली को मानव कोशिकाओं के विश्वसनीय एनग्राफमेंट को सक्षम करने के लिए मैक्रोफेज को कम करने के लिए दवाओं के साथ भी इलाज किया जाना चाहिए, जो दवा स्क्रीनिंग परिणामों को जटिल बना सकता है। वर्तमान में, ये लाइनें लार्वा पर बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए न तो व्यावहारिक हैं और न ही आवश्यक हैं, जिन्हें प्रतिरक्षा प्रणाली 7 डीपीएफ18पर पूरी तरह से कार्यात्मक होने से पहले पूरा किया जा सकता है।

हमारे प्रतिनिधि परिणाम आसानी और इंजेक्शन की गति और बढ़ी हुई व्यवहार्यता के लिए पेरिकार्डियम और जर्दी में कोशिकाओं के इंजेक्शन पर ध्यान केंद्रित; हालांकि, कैंसर कोशिकाओं को कई अन्य शारीरिक स्थानों में इंजेक्ट किया जा सकता है और हमें अन्य साइटों पर इस कार्यप्रवाह का उपयोग करके सफलता मिली है, जिसमें क्यूवीयर, मस्तिष्क, रेट्रो-कक्षीय और पेरिविटेलिन थैली की नली शामिल है। इसके अतिरिक्त, यह अनुमान लगाना मुश्किल है कि लार्वा मछली कितनी अवशोषित होती है; यदि कुछ दवाओं का उपयोग किया जाता है, तो आदर्श रूप से खुराक की एक श्रृंखला में एक विषाक्तता स्क्रीन (आमतौर पर 0.1 से 25 माइक्रोन) अधिकतम सहन खुराक (एमटीडी) निर्धारित करने के लिए बड़े पैमाने पर परख से पहले किया जाएगा। हमने अपनी परख के लिए प्रत्येक दवा के लिए एमटीडी का उपयोग करने का फैसला किया, हालांकि, 10 माइक्रोएम दवा का उपयोग आमतौर पर जेब्राफ़िश क्षेत्र में उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए शुरुआती एकाग्रता के रूप में किया जाता है और आम तौर पर अच्छी तरह से सहन किया जाता है। पूल में दवाओं के संयोजन एक प्रारंभिक स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही, एक बड़ी मात्रा यौगिक पुस्तकालय19के माध्यम से स्क्रीनिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए ।

यद्यपि यह दृष्टिकोण पहले से रिपोर्ट किए गए वर्कफ़्लो की तुलना में अधिक स्वचालित और कुशल है, यह अभी भी जेब्राफिश को माइक्रोइंजेक्ट करने में पूर्व अनुभव के बिना किसी के लिए एक श्रम-गहन और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रोटोकॉल है। जेब्राफिश विद्वेष में दवा स्क्रीनिंग कभी भी यौगिक पुस्तकालयों की इन विट्रो स्क्रीनिंग की आसानी और प्रभावकारिता तक पहुंचने की संभावना नहीं है और माउस विद्वेष मॉडल के कुछ फायदों का अभाव है। उदाहरण के लिए, ज़ेब्राफिश विद्वेष के साथ एक प्रमुख सीमा यह है कि कैंसर कोशिकाओं को सेल बैंकिंग या सबसे डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए उपयोगी संख्या में xenografting के बाद मछली से आसानी से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। यहां तक कि अगर यह संभव होता, मानव कैंसर कोशिकाओं गैर शारीरिक तापमान और वातावरण में कई दिनों के लिए बढ़ रहा होता है और बाद में अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए व्यावहारिक नहीं होगा । दवा काइनेटिक्स और ट्यूमर सेल प्रतिक्रिया पर शारीरिक तापमान की तुलना में थोड़ा कम का प्रभाव भी ज्ञात नहीं है, और भ्रामक परिणाम पैदा कर सकता है। इन चेतावनी के बावजूद, ज़ेब्राफिश ज़ेनोग्राफ माउस ज़ेनोबेड़ा मॉडल में संभव की तुलना में वीवो दवा स्क्रीन में बड़े पैमाने पर प्रदर्शन करने के लिए अधिक व्यावहारिक और लागत-कुशल विधि होने में एक शून्य भरते हैं। इसके अतिरिक्त, ज़ेब्राफिश विद्वेष माउस मॉडल की तुलना में इंजेक्शन के लिए अभी तक कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, इसलिए रोगी के नमूने की एक छोटी राशि सैकड़ों से हजारों जेब्राफिश तक फैल सकती है, जिससे बड़ी नमूना संख्या के साथ दवा स्क्रीन की अनुमति होती है। फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ, ट्यूमर कोशिकाओं को उस क्षण से निगरानी की जा सकती है जब उन्हें लार्वा जेब्राफ़िश में xenografted किया जाता है, जो दवा स्क्रीन में उपयोग किए जाने वाले जानवरों के बीच कुछ मानकीकरण प्रदान करते हैं। स्वचालित इमेजिंग और engrafted कोशिकाओं की मात्रा की संभावना के साथ ज़ेब्राफिश विद्वेष के इन लाभों के संयोजन व्यक्तिगत दवा के लिए रोगी ट्यूमर की उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग एक वास्तविकता बनाने के लिए कई संभावनाओं को खोलता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को वी फाउंडेशन वी स्कॉलर अवार्ड और एनआईएच ग्रांट DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. ब्लैकबर्न के लिए) और NIH प्रशिक्षण अनुदान T32CA165990 (एमजी हैनी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x TBE Liquid Concentrate VWR 0658-5L
96-well plate, flat bottom CELLTREAT 229195 VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary without Filament Sutter Instrument Company B100-50-10
Dexamethasone Enzo Life Sciences BML-EI126-0001
DMSO Sigma-Aldrich D2438-5X10ML
E3 media N/A 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Femtotips Microloader Tips Eppendorf 930001007
Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) Atlanta Biologicals S11150H
ImageJ FIJI N/A https://imagej.net/Fiji
Iscove's Modified Dulbecco's Medium STEMCELL Technologies 36150
Large Particle (LP) Sampler Union Biometrica N/A automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10MG
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
Phosphate Buffered Saline (1x) Caisson labs PBL06-6X500ML
Stage Micrometer (400-Stage) Hausser Scientific 400-S
Tricaine-S Pentair Aquatic TRS1
Trypan Blue Thermo Fisher T10282
VAST Bioimager Union Biometrica N/A fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/
Vincristine Sulfate Enzo Life Sciences BML-T117-0005
Vybrant DiI Stain Thermo Fisher V22885

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References

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Haney, M. G., Moore, L. H.,… More

Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish. J. Vis. Exp. (158), e60996, doi:10.3791/60996 (2020).

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