Summary
Zebrafish 이종이식 모델은 생체 내 미세 환경에서 인간 암 세포의 고처리량 약물 스크리닝 및 형광 이미징을 허용합니다. 당사는 자동 형광 현미경 장착 이미징 유닛을 사용하여 제브라피시의 환자 유래 백혈병 시료에 대한 대규모 자동 약물 스크리닝을 위한 워크플로우를 개발했습니다.
Abstract
환자 유래 이종이식 모델은 생체 내 시스템에서 다른 암이 약물 치료에 어떻게 반응하는지 정의하는 데 중요합니다. 마우스 모델은 현장에서 표준이지만, 제브라피쉬는 고처리량 및 저비용 약물 스크리닝 능력을 포함하여 여러 가지 장점을 가진 대체 모델로 부상했습니다. Zebrafish는 또한 이전에 는 시험관 내 시스템으로만 얻을 수 있던 큰 복제 숫자로 생체 내 약물 스크리닝을 허용합니다. 대규모 약물 스크린을 신속하게 수행 할 수있는 능력은 결과를 신속하게 클리닉으로 신속하게 번역하여 개인화 된 의학의 가능성을 열 수 있습니다. Zebrafish 이종이식 모델은 또한 표적 치료에 대한 종양 반응에 근거를 둔 실행 가능한 돌연변이를 신속하게 선별하거나 대형 라이브러리에서 새로운 항암 화합물을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 이 분야의 현재 주요 제한은 약물 스크린이 더 큰 규모로 수행되고 노동 집약적이지 않도록 프로세스를 정량화하고 자동화하고 있습니다. 우리는 제브라피쉬 유충으로 1 차 환자 샘플을 이종이 식이식하고 형광 현미경 장착 이미징 장치 및 자동화 된 샘플러 유닛을 사용하여 대규모 약물 스크린을 수행하기위한 워크플로우를 개발했습니다. 이 방법은 제브라피시 유충의 다수에 걸쳐 이식된 종양 영역및 약물 치료에 대한 반응을 표준화하고 정량화할 수 있게 한다. 전반적으로, 이 방법은 약물 치료 전반에 걸쳐 생체 내 환경에서 종양 세포의 성장을 허용하고, 생체 내 약물 스크린에서 대규모의 마우스보다 더 실용적이고 비용 효율적이기 때문에 전통적인 세포 배양 약물 스크리닝에 비해 유리하다.
Introduction
1차 환자 암 또는 인간 암 세포주를 모델 유기체로 Xenografting하는 것은 생체 내에서 종양 진행 및 행동, 약물 치료에 대한 종양 반응, 및 미세 환경과의 암 세포 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되는 기술이다. 전통적으로, 세포는 면역 손상된 마우스로 이종이 식이식되고, 이것은 필드에 있는 표준남아 있습니다. 그러나, 이 모델 시스템은 높은 비용, 낮은 복제 수, 생체 내 종양 부담을 정확하게 정량화하는 데 어려움, 종양이 생착 및 약물 검사를 완료하기까지 걸리는 연장 된 시간과 같은 몇 가지 제한사항이 있습니다. 최근에는 제브라피쉬가 대체 이종이식 모델로 등장하여 2005년에 최초로 보고되고 있으며, 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표지된 인간 흑색종 세포주를 블라스쿨라단계배아로 이식하여 1,,2. 최근에는 2일 후 수정(dpf) 제브라피시 유충이 주사의 해부학적 위치를 조절할 수 있도록 이종이식 수용자로 사용되어 왔으며, 주변 미세환경과의 종양 상호작용의 생체내 영상에서 고해상도로 사용하기 위해3,,4.
제브라피쉬는 이종이식 모델로서 많은 이점을 제공합니다. 첫째, 성인용 제브라피쉬는 비교적 저렴한 비용으로 대량으로 사육하고 빠르게 사육할 수 있습니다. 성제 얼룩말의 각 짝짓기 쌍은 매주 애벌레 물고기의 수백을 생산할 수 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, 이 애벌레 얼룩말은 높은 처리량 약물 검열을 위한 96 웰 플레이트에서 유지될 수 있습니다. 유충은 노른자 주머니가 생후 첫 주 동안 영양분을 공급하기 때문에 전형적인 이종이식 실험 과정에서 먹이를 줄 필요가 없습니다. 더욱이, 제브라피쉬는 7 dpf까지 완전한 기능성 면역 계통을 갖지 않으며, 이는 이종이식 주사 전에 조사 또는 면역 억제 요법을 필요로 하지 않는다는 것을 의미합니다. 마지막으로, 광학적으로 명확한 얼룩말 물고기 라인은 종양 미세 환경 상호 작용의 고해상도 화상 진찰을 허용합니다.
아마도 이종이식 모델로 제브라피시의 가장 유망한 응용 프로그램은 다른 모델 유기체를 사용하여 불가능한 방식으로 인간 암 샘플에 대한 높은 처리량 약물 스크리닝을 수행하는 능력입니다. 애벌레는 피부를 통해 물에서 약물을 흡수, 약물 투여의 용이성을 향상5. 동물은 일반적으로 100-300 μL의 물에서 96 웰 플레이트에서 유지되기 때문에 스크린은 마우스에 비해 적은 약물 양을 필요로합니다. 현재, 제브라피시에 있는 인간 종양 부담에 대한 약물의 효력의 표준화 그리고 정량화를 위한 몇몇 다른 방법이 있습니다, 그 중 일부는 높은 처리량 검열에 단 하나 약 시험을 확장하기 위한 그외 보다는 더 실용적입니다. 예를 들어, 일부 그룹은 물고기를 단일 세포 현탁액으로 해리하고, 반자동 ImageJ 매크로4를사용하여 현탁액의 개별 방울을 이미징하고 형광을 정량화함으로써 형광 표지 또는 염색된 종양 세포를 정량화한다. 반자동 전신 애벌레 이미징 방법은 애벌레 물고기가 96 웰 플레이트에 고정되고 합성 이미지의 재정렬 및 종양 세포 초점6의 정량화 전에 반전형광 현미경을 사용하여 이미지화하는 방식으로개발되었습니다. 이 두 가지 검사는 정량화를 위한 상당히 노동 집약적인 방법이며, 이는 제브라피시 이종이식 모델에서 진정으로 높은 처리량의 약물 스크리닝을 비현실적으로 만들었습니다.
이 문제는 척추동물 자동 선별 기술(VAST) 생체 이미지 및 대입자(LP) 샘플러, 형광 현미경 장착 이미징 유닛 및 자동 샘플러유닛(그림 1 및 표 재료)의개발로 해결되었으며, 이는 제브라피시 유충7,,8,,9의고처리량 이미징을 위한 진정한 자동화 된 방법입니다. 이 장치를 사용하면 생선이 마취되고 96 웰 플레이트에서 자동으로 샘플링되고 모세관에 배치되고 미리 설정된 사용자 선호도에 따라 설정된 방향으로 회전된 다음 추가 연구를 위해 새로운 96웰 플레이트의 동일한 웰에 다시 배치하거나 폐기합니다. 이 화상 진찰 기술을 zebrafish 이종이식과 결합하면 개별 환자 종양에 대한 대형 약물 화합물 라이브러리의 고처리량 약물 스크리닝을 사용하는 개인화 된 의학의 가능성을 허용할 수 있습니다. Zebrafish 이종이식은 또한 생체 내에서 새로운 화합물의 독성과 효능을 모두 테스트하기 위한 대규모 저비용 방법을 제공합니다. 제브라피쉬는 마우스 이종이식 모델로 진행하기 전에 예비 스크리닝 단계로 사용할 수 있습니다.
당사는 1차 환자 백혈병 세포를 제브라피시로 이식하고 다른 1차 환자 종양 세포 또는 암 세포라인에 적용할 수 있는 자동 이미징 및 정량화를 통해 고처리량 약물 스크린을 수행하기 위한 간소화된 워크플로우를 개발했습니다. 이 워크플로우는 형광 현미경 장착 이미징 유닛과 자동 샘플러 유닛을 활용하여 현재 표준화 및 정량화 방법을 개선하고 생체 내에서 종양 질량을 정량화하는 이전의 보다 노동 집약적인 방법에 대한 자동화된 대안을 제공합니다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 켄터키 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 2015-2225)에 의해 승인되었습니다. 환자 샘플은 켄터키 대학의 기관 검토 위원회 (프로토콜 44672)에서 수집되었습니다. 이 프로토콜에 따라 수행된 모든 동물 실험은 사용자의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아야 합니다.
1. 해동 1 차 환자 급성 림프 구성 백혈병 세포
- 37°C 수조에서 냉동 스톡으로부터 1차 환자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동합니다. 세포가 해동된 직후, 동결 매체(90% FBS + 10% 디메틸 설폭사이드 [DMSO])에서 느린 파이펫팅이 있는 15mL 원추형 튜브로 세포를 옮기고 기포를 피합니다. 미리 따뜻해진 37°C 해동 매체 10 mL(이스코브의 변형된 덜베코 배지 [IMDM])에서 15 mL 원추형 튜브의 세포에 드롭와이즈(mL당 약 2-3s)를 첨가합니다.
참고: PBMC는 진단 시에 환자 혈액 샘플로부터 수집되었다. 버피 코트는 밀도 원심분리에 의해 분리되었고 세포는 RPMI 1640+ 10% FBS에서 2x 세척하였다. 세포를 계수하고 107개의 세포를 동결된 매체의 1 mL에서 저온 당 동결시키고, -80°C에서 저장하였다. - 100 x g에서 100 x g의 원심분리세포를 10분 동안 및 세포 펠릿으로부터 흡인한다. 해동 매체, 원심분리 및 포부를 한 번 더 추가하여 잔류 DMSO를 제거합니다.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)의 5 mL에서 세포를 다시 중단하고 자동화 된 세포 카운터 또는 혈세포계에 계산하기위한 10 μL을 제거하십시오. 10 μL의 트리판 블루를 10 μL의 셀을 추가하여 계산합니다. mL당 셀 수를 카운트하고 나중에 이종이식에 대한 세포를 재중단하는 부피를 계산하기 위해 기록합니다(2.5단계 참조).
참고: 전형적으로, 500개의 세포는 애벌레 얼룩말 물고기 당 이종이식됩니다. 예를 들어, 1,000개의 제브라피시를 주입하려면 5 x 105개의 세포가 필요합니다. 이종이식에 사용하려면 생존가능성이 >85%여야 합니다. 본 실험에서, 세포 생존은 해동 후 96%였고, 트라이판 블루 염색에 의해 평가되었다.
2. DiI로 형광 표지 세포
- 원하는 세포 수를 PBS의 5 mL에서 200 x g에서 5 분 동안 흡인하여 흡인한다. 주입 시 바늘을 적재하는 데 문제가 있는 경우 최소 2 x 106 셀을 염색하십시오.
- 1,1'-dioctadecyl-3,3',3',-3'-tetramelindocarbocyanine 과염소산염 (DiI) 염색 용액 (DiI 얼룩의 mL 당 4 μL을 포함하는 PBS의 5 mL, 재료의 테이블)을확인하고 염색 용액에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
참고: 염색 용액에서 다시 부유할 때 세포 밀도가 2 x 106 셀/mL를 초과해서는 안 됩니다. - 37 °C에서 세포를 20 분 동안 빛으로부터 보호하고, 소용돌이를 부드럽게 한 다음, 15 분 동안 얼음에 세포를 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
- 원심분리기 세포는 200 x g에서 5 분 동안 및 흡인상체. PBS 5 mL로 세포를 씻고, 원심 분리기를 200 x g에서 5 분 동안 씻고 흡인제를 흡인하십시오. 세척, 원심분리 및 포부를 한 번 더 반복합니다.
- 250,000개의 살아있는 세포당 PBS의 1 μL에서 세포를 재중단하고 1.5 mL 마이크로원심지 튜브로 옮김을 전달한다. 어둠 속에서 얼음에 다시 일시 중단 된 세포를 유지하고 즉시 미세 주사를 계속하십시오.
참고: 이를 통해 500개의 환자 세포가 2 nL 부피의 각 주입 펌프로 제브라피시안에 주입됩니다.
3. 마이크로 주입 제브라피시 애벌레
참고: 미세 주사는 세포의 생존능력을 향상시키기 위해 염색의 1-3 시간 이내에 완료되어야합니다.
- 세포를 염색하고 주입하기 전에, 1x 트리스/붕산/EDTA(TBE)에 25 mL의 아가로즈를 붓고 페트리 접시에 넣은 아가로즈 접시를 만들어 고형화시. 플레이트를 4°C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
- 또한 세포를 염색하고 주입하기 전에, 해부 현미경하에서 집게를 사용하여 2 dpf 제브라피시를 데코리오네이트. 수동 초질의 경우, 집게피시의 보호 초리의 반대쪽 끝에서 잡아 당겨 서 집게가 찢어지고 얼룩말이10으로둘러싸여있게됩니다.
참고: Dechoriorionation은 또한 앞서 설명한 바와 같이, pronase와 효소 처리를 사용하여 수행 될 수있다10. 캐스퍼(roy-/-;nacre-/-)제브라피쉬는 이들 실험에 사용하였다11. 모든 제브라피시 애벌레 균주는 이종이식에 사용할 수 있습니다. 안료가 이미징 또는 시각화를 방해하는 경우, 프로필티우라실(PTU) 치료는 시각적으로 명확한 제브라피시 균주를 사용할 수 없는 경우 멜라닌 합성을 차단하는 데 사용할 수 있다12. - 미세 주입 중 세포의 응고를 방지하기 위해 4 °C 또는 얼음에 프리 칠 바늘. 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 냉장 비 필라멘트 보로 실리케이트 유리 바늘에 염색 된 세포의 5 μL을로드합니다.
참고: 마이크로 인젝터 및 바늘 설정 방법은 이전에13. - 바늘을 마이크로 인젝터 암에 넣습니다. 멸균 면도날을 사용하여 바늘 팁을 베블합니다. 단계 마이크로미터를 사용하여 미네랄 오일의 액적 크기를 측정하여 전체적으로 2 nL(~0.15mm 직경)에서 액적 부피를 일관되게 유지합니다.
- E3 용지 25 mL를 함유한 페트리 접시에 350 μL의 4 mg/mL 트리카인-S를 사용하여 마취 ~30 dechorionated 2 dpf 제브라피시를 사용하십시오. ~1분 후 마취된 유충을 평평한 표면 주입 플레이트(페트리 접시에서 3% 아가로즈)로 옮기고 원하는 주사 부위에 염색된 세포의 펌프 1척으로 유충을 주입한다(예를 들어, 노른자 또는 심낭; 도 2A, B참조).
참고: 사출 부위는 실험의 목표에 따라 선택되어야 한다. 가장 일반적인 사출 사이트는 노른자입니다. 혈 류에서 순환 하는 세포를 얻으려면, 심 낭, Cuvier의 덕트, perivitelline 공간, 또는 복고풍 궤도 공간 주사 사이트로 사용할 수 있습니다. 정형외 주사 부위는 뇌와 같은 사용도 가능합니다. - 주사판을 10 cm2페트리 접시(plate 당 30유충)로 씻어 메틸렌 블루 없이 E3 매질14를 함유하고 1시간 회수 기간 동안 28°C에서 배양한다. 원하는 수의 애벌레가 주입 될 때까지 주입을 계속하십시오.
참고: 이상적으로는 실험에 필요한 애벌레 수를 2-2.5배로 주입하는 것이 좋습니다. 주사와 증가 인큐베이션 온도에서 스트레스로 인해 애벌레의 일부 다이 오프가있을 것입니다. 전형적으로, 기술로 연습한 후에, 800-1,500 제브라피쉬 유충은 염색된 세포가 주입되어야 할 때 1-3 시간 안에 한 사람에 의해 주입될 수 있습니다. - 주입된 유충의 플레이트를 34°C 인큐베이터로 이동한다. E3 물의 과열을 방지하기 위해 인큐베이터의 금속 선반에 직접 유충의 페트리 접시를 배치하지 마십시오. 예를 들어, 선반과 유충의 페트리 접시 사이에 빈 페트리 접시를 놓아 버퍼 역할을 합니다. 24 시간 및 48 시간 후 주입 후 죽은 얼룩말 유충 (hpi)을 제거하십시오.
4. 이종이식 제브라피시로 약물 스크린 설치
-
48 hpi에서, 형광/종양 생착 및 건강을 위한 제브라피시 유충을 가리킨다(그림 2C,D). 죽은 얼룩말이나 기형의 얼룩말물고기를 제거하고 유사한 생착을 가진 제브라피시를 선택합니다(그림2C, D, 1-3 및 1'−3'). 생생하지 않은 얼룩말피시를 제거합니다(그림2C, D, 5 및 5').
- 노른자 주입 된 물고기의 경우, 석회화가 어려워지면서 생석한 세포 덩어리(그림 2C, 4) 주위에 노른자의 테두리가 보이지 않는 물고기를 제거하십시오. 심낭 주입 물고기의 경우, 주입 된 세포 덩어리가 노른자 낭에 잠식 물고기를 제거(그림 2D,4').
- 얼룩말 피시를 96웰 플레이트에 넣습니다. 이렇게 하려면 4dpf 제브라피시까지 충분히 큰 200 μL 파이펫 팁의 팁을 잘라냅니다. P200 피펫을 사용하여 플레이트로부터 1개의 제브라피쉬와 함께 E3 용지의 150 μL을 흡인하고, 평평한 바닥 96웰 플레이트의 빈 웰에 첨가한다.
- E3 매체의 필요한 부피에서 시험될 약물을 잘 당 150 μL로 희석한다. 원하는 농도의 2 배로 약물을 준비하십시오. 예를 들어, 원하는 최종 농도가 10 μM인 경우 E3에서 20 μM의 약물을 준비하소서, 각 웰의 총 부피의 절반이 약물 용액으로 구성되기 때문에. DMSO 대조군의 경우, 약물과 동일한 부피로 DMSO를 추가한다.
- E3의 150 μL에 제브라피쉬 유충을 함유하는 각 우물에 2x 희석 된 약물 용액 150 μL을 추가하여 웰 당 1 x 약물 용액으로 최종 부피를 300 μL로 추가하십시오.
- 플레이트를 34°C에서 배양합니다. 매일 죽은 얼룩말 어시를 확인합니다. 2일 후, 원하는 경우, 96웰 플레이트의 각 웰에서 200 μL의 액체를 제거하고 E3 용지에 희석 약물 용액 또는 DMSO의 200 μL로 대체하여 약물을 새로 고칩니다.
참고: 최상의 결과 후 발견 되었다 3 이 실험에 대 한 약물 치료의 일; 그러나 약물 치료의 길이는 2-4일 사이에 다를 수 있으며, 수행중인 실험 또는 약물 사용에 따라 최적화되어야 할 수도 있습니다.
5. 형광 현미경 장착 이미징 유닛 및 자동 샘플러 유닛을 사용하여 이미징 이종이식 제브라피시
- 신선한 4 mg/mL 트리카인 1L과 E3 용지 1.5L을 준비합니다. 미디어 보틀 1을 E3 용지와 미디어 보틀 2에 트리카인으로 채웁니다.
- 이미징 소프트웨어에서 원치 않는 모든 형광 채널을 제거하고 원하는 채널(이 실험을 위한 DiI)을 추가합니다. 이미지가 확인 표시가 있는 채널에 대해서만 촬영되기 때문에 원하는 형광 채널을 확인합니다. 또한 이미지 촬영 방법(z-스택, 자동화, 직렬 루프 등)을 선택합니다.
참고: 이 실험에서는 이미지가 이미지된 각 물고기에 대해 수동으로 초점을 설정하여 최적의 초점을 가진 가장 많은 수의 이미지를 얻었습니다. - DMSO 제어 물고기를 약물 처리 된 물고기 전에 이미지화하여 이미징 소프트웨어에서 적절한 노출 시간을 설정할 수 있습니다. 노출이 설정되면 실험 기간 동안 노출 시간을 변경하지 마십시오.
참고: 포커스를 수동으로 조정하여 초점이 벗어난 이미지가 없는지 확인하거나 완전히 자동화된 이미징을 위해 분석 수행하기 전에 초점이 벗어난 이미지가 삭제되거나 물고기가 다시 이미지화되는 물고기 간에 동일한 포커스를 사용할 수 있습니다. 더욱이, 이 실험은 어떤 형광 이미저를 사용하여 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 형광의 정량화에 의해 수행될 수 있었다.
6. ImageJ를 사용하여 형광 정량화
- ImageJ 소프트웨어를 엽니다.
-
파일로 이동 | 원하는 .czi 파일을 열고 선택합니다. 소프트웨어에 가져오기 옵션 창이 표시됩니다.
- 스택 보기를 선택 하이퍼스택을보려면 파일 열기를 개별적으로선택하고 자동 크기 조정을선택하고 분할 채널을선택합니다. 색상 옵션의 경우 색상화를 선택합니다.
- 플러그인을 클릭합니다 | 매크로 | 레코드.
- 이미지를 클릭 | 조정 | 임계값. 임계값 창 오른쪽의 드롭다운 메뉴에서 이미지 유형을 빨간색으로 선택합니다. 소프트웨어가 형광이 있는 영역만 강조 표시될 때까지 최소 임계값을 조정하고적용을 클릭합니다. Apply. 이 소프트웨어는 사진을 흑백으로 변환하고 선택한 영역은 검은 색으로 변환합니다.
참고: 약물 화면의 각 이미지에 대해 동일한 임계값을 사용하여 결과를 표준화하고 비교할 수 있습니다. - 분석 | 클릭 측정. 소프트웨어는 해당 이미지의 형광 영역을 포함하는 결과 창을 가져옵니다.
- 매크로 레코더 창에서 만들기를 클릭합니다. 그러면 매크로에 대한 코드가 있는 새 창이 열립니다. 분석을 위해 원하는 이미지를 모두 강조 표시하고 6.2단계에서와 같이 엽니다.
- 매크로를 가진 창에서 실행을 선택합니다. 이제 결과 창에 각 이미지의 영역이 포함됩니다.
참고: 이미지 분석은 매크로를 기록하고 실행하지 않고도 각 이미지에 대해 위의 단계를 반복하여 개별적으로 수행할 수 있습니다. - 측정된 데이터를 스프레드시트에 복사합니다. 모든 대조군(DMSO) 샘플의 총 형광을 평균합니다. 다음 수식을 사용하여 백분율 차이를 계산합니다.Figure 3B
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Representative Results
전술한 프로토콜에 따라, 제브라피쉬는 원래 T 세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL) 환자로부터 분리된 1차 환자 PBMC를 사용하여 노른자와 심낭에서 이종이이식하고 생존 가능한 냉동 샘플로 뱅크하였다. 48 hpi에서, 이종이식된 물고기는 형광표지된 종양세포(도 2C,D)를위해 스크리너드하고 화학요법(덱사메타손 또는 빈크리스틴) 또는 DMSO로 처리하였다. 물고기는 7 dpi에서, 형광 현미경장착 영상유닛 및 자동 샘플러유닛을 이용한 약물 치료에 3일후(도 3A)에서영상을 촬영하였다.
형광 영역/종양 부담은 ImageJ를 사용하여 이미지화된 각 어류에 대해 측정되었고, 상이한 약물 치료 군과 DMSO(도3B)를비교하였다. 전반적으로, 빈크리스틴으로 처리된 이종이식 된 물고기는 DMSO 처리 된 물고기에 비해 이종이 식 세포 질량에서 가장 크고 가장 일관된 감소를 보였다. 덱사메타손 처리된 생선은 빈크리스틴에 비해 종양 부위의 약 절반 감소를 보였지만, 여전히 DMSO에 비해 종양 영역의 감소를보였다(도 3). 이것은 그들의 백혈병이 덱사메타손과 빈크리스틴의 조합으로 치료에 급속하게 반응했기 때문에 환자에서 보인 무슨을 모방했습니다. 이러한 결과는 제브라피시 이종이식 모델이 약물 스크리닝 및 자동 이미징 및 정량화를 준수할 수 있는 능력을 입증하여 다양한 약물 또는 약물 조합으로 다양한 환자 샘플 또는 세포주를 테스트하는 플랫폼을 제공합니다.
그림 1: 이종이식 약물 스크린 및 이미징 워크플로우. 형광 현미경 장착 이미징 유닛 및 자동 샘플러 유닛에 대한 이미징을 포함하여 제브라피시 유충 및 수행 약물 스크린의 이종이식 워크플로우의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이식된 물고기를 선별하는 사출 부위 및 대표적인 이미지. 2 dpf 제브라피쉬 유충의 노른자(A)또는 심낭(B)에주입 시 마이크로 인젝터 바늘의 이미지. 2 dpi에서 스크리닝의 대표적인 이미지는 약물 스크린을 위한 제브라피시의 선택을 묘사한다(C,D). 비슷한 생생을 가진 제브라피쉬(1-3 및 1'−3')를 선택해야 하며, 생생하지 않은 제브라피시(5및 5')를 제거해야 합니다. 노른자 주입 된 물고기의 경우, 노른자의 테두리가 생육 세포 질량 (4) 주위에 보이지 않는 물고기를 제거하여 정량화가 어려워집니다. 심낭 주입 물고기에 대 한, 주입 된 세포 질량 노른자 주머니에 잠식 물고기를 제거 (4'). 배율 표시줄 = 0.5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 약물 치료는 생체 내에서 이종이식 종양 영역을 감소시킬 수 있다. DMSO 또는 약물, 빈크리스틴 또는 덱사메타손으로 치료 3 일 후 심낭 또는 노른자에 주입 된 제브라피시의 대표적인 이미지. 이식된 종양 질량의 영역은 ImageJ를 사용하여 형광 임계값을 설정하고, 설정된 임계값 이상의 모든 픽셀을 선택하고, 선택한 영역의 면적 및 평균 형광을 측정함으로써 정량화되었다. 선택한 임계값 위의 픽셀은 검은색으로 표시되며 임계값 아래의 픽셀은 흰색으로 표시됩니다. 픽셀은 노른자 및 심낭 주입 제브라피시이미지(A)에서모두 측정하였다. 빈크리스틴을 가진 처리는 n=4 군 당 처리된 물고기와 DMSO 대조군에 비해 생착한 종양 지역에 있는 감소로 이끌어 냈습니다(B). SD = 표준 편차. 배율 표시줄 = 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구에서, 우리는 이종이식 모델로서 제브라피시로 1차 환자 백혈병 세포를 해동하고 주입하는 표준화된 방법을 입증하였다. 또한 형광 현미경 장착 영상 장치 및 자동 샘플러 유닛을 사용하여 이종이식 제브라피시의 고처리량 약물 스크리닝 프로토콜을 수립했습니다. 이전에는 이종이식은 인간 세포주로 보고되었으며, 이종이식 종양을 높은 처리량 방식으로 정량화하는 것은 현장에서 어려운 과제였습니다. 이 방법은 특정 환자의 암이 반응할 수 있는 약물을 예측하기 위해 고처리량 약물 스크린을 수행하는 궁극적인 목표와 함께 이종이식 제브라피시의 이미징을 자동화하는 방법으로 형광 현미경 장착 영상 장치 및 자동 샘플러 유닛을 활용하는 연구의 기초역할을 하며, 보다 맞춤화된 의학의 가능성을 열어줄 것입니다.
이 프로토콜의 대부분을 자동화할 수 있음에도 불구하고 간과해서는 안 되는 기술적 과제가 여전히 많이 있습니다. 첫째, 세포가 얼룩진 후 가능한 한 빨리 얼룩이 져서 세포 응집과 세포 사멸을 방지하는 것이 중요합니다. 유충은 세포 염색 프로토콜을 수행하기 전에 디코리오네이팅되어야 합니다. 유리 필라멘트 바늘은 또한 바늘 막힘을 감소시키기 위하여 바늘을 적재하기 전에 차가운 유지되어야 합니다. 또한, 6개월에서 1년 사이의 건강한 성체 얼룩말에서 생성된 배아를 사용하는 것은 이종이식 유충의 최상의 생존을 보장하는 데 매우 중요합니다. 마지막으로, 이종이식 된 물고기는 종양 생착에 대해 신중하게 선별되어야하며, 유사한 종양 볼륨을 가진 물고기만 최종 결과에서 가변성을 줄이기 위해 약물 스크리닝에 사용해야합니다.
우리는 우리의 실험을 위해 1 차적인 참을성 있는 백혈병 PBMC를 이용하더라도, 이 프로토콜은 어떤 종양 모형 또는 암 세포주든지로 수행될 수 있습니다. 배양에서 세포주, 부착 세포는 염색 프로토콜을 진행하기 전에 트립시니화한 다음 PBS에서 세척해야 합니다. 또한 생착률은 한 샘플에서 다음 샘플및 샘플 유형15사이에 다를 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 예를 들면, 우리의 PBMC 견본에서, >90% 순환 PBMC의 백혈병 돌풍이었습니다, 그러나 이 수는 생착 비율에 영향을 미칠 수 있는 다음 에 한 환자에서 현저하게 변화할 수 있습니다. 결과는 동일한 샘플 유형 내에서 DMSO 대조군과 비교되기 때문에 생착 속도에 대한 내부 제어가 있지만 zebrafish당 얼마나 많은 세포를 주입할지 결정할 때 이러한 변화를 고려해야 합니다. 동물당 250-1,000개의 세포를 섭취했을 때 성공을 거두었으며, 500세포는 연구에 최적입니다. 우리의 실험은 애벌레가 7 dpf 때 결론을 내렸지만, 우리는 면역 계통이 이 시점에서 발전하기 시작하고, 인간 세포의 거부를 일으키는 원인이 되기 때문에, 더 긴 시간 동안 동물에서 살아남기 위하여 이종이식을 기대하지 않을 것입니다. 면역 손상제브라피시 라인은 prkdc-/-;il2rga-/- 인간 암 세포를 이식할 수 있는 제브라피쉬16,,17,장기간 이종이식 또는 약물 치료 후 종양 재발 을 평가하는 데 유용할 수 있습니다. 그러나, 이 면역 결핍 선은 heterozygotes로 유지되어야 합니다, 그래서 애벌레는 사용하기 전에 유전자형이어야 합니다. 동형 접합 물고기는 또한 약물 스크리닝 결과를 복잡하게 할 수 있습니다 인간 세포의 신뢰할 수있는 생착을 가능하게하기 위해 대식세포를 고갈시키는 약물로 치료해야합니다. 현재, 이 선은 면역 계통이 7 dpf18에서완전하게 작동하기 전에 완료될 수 있는 애벌레에 대규모 약 검열을 위해 실용적이지도 않으며 필요하지 않습니다.
우리의 대표적인 결과 심낭과 노 른 자 에 세포의 주입에 초점을 쉽게 하 고 주입의 속도 및 증가 생존; 그러나, 암세포는 다른 많은 해부학 적인 위치에 주입될 수 있고 우리는 Cuvier의 덕트, 두뇌, 복고풍 궤도 및 perivitelline 낭을 포함하여 그밖 사이트에 이 워크플로를 사용하여 성공했습니다. 또한, 애벌레 물고기 흡수 각 약물의 얼마나 많은 추정 하기 어렵다; 몇몇 약이 이용되는 경우에, 이상적으로 는 최대 허용량 (MTD)를 결정하기 위하여 대규모 분석법 의 범위 (일반적으로 0.1 에 25 μM)의 범위에서 독성 스크린이 수행될 것입니다. 우리는 우리의 분석에 대 한 각 약물에 대 한 MTD를 사용 하기로, 그러나, 10 μM 약물의 일반적으로 높은 처리량 약물 스크리닝에 대 한 시작 농도로 제브라피시 분야에서 사용 하 고 일반적으로 잘 용납. 풀에서 약물의 조합은 초기 스크린으로서 사용될 수 있으며, 또한, 대용량 화합물라이브러리(19)를통해 스크리닝의 효율을 높일 수 있다.
이 접근 방식은 이전에 보고된 워크플로우보다 더 자동화되고 효율적이지만, 이 프로토콜은 여전히 제브라피시 마이크로주입 에 대한 사전 경험이 없는 모든 사람에게 노동 집약적이고 기술적으로 까다로운 프로토콜입니다. 제브라피시 이종이식에서의 약물 스크리닝은 화합물 라이브러리의 체외 스크리닝의 용이성 및 효능에 도달할 가능성이 거의 없으며 마우스 이종이식 모델의 몇 가지 장점이 결여되어 있다. 예를 들어, 제브라피시 이종이식의 한 가지 주요 제한사항은 세포 뱅킹 이나 대부분의 하류 실험에 유용한 숫자로 이종이식 을 한 후 암세포를 물고기에서 쉽게 회수 할 수 없다는 것입니다. 이것이 가능하더라도, 인간 암세포는 비 생리적인 온도 및 환경에서 며칠 동안 성장하고 있었고 나중에 응용 프로그램에서 사용하기에는 실용적이지 않을 것입니다. 약물 역학 및 종양 세포 반응에 대한 생리적 온도보다 약간 낮은 효과도 알려져 있지 않으며, 혼란스러운 결과를 생성할 수 있다. 이러한 경고에도 불구하고, 제브라피시 이종이식은 마우스 이종이식 모델에서 가능한 것보다 생체 내 약물 스크린에서 더 큰 규모를 수행하는 보다 실용적이고 비용 효율적인 방법이라는 면에서 빈 공간을 채웁니다. 또한 zebrafish 이종이식은 마우스 모델보다 주사를 위한 세포수가 훨씬 적기 때문에 소량의 환자 샘플이 수백에서 수천 개의 제브라피시 사이에 확산되어 샘플 수가 많은 약물 스크린을 사용할 수 있습니다. 형광 라벨링을 사용하면 종양 세포가 애벌레 제브라피시로 이식되는 순간부터 모니터링할 수 있어 약물 스크린에 사용되는 동물 간에 일부 표준화를 제공합니다. zebrafish 이종이식의 이러한 이점과 이식된 세포의 자동 이미징 및 정량화의 가능성을 결합하면 맞춤형 의학을 위한 환자 종양의 고처리량 약물 스크리닝을 실현할 수 있는 많은 가능성을 열어줍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 V 재단 V 학자 상과 NIH 교부금 DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. 블랙번) 및 NIH 교육 보조금 T32CA165990 (M.G. Haney에)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
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