Summary
نماذج زيونوجراف وزينوجراف تسمح لفحص المخدرات عالية الإنتاجية والتصوير الفلورسنت للخلايا السرطانية البشرية في بيئة صغيرة في الجسم الحي. قمنا بتطوير سير عمل لفحص المخدرات على نطاق واسع آلي على عينات سرطان الدم المشتقة من المريض في سمك الحمار الوحشي باستخدام مجهر الفلورسينس الآلي مجهزوحدة التصوير.
Abstract
نماذج xenograft المشتقة من المريض حاسمة في تحديد كيفية استجابة السرطانات المختلفة للعلاج الدوائي في نظام في الجسم الحي. نماذج الماوس هي المعيار في هذا المجال، ولكن ظهرت حمار وحشي كنموذج بديل مع العديد من المزايا، بما في ذلك القدرة على فحص المخدرات عالية الإنتاجية ومنخفضة التكلفة. الحمار الوحشي يسمح أيضا في فحص المخدرات في الجسم الحي مع أعداد تكرار كبيرة التي كانت في السابق فقط يمكن الحصول عليها مع في النظم المختبرية. القدرة على أداء بسرعة شاشات المخدرات على نطاق واسع قد تفتح إمكانية للطب شخصية مع الترجمة السريعة للنتائج مرة أخرى إلى العيادة. يمكن أيضًا استخدام نماذج زينوسوهوتورفيش الوحشية للفحص السريع للطفرات القابلة للتنفيذ استنادًا إلى استجابة الورم للعلاجات المستهدفة أو لتحديد مركبات جديدة مضادة للسرطان من المكتبات الكبيرة. والقيود الرئيسية الحالية في هذا المجال هي تحديد العملية كميا وأتمتة هاوية بحيث يمكن إجراء شاشات الأدوية على نطاق أوسع وتكون أقل كثافة في اليد العاملة. لقد قمنا بتطوير سير عمل لعينات المريض الأولية xenografting في يرقات حمار وحشي وأداء شاشات المخدرات على نطاق واسع باستخدام مجهر الفلورسينس وحدة التصوير المجهزة ووحدة العينات الآلية. تسمح هذه الطريقة بتوحيد وقياس مساحة الورم المطعمة والاستجابة للعلاج الدوائي عبر أعداد كبيرة من يرقات سمك الحمار الوحشي. عموما، هذه الطريقة مفيدة على الخلايا التقليدية الخلايا فحص المخدرات لأنها تسمح لنمو الخلايا السرطانية في بيئة في الجسم الحي في جميع أنحاء العلاج بالعقاقير، وأكثر عملية وفعالة من حيث التكلفة من الفئران على نطاق واسع في شاشات المخدرات على الهواء.
Introduction
Xenografting من سرطانات المرضى الأولية أو خطوط الخلايا السرطانية البشرية في الكائنات الحية النموذجية هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لدراسة تطور الورم والسلوك في الجسم الحي، واستجابة الورم للعلاج من المخدرات، وتفاعل الخلايا السرطانية مع البيئة الدقيقة، من بين أمور أخرى. تقليديا، يتم تطعيم الخلايا في الفئران المحصنة، وهذا لا يزال المعيار في هذا المجال. ومع ذلك، هذا النظام النموذجي لديه العديد من القيود، مثل ارتفاع التكلفة، وانخفاض الأرقام المتكررة، والصعوبات في تحديد حجم دقيق عبء الورم في الجسم الحي، والوقت الممتد الذي يستغرقه الأورام لغير المطعم واختبار المخدرات ليتم الانتهاء منها. في السنوات الأخيرة، ظهرت سمك الحمار الوحشي كنموذج xenograft بديل، مع أول يجري الإبلاغ عنها في عام 2005، مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وصفت خطوط خلايا الميلانوما البشرية المزروعة في الأجنة في مرحلة الانفجار1,,2. في الآونة الأخيرة، تم استخدام 2 يوم بعد الإخصاب (dpf) يرقات حمار وحشي كمستلمين xenograft للسماح للسيطرة على الموقع التشريحي للحقن واستخدامها في دقة عالية في تصوير الجسم الحي من تفاعل الورم مع البيئة الدقيقة المحيطة3,4.
حمار وحشي تقدم العديد من المزايا كنموذج xenograft. أولاً، يمكن إيواء سمك الحمار الوحشي البالغ وتربيته بسرعة بكميات كبيرة بتكلفة منخفضة نسبياً. يمكن لكل زوج من التزاوج من سمك الحمار الوحشي البالغ إنتاج مئات من الأسماك اليرقات في الأسبوع. نظرًا لصغر حجمها ، يمكن الحفاظ على هذه السمكة الوحشية اليرقية في 96 لوحة جيدة لفحص المخدرات عالية الإنتاجية. لا يجب تغذية اليرقات أثناء تجربة xenograft النموذجية ، حيث يوفر صفارها - كيس العناصر الغذائية للحفاظ عليها في الأسبوع الأول من حياتها. وعلاوة على ذلك، لا تحتوي سمك الحمار الوحشي على جهاز مناعي يعمل بكامل طاقته حتى 7 dpf، مما يعني أنها لا تتطلب تشعيع أو نظم مثبطة للمناعة قبل حقن xenograft. وأخيراً، تسمح خطوط سمك الحمار الوحشي الواضحة بصريًا بالتصوير عالي الدقة للتفاعلات بين الورم والبيئة الدقيقة.
ولعل التطبيق الواعد من حمار وحشي كنموذج xenograft هو القدرة على إجراء فحص المخدرات عالية الإنتاجية على عينات السرطان البشري بطريقة غير ممكنة باستخدام أي كائن حي نموذج آخر. تمتص اليرقات الأدوية من الماء عبر الجلد ، مما يعزز سهولة إدارة الدواء5. ولأن الحيوانات تُحتفظ بها في لوحات 96 بئراً، وعادة ما تكون في 100-300 ميكرولتر من المياه، فإن الشاشات تتطلب كميات أدوية أصغر مقارنة بالفئران. حاليا، هناك عدة طرق مختلفة لتوحيد وتقدير تأثير المخدرات على عبء الورم البشري في سمك الحمار الوحشي، وبعضها أكثر عملية من غيرها لتوسيع نطاق اختبار المخدرات واحد إلى فحص عالية الإنتاجية. على سبيل المثال، تقوم بعض المجموعات بفصل الأسماك إلى تعليق خلية واحدة، والقياس الكمي للخلايا السرطانية المسماة أو الملطخة بالفلورسنت عن طريق تصوير قطرات فردية من التعليق وقياس الفلورسيز باستخدام ماكرو ImageJ شبه الآلي4. تم تطوير طريقة تصوير شبه آلية لليرقات الكاملة تم فيها إصلاح أسماك اليرقات في لوحات 96 بئرًا وتصويرها باستخدام مجهر فلوري مقلوب قبل إعادة تنظيم الصور المركبة والقياس الكمي لبؤر الخلايا السرطانية6. كل من هذه المقالات هي أساليب كثيفة العمالة إلى حد ما للقياس الكمي، والتي جعلت حقا فحص المخدرات عالية الإنتاجية في نماذج xenograft سمك الحمار الوحشي غير عملي.
وقد تم تناول هذه المسألة من خلال تطوير التكنولوجيا الخاصة بالفحص الآلي الفقارية (VAST) Bioimages و الجسيمات الكبيرة (LP) العينات ، والمجهر الفلورسينس مجهزة وحدة التصوير والآلي وحدة أخذ العينات(الشكل 1 وجدول المواد)، وهو وسيلة مؤتمتة حقا لتصوير عالية الإنتاجية من يرقات حمار وحشي7،8،9. مع هذه الوحدة ، يتم كشف الأسماك ، أخذ عينات تلقائيًا من لوحة 96 - جيدًا ، يتم وضعها في شعرية وتدويرها في اتجاه المجموعة استنادًا إلى تفضيل المستخدم المحدد مسبقًا ، والصورة ، ثم يتم وضعها مرة أخرى في نفس البئر من لوحة 96-well جديدة لمزيد من الدراسات أو يتم التخلص منها. الجمع بين هذه التكنولوجيا التصوير مع زيوجرافات حمار وحشي قد تسمح لإمكانية الطب الشخصي الذي يستخدم عالية الإنتاجية فحص المخدرات من المكتبات المركبة المخدرات الكبيرة ضد أورام المرضى الفردية. كما تقدم زيينوجرافات حمار وحشي طريقة واسعة النطاق ومنخفضة التكلفة لاختبار كل من سمية وفعالية المركبات الجديدة في الجسم الحي. يمكن استخدام سمك الحمار الوحشي كخطوة فحص أولية قبل الشروع في نماذج xenograft الماوس.
لقد قمنا بتطوير سير عمل مبسط لخلايا سرطان الدم المريض الأولي ة xenografting في حمار وحشي وأداء شاشات المخدرات عالية الإنتاجية مع التصوير الآلي والقياس الكمي، والتي يمكن تطبيقها على أي خلايا الورم المريض الأولية الأخرى أو خط الخلايا السرطانية. استخدم سير العمل هذا مجهر فلورسينس مجهز بوحدة تصوير ووحدة عينات آلية لتحسين طرق التوحيد والقياس الكمي الحالية ويقدم بديلاً آلياً للطرق السابقة الأكثر كثافة في العمل لتحديد كتلة الورم في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كنتاكي (البروتوكول 2015-2225). تم جمع عينات المرضى تحت مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة كنتاكي (البروتوكول 44672). يجب أن تتم الموافقة على جميع التجارب الحيوانية التي أجريت بعد هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية للمستخدم واستخدامه.
1. إذابة المريض الأولي خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد
- إذابة المريض الأولي الخلايا أحادية النووي الدم المحيطي (PBMCs) من المخزون المجمد في حمام المياه 37 درجة مئوية. مباشرة بعد ذوبان الخلايا، نقل الخلايا في وسائل الإعلام تجميد (90٪ FBS + 10٪ كبريتيد ثنائي ميثيل [DMSO]) إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع أنبوب بطيء، وتجنب فقاعات الهواء. أضف 10 مل من وسائط الذوبان الفاترة 37 درجة مئوية (25٪ مصل البقري الجنيني [FBS] في وسيط دولبيكو المعدل في Iscove [IMDM]) dropwise (حوالي 2-3 s لكل مل) إلى الخلايا في الأنبوب المخروطي 15 مل.
ملاحظة: تم جمع PBMCs من عينات دم المريض في وقت التشخيص. تم فصل معطف بافي عن طريق الطرد المركزي كثافة وغسلت الخلايا 2x في RPMI 1640 + 10٪ FBS. تم إحصاء الخلايا وتجميد 107 خلايا في القارورة بـ 1 مل من الوسائط المتجمدة، وتم تخزينها عند -80 درجة مئوية. - خلايا الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 10 دقيقة وتستنشق وسائل الإعلام من بيليه الخلية. كرر إضافة وسائل الإعلام ذوبان الجليد، الطرد المركزي، والتطلع مرة واحدة إضافية لإزالة أي DMSO المتبقية.
- إعادة تعليق الخلايا في 5 مل من المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS) وإزالة 10 ميكرولتر للعد على عداد الخلية الآلي أو مقياس الهيموكيتومتر. أضف 10 ميكرولتر من التريببان الأزرق إلى 10 ميكرولتر من الخلايا التي تمت إزالتها للعد. عد عدد الخلايا لكل مل وسجل لحساب وحدة التخزين في وقت لاحق لإعادة تعليق الخلايا في لxenografting (انظر الخطوة 2.5).
ملاحظة: عادة، يتم تطعيم 500 خلية لكل سمك حمار وحشي يرقات. على سبيل المثال، هناك حاجة إلى 5 × 105 خلايا لحقن 1000 حمار وحشي. وينبغي أن تكون قابلية البقاء > 85٪ لاستخدامها لxenografting. في هذه التجربة، كانت صلاحية الخلية 96٪ بعد ذوبان، وتقييمها بواسطة تلطيخ الأزرق trypan.
2. الخلايا تسمية الفلورسنت مع DiI
- الطرد المركزي عدد الخلية المطلوبة في 5 مل من برنامج تلفزيوني في 200 × ز لمدة 5 دقيقة وينتشق supernatant. وصمة عار ما لا يقل عن 2 × 106 خلايا في حالة تكتل أو مشاكل في تحميل الإبرة أثناء الحقن.
- جعل 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (Di) محلول تلطيخ (5 مل من PBS تحتوي على 4 ميكرولتر لكل مل من وصمة عار Di, جدول المواد)وإعادة تعليق بيليه الخلية في محلول تلطيخ.
ملاحظة: يجب ألا تتجاوز كثافة الخلية 2 × 106 خلايا /مل عند إعادة تعليقها في محلول تلطيخ. - الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة 20 دقيقة، دوامة بلطف، ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
- خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقيقة وتستنشق supernatant. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقيقة وتستنشق supernatant. كرر الغسيل، الطرد المركزي، والطموح مرة واحدة إضافية.
- إعادة تعليق الخلايا في 1 ميكرولتر من PBS لكل 250،000 الخلايا الحية ونقلها إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق. الحفاظ على الخلايا المعلّقة على الجليد في الظلام والاستمرار على الفور في الحقن المجهري.
ملاحظة: وهذا يضمن حقن 500 خلية مريضة في سمك الحمار الوحشي مع كل مضخة حقن من حجم 2 nL.
3. حقن جزيئات حمار وحشي بالصغر
ملاحظة: وينبغي الانتهاء من الحقن المجهري ة في غضون 1-3 ساعة من تلطيخ لتحسين صلاحية الخلايا.
- قبل تلطيخ الخلايا والحقن، وجعل لوحات agarose للحقن عن طريق صب 25 مل من 3٪ agarose في 1x تريس / بورات / EDTA (TBE) في طبق بيتري والسماح لها لترسيخ. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- أيضا قبل تلطيخ الخلايا والحقن، dechorionate 2 dpf حمار وحشي باستخدام ملقط تحت المجهر تشريح. لdechorionation اليدوية، وسحب من طرفي نقيض من الكورال واقية من حمار وحشي مع ملقط حتى دموع الكورري وحمار وحشي يصبح unenveloped10.
ملاحظة: ويمكن أيضا أن يتم إجراء dechorionation باستخدام العلاج الأنزيمي مع pronase، كما وصف سابقا10. كاسبر (روي-/-;nacre-/-)تم استخدام سمك الحمار الوحشي لهذه التجارب11. يمكن استخدام أي سلالة يرقة حمار وحشي لxenografting. إذا كان الصباغ يتداخل مع التصوير أو التصور، يمكن استخدام العلاج بروبيلثيوراسيل (PTU) لمنع تخليق الميلانين إذا لم تتوفر سلالات حمار وحشي واضحة بصريا12. - إبر بريل في 4 درجة مئوية أو على الجليد لمنع تكتل الخلايا أثناء الحقن المجهري. تحميل 5 ميكرولتر من الخلايا الملونة في إبرة الزجاج borosilicate غير المخمرة غير اللمعة باستخدام نصائح ماصة microloader.
ملاحظة: وقد نشرت سابقا Microinjector وطرق الإعداد إبرة13. - تحميل الإبرة في ذراع الحقن المجهري. شطب طرف الإبرة باستخدام شفرة حلاقة معقمة. قياس حجم قطرات في الزيوت المعدنية باستخدام ميكرومتر المرحلة، والحفاظ على حجم قطرات باستمرار في 2 nL (~ 0.15 ملم قطرها) في جميع أنحاء.
- استخدام 350 ميكرولتر من 4 ملغ / مل tricaine-S لanesthetize ~ 30 dechorionated 2 dpf حمار وحشي في طبق بيتري التي تحتوي على 25 مل من وسائل الإعلام E3. بعد ~ 1 دقيقة نقل اليرقات التي تعمل بحقن عقار إلى صفيحة حقن سطح مستو (3٪ agarose في طبق بيتري) وحقن اليرقات بمضخة واحدة من الخلايا الملطخة في موقع الحقن المطلوب (على سبيل المثال ، الصفار أو التاموريوم ؛ انظر الشكل 2A، B).
ملاحظة: يجب اختيار موقع الحقن بناءً على هدف التجربة. موقع الحقن الأكثر شيوعا هو صفار. للحصول على الخلايا المتداولة في مجرى الدم، يمكن استخدام pericardium، قناة كوفييه، الفضاء perivitelline، أو الفضاء المداري الرجعية كمواقع الحقن. يمكن أيضًا استخدام مواقع الحقن التقويمية، مثل الدماغ. - غسل اليرقات من لوحة الحقن في 10 سم2 طبق بيتري (30 يرقات لكل لوحة) التي تحتوي على الوسائط E314 دون الميثيلين الأزرق والمحتضن في 28 درجة مئوية لفترة 1 ساعة الانتعاش. استمر في الحقن حتى يتم حقن عدد مرغوب فيه من اليرقات.
ملاحظة: من الناحية المثالية، حقن 2-2.5 أضعاف عدد اليرقات اللازمة للتجارب. سيكون هناك بعض الموت من اليرقات بسبب الإجهاد الناجم عن الحقن وزيادة درجة حرارة الحضانة. عادة، بعد الممارسة مع هذه التقنية، يمكن حقن 800-1500 يرقات حمار وحشي من قبل شخص واحد في غضون 1-3 ساعة عندما ينبغي حقن الخلايا الملطخة. - نقل لوحات من اليرقات المحقونة إلى حاضنة 34 درجة مئوية. لا تضع أطباق بيتري من اليرقات مباشرة على رف معدني في الحاضنة لمنع ارتفاع درجة حرارة الماء E3. على سبيل المثال، ضع طبق بتري فارغ بين الرف وطبق بيتري من اليرقات ليكون بمثابة عازل. إزالة يرقات سمك الحمار الوحشي الميت بعد 24 و 48 ساعة بعد الحقن (hpi).
4. إعداد شاشة المخدرات مع زينوجراففيش حمار وحشي
-
في 48 hpi، ويرقات حمار وحشي الشاشة لالفلورسينس / ورم الطعوم والصحة(الشكل 2C، D). قم بإزالة أي سمكة حمار وحشي ميتة أو مشوهة وحدد سمك الحمار الوحشي بتطعيم مماثل(الشكل 2C وD و1−3 و1'−3'). إزالة حمار وحشي غير المطعمة(الشكل 2C, D, 5 و 5').
- بالنسبة للأسماك المحقونة من صفار، قم بإزالة الأسماك حيث لا يمكن رؤية حدود الصفار حول كتلة الخلية المطعمة(الشكل 2C، 4) لأنها تجعل القياس الكمي صعبًا. بالنسبة للأسماك التي يتم حقنها بالتامين، قم بإزالة الأسماك حيث تتعدى كتلة الخلية عن طريق الحقن في كيس الصفار(الشكل 2D،4').
- إضافة سمك الحمار الوحشي إلى لوحة 96 جيدا. للقيام بذلك، وقطع غيض من طرف ماصة 200 ميكرولتر، فقط كبيرة بما يكفي ل4 dpf حمار وحشي لتناسب من خلال. استنشق 150 ميكرولتر من الوسائط E3 مع سمكة حمار وحشي واحدة من اللوحة باستخدام ماصة P200 ، وإضافة إلى بئر فارغ من لوحة مسطحة القاع 96 بئر.
- تمييع الدواء الذي سيتم اختباره في الحجم المطلوب من الوسائط E3 ، بمعدل 150 ميكرولتر لكل بئر. إعداد المخدرات في 2 أضعاف التركيز المطلوب. على سبيل المثال، قم بإعداد 20 ميكرومتر من الدواء في E3 إذا كان التركيز النهائي المطلوب هو 10 ميكرومتر، لأن نصف الحجم الإجمالي في كل بئر يتكون من محلول الدواء. بالنسبة لمجموعة التحكم DMSO ، أضف DMSO بنفس حجم الدواء.
- أضف 150 ميكرولتر من محلول المخدرات المخفف 2x إلى كل بئر يحتوي على يرقات حمار وحشي في 150 ميكرولتر من E3 ، لحجم نهائي قدره 300 ميكرولتر مع محلول دواء 1 x لكل بئر.
- احتضان لوحة في 34 درجة مئوية. تحقق من وجود سمك حمار وحشي ميت يوميًا. بعد 2 أيام، إذا رغبت في ذلك، تحديث الدواء عن طريق إزالة 200 ميكرولتر من السائل من كل بئر من لوحة 96 بئر واستبدال مع 200 ميكرولتر من 1x محلول المخدرات المخفف أو DMSO في وسائل الإعلام E3.
ملاحظة: تم العثور على أفضل النتائج بعد 3 أيام من العلاج من المخدرات لهذه التجربة; ومع ذلك، يمكن أن تتراوح مدة العلاج من المخدرات بين 2-4 أيام وقد تحتاج إلى تحسين ها على أساس التجربة التي تجري أو المخدرات المستخدمة.
5. التصوير Xenografted سمك حمار وحشي باستخدام المجهر الفلوري وحدة التصوير المجهزة ووحدة العينات الآلي
- إعداد 1 لتر من تريشايين الطازجة 4 ملغ / مل و 1.5 لتر من وسائل الإعلام E3. ملء زجاجة وسائل الإعلام 1 مع وسائل الإعلام E3 وزجاجة وسائل الإعلام 2 مع tricaine.
- قم بإزالة جميع قنوات الفلورسنت غير المرغوب فيها في برنامج التصوير وإضافة القناة المطلوبة (DiI لهذه التجربة). تحقق من قناة الفلورسنت المطلوبة حيث سيتم التقاط صورة فقط للقنوات التي تحمل علامة اختيار. أيضا ، حدد كيف سيتم التقاط الصور (z - مداخن ، والأتمتة ، والحلقات في سلسلة ، الخ).
ملاحظة: لهذه التجربة، تم تعيين التركيز يدويا لكل سمكة صورة للحصول على أكبر عدد من الصور مع التركيز الأمثل. - صورة الأسماك السيطرة DMSO قبل الأسماك المعالجة بالمخدرات بحيث يمكن تعيين وقت التعرض المناسب في برنامج التصوير. بمجرد تعيين التعرض، لا تقم بتغيير وقت التعرض لمدة التجربة.
ملاحظة: يمكن إما تعديل التركيز يدويًا لكل حمار وحشي لضمان عدم وجود صور خارج التركيز ، أو للتصوير الآلي بالكامل ، يمكن استخدام نفس التركيز بين الأسماك مع الصور التي يتم التخلص منها أو إعادة تصوير الأسماك قبل إجراء التحليل. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء هذه التجربة باستخدام أي صور فلورية يتبعها قياس كمي للفلورسينس باستخدام برنامج ImageJ.
6. قياس الفلورسينس باستخدام ImageJ
- فتح برنامج ImageJ.
-
الانتقال إلى الملف | فتح وحدد ملف .czi المطلوب. سيقوم البرنامج بإنشاء نافذة خيارات الاستيراد.
- لعرض المكدس حدد Hyperstacks، تحقق من فتح الملفات بشكل فردي، تحقق من Autoscale، وتحقق من تقسيم القنوات. لخيار اللون حدد ملون .
- انقر فوق الإضافات | وحدات الماكرو | سجل.
- انقر على صورة | ضبط | العتبة. حدد نوع الصورة باللون الأحمر في القائمة المنسدلة على الجانب الأيمن من نافذة العتبة. ضبط الحد الأدنى حتى البرنامج هو تسليط الضوء فقط على المناطق مع الفلورسينس(الشكل 3A)وانقر فوق تطبيق. سيقوم البرنامج بتحويل الصورة إلى الأسود والأبيض ، مع المنطقة المحددة باللون الأسود.
ملاحظة: استخدم نفس العتبة لكل صورة في شاشة الدواء للحفاظ على النتائج موحدة وقابلة للمقارنة. - انقر فوق تحليل | قياس. سيقوم البرنامج بسحب نافذة نتائج تحتوي على منطقة الفلورسنت لتلك الصورة.
- انقر فوق إنشاء على إطار مسجل الماكرو. سيؤدي ذلك إلى فتح إطار جديد مع التعليمات البرمجية للماكرو. تسليط الضوء على جميع الصور المطلوبة للتحليل وفتح كما هو الحال في الخطوة 6.2.
- حدد تشغيل على النافذة باستخدام الماكرو. ستحتوي نافذة النتائج الآن على المنطقة لكل صورة.
ملاحظة: يمكن إجراء تحليل الصورة بشكل فردي دون تسجيل وتشغيل ماكرو وكذلك عن طريق تكرار الخطوات المذكورة أعلاه لكل صورة. - نسخ البيانات المقاسة في جدول بيانات. متوسط الفلورسينس الكلي لجميع عينات التحكم (DMSO). احسب الفرق في النسبة المئوية باستخدام الصيغة التالية: [(متوسط منطقة DMSO - المنطقة التجريبية) / متوسط منطقة DMSO] × 100٪(الشكل 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد البروتوكول المذكور أعلاه ، تم تطعيم سمك الحمار الوحشي في صفار وبيركارديوم مع ثنائي الفينيل متعدد البروم المريض الرئيسي التي كانت معزولة في الأصل عن مريض سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL) في التشخيص والمصرفية كعينة قابلة للحياة ومجمدة. في 48 hpi، تم فحص الأسماك xenografted للخلايا السرطانية المسمى الفلورسنت(الشكل 2C, D)وتعامل مع العلاج الكيميائي (ديكساميثازون أو فينكريستين) أو DMSO. تم تصوير الأسماك في 7 نقطة في البوصة، بعد 3 أيام على العلاج من المخدرات باستخدام المجهر الفلوري مجهزة وحدة التصوير ووحدة العينات الآلي(الشكل 3A).
تم قياس منطقة الفلورسنت / عبء الورم لكل سمكة تم صورتها باستخدام ImageJ ومقارنتها بين مجموعات العلاج من المخدرات المختلفة وDMSO(الشكل 3B). عموما، أظهرت الأسماك xenografted تعامل مع فينكريستين أكبر وأكثر اتساقا انخفاض في كتلة الخلية xenoined بالمقارنة مع الأسماك المعالجة DMSO. وأظهرت الأسماك المعالجة Dexamethasone حوالي نصف الانخفاض في منطقة الورم مقارنة مع فينكريستين، ولكن لا يزال أظهر انخفاضا في منطقة الورم مقارنة مع DMSO(الشكل 3). هذا يحاكي ما شوهد في المريض ، حيث استجاب سرطان الدم بسرعة للعلاج مع مزيج من ديكساميثازون وفينكريستين. هذه النتائج تبين قدرة نماذج xenograft حمار وحشي لتكون قابلة لفحص المخدرات والتصوير الآلي والقياس الكمي، وتوفير منصة لاختبار عينات مختلفة من المرضى أو خطوط الخلايا مع أدوية مختلفة أو تركيبات المخدرات.
الشكل 1: شاشة المخدرات Xenograft وسير عمل التصوير. تخطيطية سير عمل يرقات سمك الحمار الوحشي xenografting وأداء شاشة المخدرات، بما في ذلك التصوير على المجهر الفلوري وحدة التصوير المجهزة ووحدة العينات الآلي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: موقع الحقن والصور التمثيلية لفحص الأسماك المنطعة. صور إبرة الحقن المجهري في وقت الحقن إما في صفار(A)أو pericardium(B)من 2 dpf يرقات حمار وحشي. صور تمثيلية للفحص في 2 نقطة في البوصة تصور اختيار حمار وحشي لشاشة المخدرات(C, D). يجب اختيار سمك الحمار الوحشي مع تطعيم مماثل (1-3 و 1'−3') ، وينبغي إزالة سمك الحمار الوحشي غير المطعم (5 و 5') . بالنسبة للأسماك التي يتم حقنها من صفار، قم بإزالة الأسماك حيث لا يمكن رؤية حدود الصفار حول كتلة الخلية المطعمة (4) لأنها تجعل القياس الكمي صعبًا. بالنسبة للأسماك التي يتم حقنها في البيريكارديوم، قم بإزالة الأسماك حيث تتعدى كتلة الخلية عن طريق الحقن في كيس الصفار (4' ). شريط مقياس = 0.5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: العلاج الدوائي يمكن أن يقلل من منطقة الورم xenografted في الجسم الحي. صور تمثيلية من حمار وحشي حقن في التامركارديوم أو صفار بعد 3 أيام من العلاج مع DMSO أو المخدرات، إما vincristine أو ديكساميثازون. تم قياس مساحة كتلة الورم المطعمة عن طريق وضع عتبة الفلورسينس باستخدام ImageJ ، واختيار جميع البيكسلات فوق العتبة المحددة ، وقياس المنطقة ومتوسط الفلورسية للمناطق المختارة. تظهر وحدات البكسل فوق العتبة المحددة باللون الأسود، بينما تظهر البيكسلات أسفل العتبة باللون الأبيض. تم قياس وحدات البكسل في كل من صفار وpericardium حقن صور حمار وحشي(A). أدى العلاج بفينكريستين إلى انخفاض في منطقة الورم المطعمة بالمقارنة مع التحكم في DMSO مع n = 4 أسماك عولجت لكل مجموعة(B). SD = الانحراف المعياري. شريط مقياس = 250 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، أظهرنا طريقة موحدة لإذابة وحقن خلايا سرطان الدم المريض الأولي في حمار وحشي كنموذج xenograft. كما وضعنا بروتوكولًا لفحص الأدوية عالية الإنتاجية لسمك الحمار الوحشي xenografted باستخدام وحدة تصوير مجهزة بالمجهر الفلوري ووحدة أخذ العينات الآلية. في السابق ، تم الإبلاغ عن xenografts مع خطوط الخلايا البشرية ، وكان القياس الكمي للأورام الإكسينوجرافبطريقة عالية الإنتاجية تحديًا في هذا المجال. هذه الطريقة بمثابة أساس للدراسات للاستفادة من المجهر الفلوري وحدة التصوير المجهزة ووحدة العينات الآلي كوسيلة لأتمتة التصوير من سمك الحمار الوحشي xenografted، مع الهدف النهائي من أداء شاشات الأدوية عالية الإنتاجية للتنبؤ الأدوية التي يمكن أن يستجيب لسرطان مريض معين، مما يفتح إمكانية للحصول على دواء أكثر تخصيصا.
وعلى الرغم من القدرة على أتمتة الكثير من هذا البروتوكول، لا تزال هناك العديد من التحديات التقنية التي لا ينبغي إغفالها. أولاً، من المهم أن يتم حقن الخلايا في سمك الحمار الوحشي في أسرع وقت ممكن بعد تلطيخ لمنع تكتل الخلايا وموت الخلايا. يجب إزالة اليرقات قبل تنفيذ بروتوكول تلطيخ الخلايا. كما يجب الحفاظ على إبر خيوط الزجاج الباردة قبل تحميل الإبرة للحد من انسداد إبرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الأجنة التي تنتجها أسماك الحمار الوحشي البالغة الصحية التي تتراوح بين 6 أشهر إلى سنة واحدة أمر بالغ الأهمية لضمان أفضل صلاحية لليرقات الزناوجرافة. وأخيرا، ينبغي فحص الأسماك xenografted بعناية لتطعيم الورم، وينبغي استخدام فقط تلك مع أحجام ورم مماثلة في فحص المخدرات للحد من التباين في النتائج النهائية.
على الرغم من أننا استخدمنا سرطان الدم الأولي لمرضى سرطان الدم PBMCs لتجاربنا، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول مع أي نوع الورم أو خط الخلايا السرطانية. لخطوط الخلية في الثقافة، يجب أن تكون الخلايا المعتمة trypsinized ثم غسلها في برنامج تلفزيوني قبل الشروع في بروتوكول تلطيخ. من المهم أيضا أن نلاحظ أن معدلات التطعيم يمكن أن تختلف من عينة واحدة إلى أخرى وبين أنواع العينة15. على سبيل المثال، في عينة PBMC لدينا، > 90٪ من PBMCs المتداولة كانت الانفجارات اللوكيميا، ولكن هذا العدد يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا من مريض واحد إلى آخر، والتي قد تؤثر على معدل التطعيم. نظرًا لمقارنة النتائج بتحكم DMSO داخل نفس نوع العينة ، فهناك تحكم داخلي لمعدل التطعيم ، ومع ذلك يجب أن يؤخذ هذا الاختلاف في الاعتبار عند تحديد عدد الخلايا التي يجب حقنها لكل حمار وحشي. لقد وجدنا النجاح عند استخدام 250-1000 خلية تم حقنها لكل الحيوان، مع 500 خلية مثالية لدراساتنا. في حين أن تجاربنا خلصت عندما كانت اليرقات 7 dpf ، فإننا لا نتوقع xenografts البقاء على قيد الحياة في الحيوانات لنقاط زمنية أطول ، كما يبدأ الجهاز المناعي في التطور في هذه المرحلة ، ومن المرجح أن يسبب رفض الخلايا البشرية. وقد تم إنشاء خطوط حمار وحشي محصنة ، مع prkdc-/-؛ il2rga-/- سمك الحمار الوحشي قادرة على تطعيم الخلايا السرطانية البشرية16،17، والتي قد تكون مفيدة لxenografts على المدى الطويل أو تقييم تكرار الورم بعد العلاج بالعقاقير. ومع ذلك ، يجب الحفاظ على خطوط نقص المناعة هذه كهيتيروزيغوت ، لذلك يجب أن تكون اليرقات مكتوبة جينيًا قبل الاستخدام. كما يجب علاج أسماك الهومازيغوس بأدوية لاستنفاد الضامة لتمكين الطعوم الموثوقة للخلايا البشرية، مما قد يعقد نتائج فحص المخدرات. حاليا، هذه الخطوط ليست عملية ولا ضرورية لفحص المخدرات على نطاق واسع على اليرقات، والتي يمكن أن تكتمل قبل الجهاز المناعي يعمل بكامل طاقته في 7 dpf18.
تركز نتائجنا التمثيلية على حقن الخلايا في التامور وصفار الصفار لسهولة وسرعة الحقن وزيادة قابلية البقاء. ومع ذلك ، يمكن حقن الخلايا السرطانية في العديد من المواقع التشريحية الأخرى ، وقد كان لدينا نجاح باستخدام سير العمل هذا في مواقع أخرى ، بما في ذلك قناة كوفييه ، الدماغ ، الرجعية المدارية ، وكيس perivitelline. بالإضافة إلى ذلك، من الصعب تقدير مقدار كل دواء تمتصه أسماك اليرقات؛ إذا تم استخدام عدد قليل من الأدوية ، من الناحية المثالية سيتم إجراء شاشة سمية في مجموعة من الجرعات (عادة 0.1 إلى 25 ميكرومتر) قبل القول على نطاق واسع لتحديد الحد الأقصى للجرعة المسموح بها (MTD). اخترنا استخدام MTD لكل دواء للفحص لدينا، ومع ذلك، 10 μM من المخدرات يستخدم عادة في حقل حمار وحشي كتركيز البداية لفحص المخدرات عالية الإنتاجية وعموما جيد التحمل. يمكن استخدام مجموعات من الأدوية في برك كشاشة أولية، وكذلك، لزيادة كفاءة الفحص من خلال مكتبة مجمعة كبيرة الحجم19.
على الرغم من أن هذا النهج أكثر تلقائية وكفاءة من سير العمل المبلغ عنه سابقًا ، لا يزال هذا بروتوكولًا كثيف العمالة وصعبًا تقنيًا لأي شخص ليس لديه خبرة سابقة في سمك الحمار الوحشي بالحقن الدقيق. فحص المخدرات في زيوجرافات حمار وحشي من غير المرجح أن تصل من أي وقت مضى سهولة وفعالية في المختبر فحص المكتبات المركبة ويفتقر إلى بعض مزايا نماذج xenograft الماوس. على سبيل المثال، أحد القيود الرئيسية مع زيوجرافات سمك الحمار الوحشي هو أن الخلايا السرطانية لا يمكن استردادها بسهولة من الأسماك بعد xenografting في أرقام مفيدة للخدمات المصرفية الخلية أو معظم التجارب المصب. حتى لو كان ذلك ممكنا، والخلايا السرطانية البشرية قد نمت لعدة أيام في درجات الحرارة غير الفسيولوجية والبيئات ولن تكون عملية للاستخدام في التطبيقات اللاحقة. آثار انخفاض طفيف من درجة الحرارة الفسيولوجية على حركية المخدرات واستجابة الخلايا السرطانية غير معروفة أيضا، وقد تسفر عن نتائج محيرة. على الرغم من هذه المحاذير، زيوجرافات حمار وحشي لا تملأ فراغا في كونها طريقة أكثر عملية وفعالة من حيث التكلفة لأداء نطاق أوسع في شاشات المخدرات على جهاز الحي مما هو ممكن في نماذج xenograft الماوس. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب زيينوجرافات الحمار الوحشي خلايا أقل بكثير للحقن من نماذج الماوس ، لذلك يمكن نشر كمية صغيرة من عينة المريض بين مئات إلى آلاف من سمك الحمار الوحشي ، مما يسمح لشاشات المخدرات مع أعداد كبيرة من العينة. مع وضع العلامات الفلورية ، يمكن مراقبة الخلايا السرطانية من لحظة xenografted في سمك الحمار الوحشي اليرقات ، وتوفير بعض التوحيد بين الحيوانات المستخدمة في شاشات المخدرات. الجمع بين هذه الفوائد من زيوجرافات حمار وحشي مع إمكانية التصوير الآلي والقياس الكمي للخلايا المطعمة يفتح العديد من الاحتمالات لجعل فحص المخدرات عالية الإنتاجية من أورام المريض للطب الشخصي حقيقة واقعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل جائزة V Foundation V للباحثين ومنح المعاهد القومية للصحة DP2CA228043 ، R01CA227656 (إلى J.S. Blackburn) وNIH Training Grant T32CA165990 (إلى M.G. Haney).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
