Модели ксенотранспланта зебрафиш позволяют проводить скрининг с высокой пропускной мощностью и флуоресцентную визуализацию раковых клеток человека в микроокружении in vivo. Мы разработали рабочий процесс для крупномасштабного, автоматизированного скрининга лекарственных средств на образцах лейкемии, полученных от пациента, у зебры с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа, оборудованного блоком визуализации.
Пациент производные модели ксенотрансплантата имеют решающее значение в определении того, как различные виды рака реагируют на лечение наркотиками в системе in vivo. Мыши модели являются стандартом в этой области, но зебрафиш стали альтернативной моделью с рядом преимуществ, в том числе возможность высокой пропускной способности и недорогих наркотиков скрининга. Зебрафиш также позволяют для in vivo скрининга наркотиков с большими номерами репликации, которые ранее были доступны только с системами in vitro. Возможность быстро выполнять крупномасштабные экраны наркотиков может открыть возможность для персонализированной медицины с быстрым переводом результатов обратно в клинику. Модели ксенотрансплантата зебрафиш также могут быть использованы для быстрого скрининга на действия мутаций на основе реакции опухоли на целевую терапию или для выявления новых противораковых соединений из крупных библиотек. В настоящее время основным ограничением в этой области является количественное и автоматизация процесса, с тем чтобы экраны наркотиков можно было сделать в более широком масштабе и быть менее трудоемким. Мы разработали рабочий процесс для ксенотрансплантации первичных образцов пациентов в личинки зебры и выполнения крупномасштабных экранов наркотиков с помощью флуоресцентного микроскопа оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплер. Этот метод позволяет стандартизировать и количественно привязать область опухоли и ответ на медикаментозное лечение в большом количестве личинок зебры. В целом, этот метод является выгодным по сравнению с традиционной клеточной культуры скрининга наркотиков, как это позволяет для роста опухолевых клеток в среде in vivo на протяжении всего лечения наркотиками, и является более практичным и экономически эффективным, чем мышей для крупномасштабных in vivo наркотиков экранов.
Xenografting первичных раковых заболеваний пациента или раковых клеток человека линий в модель организмов является широко используемым методом для изучения прогрессирования опухоли и поведения in vivo, реакция опухоли на лечение наркотиков, и взаимодействие раковых клеток с микросредой, среди других. Традиционно, клетки ксенопригватом в иммунно-компрометированных мышей, и это остается стандартом в этой области. Тем не менее, эта модельная система имеет ряд ограничений, таких как высокая стоимость, низкие цифры репликации, трудности в точной количественной опухолевой нагрузки in vivo, и длительное время, которое требуется для опухолей, чтобы привить и тестирование на наркотики, которые должны быть завершены. В последние годы, зебравый стали альтернативной модели ксенотрансплантата, с первым сообщается в 2005 году, с зеленым флуоресцентным белком (GFP) помечены человеческой меланомы клеточных линий пересажены в бластулы стадии эмбрионов1,2. Совсем недавно, 2 дня после оплодотворения (dpf) личинки зебры были использованы в качестве получателей ксенотрансплантата, чтобы обеспечить контроль анатомического расположения инъекций и для использования в высоком разрешении in vivo изображений взаимодействия опухоли с окружающей микросредой3,4.
Зебрафиш предлагает много преимуществ в качестве модели ксенотрансплантата. Во-первых, взрослых зебры можно разместить и быстро разводить в больших количествах по относительно низкой цене. Каждая пара взрослых зебр ы может производить сотни личинок рыбы в неделю. Из-за их небольшого размера, эти личинки зебры могут быть сохранены в 96-колодцев для высокой пропускной связи наркотиков скрининга. Larvae не должны быть поданы в ходе типичного эксперимента ксенотрансплантата, так как их желток-мешок обеспечивает питательные вещества для поддержания их в течение первой недели жизни. Кроме того, зебрафиш не имеют полностью функциональной иммунной системы до 7 dpf, а это означает, что они не требуют облучения или иммуносупрессивных схем до инъекции ксенотрансплантата. Наконец, оптически четкие линии зебры позволяют с высоким разрешением изображения опухолево-микроэкологических взаимодействий.
Возможно, наиболее перспективным применением зебры в качестве модели ксенотрансплантата является способность выполнять высокопроизводительный скрининг наркотиков на образцах рака человека таким образом, что это невозможно с помощью любого другого модельного организма. Larvae поглощают наркотики из воды через кожу, повышая легкость введения препарата5. Поскольку животные поддерживаются в 96-колодцах, как правило, в 100-300 л воды, экраны требуют меньших количеств наркотиков по сравнению с мышами. В настоящее время существует несколько различных методов стандартизации и количественной оценки влияния препаратов на бремя опухолей человека у зебры, некоторые из которых являются более практичными, чем другие, для масштабирования одного тестирования на наркотики для скрининга с высокой пропускной стоимостью. Например, некоторые группы разъединяют рыбу на одноклеточные суспензии и количественно флуоресцентно помечены или окрашенные опухолевые клетки путем визуализации отдельных капель подвески и количественной флуоресценции с помощью полуавтоматическогоМакро-4ImageJ . Полуавтоматический метод визуализации цельноликов был разработан, в котором личиночные рыбы были зафиксированы в 96-колодцах пластин и изображены с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа перед перегруппировкой композитных изображений и количественной оценкой очагов опухолевых клеток6. Оба эти анализы являются довольно трудоемкими методами количественной оценки, которая сделала действительно высокой пропускной способ скрининга наркотиков в модели ксенотрансплантата зебра непрактично.
Этот вопрос был решен в результате разработки Vertebrate Автоматизированная технология скрининга (VAST) Bioimager и большой частицы (LP) Sampler, флуоресценция микроскоп оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплер (Рисунок 1 и таблица материалов), который является действительно автоматизированным методом для высокой пропускной записи личинки зебры7,8,9. С помощью этого устройства, рыбы под анестетом, взяты автоматически из 96-колодец пластины, расположенные в капилляре и вращается в набор ориентации на основе заданных предпочтений пользователя, изображения, а затем либо помещены обратно в тот же колодец нового 96-ну пластины для дальнейших исследований или отбрасываются. Сочетание этой технологии визуализации с зебрафиш ксенотрансплантатов может позволить возможность персонализированной медицины, которая использует высокой пропускной связи скрининга наркотиков крупных библиотек соединения наркотиков против отдельных опухолей пациента. Кенотранспланты зебрафиш также предлагают крупномасштабный и недорогой метод для проверки токсичности и эффективности новых соединений in vivo. Зебрафиш может быть использован в качестве предварительного шага скрининга, прежде чем приступить к мыши ксенотрансплантат модели.
Мы разработали обтекаемый рабочий процесс для ксенотрансплантации первичных клеток лейкемии пациента в зебрафиш и выполнения высокой пропускной записи наркотиков экраны с автоматизированной визуализации и количественной оценки, которые могут быть применены к любой другой первичной опухолевых клеток пациента или раковой линии клеток. Этот рабочий процесс использовал флуоресцентный микроскоп оборудованный блок визуализации и автоматизированный блок сэмплердля для улучшения текущих методов стандартизации и количественной оценки и предлагает автоматизированную альтернативу предыдущим, более трудоемким методам количественной оценки опухолевой массы in vivo.
В этом исследовании мы продемонстрировали стандартизированный метод оттаивания и инъекции первичных клеток лейкемии пациента в зебрафиш в качестве модели ксенотрансплантата. Мы также установили протокол для высокой пропускной записи наркотиков скрининга ксенотрансвированных зебр…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано V Фонд V Стипендиат премии и NIH Гранты DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. Блэкберн) и NIH Обучение Грант T32CA165990 (М.Г. Хэйни).
10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |