Summary
I modelli di xenotrapianto di pesce zebra consentono lo screening farmacologico ad alto consumo e l'imaging fluorescente delle cellule tumorali umane in un microambiente in vivo. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo screening automatizzato dei farmaci su su larga scala su campioni di leucemia derivati dal paziente nel pesce zebra utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza automatizzata.
Abstract
I modelli di xenotrapianto derivati dal paziente sono fondamentali per definire il modo in cui i diversi tipi di cancro rispondono al trattamento farmacologico in un sistema in vivo. I modelli murini sono lo standard sul campo, ma il pesce zebra è emerso come un modello alternativo con diversi vantaggi, tra cui la possibilità di alta produttività e screening farmacologico a basso costo. Il pesce zebra consente anche lo screening farmacologico in vivo con un numero elevato di replica che in precedenza erano ottenibili solo con sistemi in vitro. La capacità di eseguire rapidamente schermi di farmaci su larga scala può aprire la possibilità di medicina personalizzata con rapida traduzione dei risultati in clinica. I modelli di xenotrapianto di pesce zebra potrebbero anche essere utilizzati per esaminare rapidamente le mutazioni utilizzabili sulla base della risposta del tumore a terapie mirate o per identificare nuovi composti anti-cancro provenienti da grandi librerie. L'attuale principale limitazione nel campo è stata la quantificazione e l'automazione del processo in modo che gli schermi di droga possano essere eseguiti su scala più ampia ed essere meno laboriosi. Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per lo xenotrapianto di campioni di pazienti primari in larve di pesce zebra ed eseguendo schermi di farmaci su larga scala utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un'unità campionatore automatizzata. Questo metodo consente la standardizzazione e la quantificazione dell'area tumorale innestata e la risposta al trattamento farmacologico in un gran numero di larve di pesce zebra. Nel complesso, questo metodo è vantaggioso rispetto allo screening farmacologico tradizionale della coltura cellulare in quanto consente la crescita delle cellule tumorali in un ambiente in vivo durante il trattamento farmacologico ed è più pratico e conveniente rispetto ai topi per schermi di farmaci in vivo su larga scala.
Introduction
Lo xenotrapianto dei tumori primari dei pazienti primari o delle linee cellulari del cancro umano negli organismi modello è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare la progressione e il comportamento del tumore in vivo, la risposta del tumore al trattamento farmacologico e l'interazione delle cellule tumorali con il microambiente, tra gli altri. Tradizionalmente, le cellule sono xenotrapinged in topi immunocompromessi, e questo rimane lo standard nel campo. Tuttavia, questo sistema modello ha diverse limitazioni, come ad esempio ad alto costo, bassi numeri di replica, difficoltà nel quantificare con precisione il carico tumorale in vivo e il tempo prolungato necessario per il completamento dei tumori e dei test antidroga. Negli ultimi anni, il pesce zebra è emerso come un modello alternativo di xenotrapianto, con il primo segnalato nel 2005, con linee cellulari di cellule di melanoma umano etichettate con proteina fluorescente verde (GFP) trapiantate in embrioni di stadio blastula1,2. Più recentemente, 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) larve di pesce zebra sono state utilizzate come destinatari di xenotrapianto per consentire il controllo della posizione anatomica dell'iniezione e per l'uso nell'imaging in vivo ad alta risoluzione dell'interazione tumorale con il microambiente circostante3,4.
Il pesce zebra offre molti vantaggi come modello xenotrapianto. In primo luogo, il pesce zebra adulto può essere alloggiato e rapidamente allevato in grandi quantità ad un costo relativamente basso. Ogni coppia di accoppiamento di pesce zebra adulto può produrre centinaia di pesci larva alla settimana. A causa delle loro piccole dimensioni, questi pesci zebra larva possono essere mantenuti in piastre di 96 pozze per lo screening farmacologico ad alto rendimento. Le larve non devono essere nutrite nel corso di un tipico esperimento di xenotrapianto, poiché il loro tuorlo-sac fornisce i nutrienti per sostenerle per la loro prima settimana di vita. Inoltre, i pesci zebra non hanno un sistema immunitario completamente funzionale fino a 7 dpf, il che significa che non richiedono irradiazione o regimi immunosoppressivi prima dell'iniezione di xenotrapianto. Infine, le linee di pesci zebra otticamente chiare consentono l'imaging ad alta risoluzione delle interazioni tumora-microambiente.
Forse l'applicazione più promettente del pesce zebra come modello di xenotrapianto è la capacità di eseguire screening farmacologico ad alto rendimento su campioni di cancro umano in un modo che non è possibile utilizzando qualsiasi altro organismo modello. Le larve assorbono farmaci dall'acqua attraverso la pelle, migliorando la facilità di somministrazione della droga5. Poiché gli animali sono mantenuti in piastre di 96 pozze, in genere in 100-300 - l of water, gli schermi richiedono quantità di droga più piccole rispetto ai topi. Attualmente, esistono diversi metodi per la standardizzazione e la quantificazione dell'effetto dei farmaci sul carico tumorale umano nel pesce zebra, alcuni dei quali sono più pratici di altri per aumentare il test di singolo farmaco per lo screening ad alto throughput. Ad esempio, alcuni gruppi dissociano i pesci in sospensioni a singola cellula e quantificano le cellule tumorali fluorescenti etichettate o macchiate mediante l'imaging di singole goccioline della sospensione e quantificando la fluorescenza utilizzando una macro ImageJ semi-automatica4. È stato sviluppato un metodo semiautomatico di imaging a larve intere in cui i pesci larvali sono stati fissati in piastre di 96 pozzetti e immagini utilizzando un microscopio fluorescente invertito prima del riallineamento delle immagini composite e della quantificazione dei foci delle cellule tumorali6. Entrambi questi saggi sono metodi abbastanza laboriosi per la quantificazione, che ha reso impraticabili lo screening dei farmaci ad alto consumo nei modelli di xenotrapianto di pesce zebra.
Questo problema è stato affrontato dallo sviluppo del Bioimager And -VAST (Pregerato) Di Vertebrate Automated Screening Technology (VAST), un campionatore di particelle di microscopio a fluorescenza e un'unità campionatore automatizzato (Figura 1 e Tabella dei materiali), che è un metodo veramente automatizzato per l'imaging ad alta velocità delle larve di pesce zebra7,8,9. Con questa unità, i pesci vengono anestesizzati, campionati automaticamente da una piastra di 96 pozzetti, posizionati in un capillare e ruotati nell'orientamento impostato in base a una preferenza utente preimpostata, immagini e quindi riposti nello stesso pozzo di una nuova piastra da 96 pozzetti per ulteriori studi o scartati. La combinazione di questa tecnologia di imaging con xenografti di pesce zebra può consentire la possibilità di una medicina personalizzata che utilizza lo screening farmacologico ad alta produttività di grandi librerie di composti farmacologici contro i tumori dei singoli pazienti. Gli xenograforti di pesce zebra offrono anche un metodo su larga scala e a basso costo per testare sia la tossicità che l'efficacia di nuovi composti in vivo. Il pesce zebra può essere utilizzato come fase di screening preliminare prima di procedere ai modelli di xenotrapianto del topo.
Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplificato per lo xenotrapianto delle cellule di leucemia primaria del paziente nel pesce zebra e l'esecuzione di schermi di farmaci ad alta velocità con imaging e quantificazione automatizzati, che possono essere applicati a qualsiasi altra cellula tumorale primaria del paziente o linea cellulare del cancro. Questo flusso di lavoro ha utilizzato un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un'unità campionatore automatizzata per migliorare gli attuali metodi di standardizzazione e quantificazione e offre un'alternativa automatizzata ai precedenti metodi più laboriosi per quantificare la massa tumorale in vivo.
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Kentucky (protocollo 2015-2225). I campioni di pazienti sono stati raccolti nell'ambito del Institutional Review Board dell'Università del Kentucky (protocollo 44672). Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati seguendo questo protocollo devono essere approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
1. Thawing Pazienti primari Cellule linfoblastiche acute
- Scongelare le cellule mononucleari del sangue periferiche del paziente (PBMC) da scorte congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Immediatamente dopo che le cellule si sono scongelate, trasferire le cellule nei loro mezzi di congelamento (90% FBS - 10% di zolfo dimetile [DMSO]) a un tubo conico da 15 mL con pipettatura lenta, evitando bolle d'aria. Aggiungete 10 mL di mezzi di scongelamento preriscaldati da 37 s (25% di siero bovino fetale [FBS] nel mezzo di Dulbecco modificato di Iscove [IMDM]) a goccia (circa 2-3 s per mL) alle cellule del tubo conico da 15 mL.
NOTA: I PBMC sono stati raccolti da campioni di sangue del paziente al momento della diagnosi. Il mantello buffy è stato separato da centrifugazione di densità e le cellule sono state lavate 2x in RPMI 1640 - 10% FBS. Le cellule sono state contate e 107 cellule sono state congelate per crioviale in 1 mL di supporti di congelamento, e conservate a -80 gradi centigradi. - Centrifugare le cellule a 100 x g per 10 min e aspirare i supporti dal pellet cellulare. Ripetere l'aggiunta di supporti di disgelo, centrifugazione e aspirazione un'altra volta per rimuovere qualsiasi DMSO residuo.
- Risospendere le cellule in 5 mL di salina con buffer fosfato (PBS) e rimuovere 10 -L per il conteggio su un contatore cellulare automatico o su un emocitometro. Aggiungere 10 l di trypan blu a 10 -L di cellule rimosse per il conteggio. Contare il numero di celle per mL e registrare per calcolare in un secondo momento il volume in cui rispendere le celle per lo xenotrapianto (vedere il passaggio 2.5).
NOT: Tipicamente, 500 cellule sono xenotrapfted per pesce zebra larva. Ad esempio, sono necessarie 5 x 105 cellule per iniettare 1.000 pesci zebra. La viabilità dovrebbe essere >85% da utilizzare per lo xenotrapianto. In questo esperimento, la vitalità cellulare è stata del 96% dopo lo scongelamento, valutata dalla colorazione blu trypan.
2. Celle di etichettatura fluorescente con DiI
- Centrifugare il numero di cellulare desiderato in 5 mL di PBS a 200 x g per 5 min e aspirato supernatante. Macchiare un minimo di 2 x 106 cellule in caso di agglomerazione o problemi di caricamento dell'ago durante l'iniezione.
- Fare una soluzione di colorazione perclorrate (DiI) da 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI) e risospendere il pellet cellulare nella soluzione di colorazione. Table of Materials
NOT: La densità cellulare non deve superare 2 x 106 celle/mL quando viene risospesa nella soluzione di colorazione. - Incubare le cellule a 37 gradi centigradi protette dalla luce per 20 min, vorticare delicatamente, quindi incubare le cellule sul ghiaccio per 15 min protette dalla luce.
- Centrifuga cellule a 200 x g per 5 min e aspirato supernatante. Lavare le cellule con 5 mL di PBS, centrifugare a 200 x g per 5 min e aspirato super-natante. Ripetere il lavaggio, la centrifugazione e l'aspirazione un'altra volta.
- Risospendere le cellule in 1 oL di PBS per 250.000 cellule vive e trasferirle in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Tenere le cellule risospese sul ghiaccio al buio e continuare immediatamente a microiniezioni.
NOT: Questo assicura che 500 cellule del paziente vengono iniettate nel pesce zebra con ogni pompa di iniezione di 2 nL di volume.
3. Microiniettamento larve di pesce zebra
NOT: Le microiniezioni devono essere completate entro 1/3 h di colorazione per migliorare la vitalità delle cellule.
- Prima di colorare le cellule e l'iniezione, fare piastre di agarose per l'iniezione versando 25 mL di 3% agarose in 1x Tris/borate/EDTA (TBE) in una parabola Petri e lasciarlo solidificare. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.
- Anche prima di colorare le cellule e iniettare, dechorionate 2 dpf pesce zebra utilizzando pinze al microscopio dissezioso. Per la dechorionazione manuale, tirare da estremità opposte del chorion protettivo del pesce zebra con pinze fino a quando le lacrime di chorion e il pesce zebra diventa svelto10.
NOT: La dechorionazione può essere eseguita anche utilizzando un trattamento ezimatico con pronase, come descritto in precedenza10. Per questiesperimentisono stati utilizzati pesci zebra Casper (roy-/;;nacre-/-). Qualsiasi ceppo larvale di pesce zebra può essere utilizzato per lo xenotrapianto. Se il pigmento interferisce con l'imaging o la visualizzazione, il trattamento del propylthiouracil (PTU) può essere utilizzato per bloccare la sintesi della melanina se i ceppi di pesce zebra otticamente chiari non sono disponibili12. - Aghi prechill a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio per prevenire l'agglomeramento delle cellule durante la microiniezione. Caricare 5 -L di celle colorate in un ago di vetro borosilicato refrigerato non filato utilizzando punte di pipetta microloader.
NOT: I metodi di impostazione del microiniettore e dell'ago sono stati precedentemente pubblicati13. - Caricare l'ago nel braccio del microiniettore. Smussare la punta dell'ago con una lama sterile. Misurare la dimensione delle goccioline in olio minerale utilizzando un micrometro a stadi, mantenendo il volume delle goccioline in modo coerente a 2 nL (diametro di 0,15 mm) in tutto.
- Utilizzare 350 -L l di 4 mg/mL tricaine-S per anesthetizzare 30 dechorioned 2 dpf zebrafish in a Petri dish containing 25 mL of E3 media. Dopo 1 min di trasferimento delle larve anestesizzate in una piastra di iniezione superficiale piatta (3% agarose in una parabola di Petri) e iniettare larve con una pompa di cellule colorate nel sito di iniezione desiderato (ad esempio, il tuorlo o il pericardio; vedi Figura 2A,B).
NOT: Il sito di iniezione deve essere scelto in base all'obiettivo dell'esperimento. Il sito di iniezione più comune è il tuorlo. Per far circolare le cellule nel flusso sanguigno, il pericardio, il condotto di Cuvier, lo spazio perivitelline o lo spazio retroorbitale possono essere utilizzati come siti di iniezione. Siti di iniezione ortotopica possono anche essere utilizzati, come il cervello. - Lavare le larve dalla piastra di iniezione in una piastra Petri di 10 cm2 (30 larve per piatto) contenente mezzi E314 senza blu di metilene e incubare a 28 gradi centigradi per un periodo di recupero di 1 h. Continuare l'iniezione fino a quando non è stato iniettato un numero desiderato di larve.
NOT: Idealmente, inietta 2,5 volte il numero di larve necessarie per gli esperimenti. Ci sarà qualche die-off di larve a causa dello stress da iniezione e l'aumento della temperatura di incubazione. Tipicamente, dopo la pratica con la tecnica, 800,1500 larve di pesce zebra possono essere iniettate da una sola persona all'interno di 1/3 h quando le cellule macchiate devono essere iniettate. - Spostare le piastre delle larve iniettate in un'incubatrice di 34 gradi centigradi. Non posizionare i piatti Petri delle larve direttamente su una mensola metallica nell'incubatrice per evitare il surriscaldamento dell'acqua E3. Ad esempio, posizionare un piatto Petri vuoto tra lo scaffale e il piatto Petri delle larve per fungere da tampone. Rimuovere le larve di pesce zebra morte dopo 24 e 48 ore dopo l'iniezione (hpi).
4. Impostazione dello schermo del farmaco con il pesce zebra Xenoinfted
-
A 48 hpi, larve di pesce zebra dello schermo per l'innesto fluorescenza/tumore e la salute(Figura 2C,D). Rimuovi qualsiasi pesce zebra morto o malformato e seleziona il pesce zebra con un innesto simile (Figura 2C, D, 1'3 e 1'3'). Rimuovere il pesce zebra senza engrafted(Figura 2C,D, 5 e 5').
- Per il tuorlo iniettato pesce, rimuovere i pesci dove i bordi del tuorlo non possono essere visti intorno massa cellulare innestata (Figura 2C, 4) come rende difficile la quantificazione. Per i pesci iniettati pericardio, rimuovere i pesci dove la massa cellulare iniettata invade nel sacco del tuorlo (Figura 2D, 4').
- Aggiungere il pesce zebra a una piastra da 96 pozze. Per fare questo, tagliare la punta di una punta di pipetta 200, abbastanza grande per un pesce zebra 4 dpf per adattarsi attraverso. Aspirate 150 - L di supporto E3 con un pesce zebra dalla piastra utilizzando una pipetta P200, e aggiungere ad un pozzo vuoto di un fondo piatto 96-bene piastra.
- Diluire il farmaco da testare nel volume richiesto dei supporti E3, a 150 . Preparare il farmaco a 2 volte la concentrazione desiderata. Ad esempio, preparare 20 M di droga in E3 se la concentrazione finale desiderata è di 10 M, poiché la metà del volume totale in ogni pozzo è costituita dalla soluzione del farmaco. Per il gruppo di controllo DMSO, aggiungere DMSO allo stesso volume del farmaco.
- Aggiungete 150 l di 2 x soluzione di droga diluita ad ogni pozzo contenente larve di pesce zebra in 150 gradi l di E3, per un volume finale di 300 l con 1x soluzione farmacologica per pozzo.
- Incubare la piastra a 34 gradi centigradi. Controllare il pesce zebra morto ogni giorno. Dopo 2 giorni, se lo si desidera, rinfrescare il farmaco rimuovendo 200 l' di liquido da ogni pozzo della piastra da 96 pozze e sostituendocon 200 -L di 1x soluzione farmacodicosa diluita o DMSO nei supporti E3.
NOT: I migliori risultati sono stati trovati dopo 3 giorni di trattamento farmacologico per questo esperimento; tuttavia, la durata del trattamento farmacologico può variare da 2 a 4 giorni e potrebbe essere necessario ottimizzarla in base all'esperimento o all'uso di farmaci.
5. Imaging Xenoinfted pesce zebra utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio di fluorescenza e unità campionatore automatizzato
- Preparare 1 L di tricaina fresca 4 mg/mL e 1,5 L di supporti E3. Riempi il fbere da supporto 1 con i supporti E3 e la bottiglia media 2 con tricaina.
- Rimuovere tutti i canali fluorescenti indesiderati nel software di imaging e aggiungere il canale desiderato (DiI per questo esperimento). Controllare il canale fluorescente desiderato in quanto un'immagine verrà scattata solo per i canali con un segno di spunta. Inoltre, selezionare come le immagini saranno prese (z-stack, automazione, loop in serie, ecc.).
NOT: Per questo esperimento, la messa a fuoco è stata impostata manualmente per ogni pesce fotografato per ottenere il maggior numero di immagini con messa a fuoco ottimale. - Immagina il pesce di controllo DMSO prima del pesce trattato con il farmaco in modo che sia possibile impostare il tempo di esposizione appropriato nel software di imaging. Una volta impostata l'esposizione, non modificare il tempo di esposizione per la durata dell'esperimento.
NOT: La messa a fuoco può essere regolata manualmente per ogni pesce zebra per garantire che non ci siano immagini fuori fuoco, o per l'imaging completamente automatizzato, lo stesso fuoco può essere utilizzato tra i pesci con immagini fuori fuoco scartate o il pesce ri-imaged prima di eseguire l'analisi. Inoltre, questo esperimento potrebbe essere condotto utilizzando qualsiasi imager fluorescente seguito da quantificazione della fluorescenza utilizzando il software ImageJ.
6. Quantificare la fluorescenza utilizzando ImageJ
- Aprire il software ImageJ.
-
Vai a File . Aprire e selezionare il file .czi desiderato. Il software aprirà una finestra delle opzioni di importazione.
- Per la visualizzazione dello stack selezionare Hyperstacks, selezionare Apri file singolarmente, selezionare Scala automaticae selezionare Dividi canali. Per l'opzione colore, selezionare Colore.
- Fare clic su Plugins Macros Registra.
- Fare clic su Immagine . Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Selezionare il tipo di immagine in rosso nel menu a discesa sul lato destro della finestra di soglia. Regolare la soglia minima fino a quando il software evidenzia solo le aree con fluorescenza (Figura 3A) e fare clic su Applica. Il software convertirà la foto in bianco e nero, con l'area selezionata in nero.
NOT: Utilizzare la stessa soglia per ogni immagine nella schermata del farmaco per mantenere i risultati standardizzati e confrontabili. - Fare clic su Analizza . Misurare. Il software tirerà su una finestra dei risultati contenente l'area fluorescente per quell'immagine.
- Fare clic su Crea nella finestra Registratore macro. Si aprirà una nuova finestra con il codice per la macro. Evidenziare tutte le immagini desiderate per l'analisi e aprirle come nel passaggio 6.2.
- Selezionare Esegui nella finestra con la macro. La finestra dei risultati conterrà ora l'area per ogni immagine.
NOT: L'analisi dell'immagine può essere eseguita singolarmente senza registrare ed eseguire una macro, nonché ripetendo i passaggi precedenti per ogni immagine. - Copiare i dati misurati in un foglio di calcolo. Media della fluorescenza totale di tutti i campioni di controllo (DMSO). Calcolare la differenza percentuale utilizzando la seguente formula: –[(area Media DMSO – area sperimentale)/area DMSO media] x 100% (Figura 3B).
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Representative Results
Seguendo il protocollo descritto sopra, il pesce zebra è stato xenotraping nel tuorlo e nel pericardio con PFC del paziente primario che sono stati originariamente isolati da un paziente a cutoblastico acuto a cellule T (T-ALL) alla diagnosi e incassati come un campione vitale e congelato. A 48 hpi, i pesci xenotrapianto sono stati sottoposti a screening per cellule tumorali con etichettafluere fluorescenti (Figura 2C,D) e trattati con chemioterapia (dexamethasone o vincristine) o DMSO. I pesci sono stati immagini a 7 dpi, dopo 3 giorni di trattamento farmacologico utilizzando un microscopio a fluescenza dotato di unità di imaging e unità campionatore automatizzato (Figura 3A).
L'area fluorescente/peso del tumore è stato misurato per ogni pesce immagine utilizzando ImageJ e confrontato tra i diversi gruppi di trattamento farmacologico e DMSO (Figura 3B). Nel complesso, il pesce xenotrapianto trattato con vincristina ha mostrato la diminuzione più grande e più consistente della massa cellulare xenotrapianto rispetto al pesce trattato Con DMSO. Il pesce trattato con Dexamethasone ha mostrato circa la metà della riduzione dell'area tumorale rispetto alla vincristina, ma ha comunque mostrato una riduzione dell'area tumorale rispetto al DMSO (Figura 3). Questo imitava ciò che è stato visto nel paziente, come la loro leucemia rapidamente risposto alla terapia con una combinazione di dexamethasone e vincristine. Questi risultati dimostrano la capacità dei modelli di xenotrapianto del pesce zebra di essere suscettibili allo screening farmacologico e all'imaging e alla quantificazione automatizzati, fornendo una piattaforma per testare vari campioni di pazienti o linee cellulari con diversi farmaci o combinazioni di farmaci.
Figura 1: Schermo di farmaci Xenotrapianto e flusso di lavoro di imaging. Schema del flusso di lavoro delle larve di xenotrapianto e dello screening dei farmaci, compresa l'imaging su un'unità di imaging dotata di fluorescenza al microscopio a fluorescenza e sull'unità campionatore automatizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sito di iniezione e immagini rappresentative del screening dei pesci xenoinnefted. Immagini di aghi di microiniettore al momento dell'iniezione nel tuorlo (A) o pericardio (B) di 2 larve di pesce zebra dpf. Immagini rappresentative dello screening a 2 dpi raffigurano la selezione del pesce zebra per lo schermo di droga (C,D). I pesci zebra con un innesto simile (1,3 e 1'3') devono essere selezionati, il pesce zebra senza engrafted (5 e 5') deve essere rimosso. Per il tuorlo iniettato pesce, rimuovere i pesci dove i bordi del tuorlo non possono essere visti intorno massa cellulare engrafted (4) in quanto rende difficile la quantificazione. Per i pesci iniettati pericardio, rimuovere i pesci dove la massa cellulare iniettata invade nel sacco del tuorlo (4'). Barra di scala - 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il trattamento farmacologico può ridurre l'area del tumore xenotrapianto in vivo. Immagini rappresentative di pesce zebra iniettate nel pericardio o tuorlo dopo 3 giorni di trattamento con DMSO o farmaci, vincristine o dexamethasone. L'area di massa tumorale innestata è stata quantificata impostando una soglia di fluorescenza utilizzando ImageJ, selezionando tutti i pixel al di sopra della soglia impostata e misurando l'area e la fluorescenza media delle regioni selezionate. I pixel al di sopra della soglia selezionata vengono visualizzati in nero, mentre i pixel al di sotto della soglia vengono visualizzati in bianco. I pixel sono stati misurati sia nel tuorlo che nel pericardio iniettato immagini di pesci zebra (A). Il trattamento con vincristina ha portato ad una diminuzione dell'area tumorale engrafata rispetto al controllo DMSO con n : 4 pesci trattati per gruppo (B). SD - deviazione standard. Barra di scala 250 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo standardizzato per scongelare e iniezione di cellule leucemiche primarie del paziente nel pesce zebra come modello di xenotrapianto. Abbiamo anche stabilito un protocollo per lo screening farmacologico ad alta produttività del pesce zebra xenotrapianto utilizzando un'unità di imaging dotata di microscopio a fluorescenza e un'unità campionatore automatizzata. In precedenza, gli xenografi sono stati segnalati con linee cellulari umane, e la quantificazione dei tumori xenotrapianto in modo ad alta produttività è stata una sfida sul campo. Questo metodo serve come base per gli studi per utilizzare un'unità di imaging dotata di microscopio a fluescenza e un'unità campionatore automatizzata come un modo per automatizzare l'imaging del pesce zebra xenoinnetra, con l'obiettivo finale di eseguire schermi di farmaci ad alto rendimento per prevedere a quali farmaci può rispondere il cancro di un paziente specifico, aprendo la possibilità di una medicina più personalizzata.
Nonostante la capacità di automatizzare gran parte di questo protocollo, ci sono ancora molte sfide tecniche che non dovrebbero essere trascurate. In primo luogo, è fondamentale che le cellule vengono iniettate nel pesce zebra il più rapidamente possibile dopo la colorazione per prevenire l'agglomeramento delle cellule e la morte delle cellule. Le larve dovranno essere dechorionated prima di eseguire il protocollo di colorazione cellulare. Anche gli aghi di filamento di vetro devono essere mantenuti freddi prima di caricare l'ago per ridurre l'intasamento dell'ago. Inoltre, l'uso di embrioni prodotti da pesci zebra adulti sani di età compresa tra 6 mesi e 1 anno è fondamentale per garantire la migliore vitalità delle larve xenotrapianto. Infine, i pesci xenotrapianto dovrebbero essere attentamente sottoposti a screening per l'innesto tumorale e solo quelli con volumi tumorali simili dovrebbero essere utilizzati nello screening farmacologico per ridurre la variabilità nei risultati finali.
Anche se abbiamo usato PBMC per la leucemia del paziente primario per i nostri esperimenti, questo protocollo può essere eseguito con qualsiasi tipo di tumore o linea cellulare del cancro. Per le linee cellulari nella coltura, le cellule aderenti devono essere provate e quindi lavate in PBS prima di procedere con il protocollo di colorazione. È inoltre importante notare che i tassi di innesto possono variare da un campione al successivo e tra i tipi di campione15. Ad esempio, nel nostro campione PBMC, >90% dei PBMC circolanti erano esplosioni leucemiche, ma questo numero può variare in modo significativo da un paziente all'altro, che può influenzare il tasso di innesto. Poiché i risultati vengono confrontati con un controllo DMSO all'interno dello stesso tipo di campione, esiste un controllo interno per il tasso di innesto, ma questa variazione deve essere presa in considerazione quando si decide quante cellule iniettare per pesce zebra. Abbiamo trovato successo quando si utilizzano 250-1.000 cellule iniettate per animale, con 500 che sono ottimali per i nostri studi. Mentre i nostri esperimenti si sono conclusi quando le larve erano 7 dpf, non ci aspetteremmo che gli xenografi sopravvivano negli animali per tempi più lunghi, poiché il sistema immunitario inizia a svilupparsi a questo punto e probabilmente causerebbe il rigetto delle cellule umane. Sono state create linee di pesce zebra compromesse immunitarie, con prkdc-/-;il2rga-/- pesce zebra in grado di innaffiare cellule tumorali umane16,17, che possono essere utili per xenogratto a lungo termine o valutare la ricorrenza del tumore dopo il trattamento farmacologico. Tuttavia, queste linee immunodeficienti devono essere mantenute come eterozigoti, quindi le larve devono essere genotate prima dell'uso. I pesci omozigami devono anche essere trattati con farmaci per esaurire i macrofagi per consentire un innesto affidabile delle cellule umane, che può complicare i risultati dello screening farmacologico. Attualmente, queste linee non sono né pratiche né necessarie per lo screening farmacologico su larga scala sulle larve, che può essere completato prima che il sistema immunitario sia pienamente funzionale a 7 dpf18.
I nostri risultati rappresentativi si concentrano sull'iniezione di cellule nel pericardio e tuorlo per facilità e velocità di iniezione e maggiore vitalità; tuttavia, le cellule tumorali possono essere iniettate in molte altre posizioni anatomiche e abbiamo avuto successo usando questo flusso di lavoro in altri siti, tra cui il condotto di Cuvier, il cervello, l'orbitale e il sacco perivitelline. Inoltre, è difficile stimare quanto di ogni farmaco assorbire dal pesce larvale; se vengono utilizzati pochi farmaci, idealmente verrà eseguito uno schermo di tossicità a una gamma di dosi (di solito da 0,1 a 25 m) prima del saggio su larga scala per determinare la dose massima tollerata (MTD). Abbiamo scelto di utilizzare l'MTD per ogni farmaco per il nostro saggio, tuttavia, 10 M di farmaco è comunemente usato nel campo del pesce zebra come concentrazione di partenza per lo screening farmacologico ad alto rendimento ed è generalmente ben tollerato. Combinazioni di farmaci nelle piscine possono essere utilizzati come schermo iniziale, anche, per aumentare l'efficienza dello screening attraverso una libreria composta di grandi volumi19.
Anche se questo approccio è più automatizzato ed efficiente rispetto ai flussi di lavoro segnalati in precedenza, questo è ancora un protocollo laborioso e tecnicamente impegnativo per chiunque senza esperienza precedente nel microinieting di pesce zebra. È improbabile che lo screening farmacologico negli xenograforti dei pesci zebra raggiunga la facilità e l'efficacia dello screening in vitro delle librerie composte e manchi di alcuni vantaggi dei modelli di xenotrapianto al topo. Ad esempio, una delle principali limitazioni con gli xenografi dei pesci zebra è che le cellule tumorali non possono essere facilmente recuperate dai pesci dopo lo xenotrapianto a numeri utili per l'ossegazione cellulare o la maggior parte degli esperimenti a valle. Anche se ciò fosse possibile, le cellule tumorali umane sarebbero cresciute per diversi giorni in temperature e ambienti non fisiologici e non sarebbero stati pratici per l'uso in applicazioni successive. Anche gli effetti di una temperatura leggermente inferiore a quella fisiologica sulla cinetica dei farmaci e sulla risposta delle cellule tumorali non sono noti e possono produrre risultati confusi. Nonostante queste avvertenze, gli xenografti di pesce zebra riempiono un vuoto essendo un metodo più pratico ed economico per eseguire schermi di farmaci in vivo su larga scala rispetto a quanto sia possibile nei modelli di xenotrapianto del topo. Inoltre, gli xenografi del pesce zebra richiedono molte meno cellule per l'iniezione rispetto ai modelli murini, quindi una piccola quantità di campione di pazienti può essere diffusa tra centinaia a migliaia di pesci zebra, consentendo schermi di farmaci con grandi numeri di campioni. Con l'etichettatura fluorescente, le cellule tumorali possono essere monitorate dal momento in cui sono xenotrapianto nel pesce zebra larvale, fornendo una certa standardizzazione tra gli animali utilizzati negli schermi di droga. Combinando questi benefici di xenografi di pesce zebra con la possibilità di imaging automatizzato e quantificazione delle cellule innestata apre molte possibilità per rendere lo screening farmacologico ad alto consumo di tumori del paziente per la medicina personalizzata una realtà.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata da un V Foundation V Scholar Award e NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (a J.S. Blackburn) e NIH Training Grant T32CA165990 (a M.G. Haney).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
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