Summary
Zebrafish xenograft modeller tillate høy gjennomstrømning narkotika screening og fluorescerende avbildning av menneskelige kreftceller i en in vivo mikromiljø. Vi utviklet en arbeidsflyt for storskala, automatisert legemiddelscreening på pasientavledede leukemiprøver i sebrafisk ved hjelp av et automatisert fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet.
Abstract
Pasientavledede xenograftmodeller er avgjørende for å definere hvordan ulike kreftformer reagerer på medikamentell behandling i et in vivo-system. Musemodeller er standarden i feltet, men sebrafisk har dukket opp som en alternativ modell med flere fordeler, inkludert evnen til høy gjennomstrømning og lavpris narkotikascreening. Sebrafisk tillater også in vivo narkotikascreening med store replikeringstall som tidligere bare var oppnåelige med in vitro-systemer. Evnen til raskt å utføre store narkotikaskjermer kan åpne opp muligheten for personlig medisin med rask oversettelse av resultater tilbake til klinikken. Zebrafish xenograft modeller kan også brukes til å raskt screene for handlingsbare mutasjoner basert på tumorrespons på målrettede terapier eller for å identifisere nye anti-kreft forbindelser fra store biblioteker. Den nåværende store begrensningen i feltet har vært å kvantifisere og automatisere prosessen slik at narkotikaskjermer kan gjøres i større skala og være mindre arbeidskrevende. Vi har utviklet en arbeidsflyt for xenografting primære pasientprøver i sebrafisk larver og utføre store narkotika skjermer ved hjelp av en fluorescens mikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet. Denne metoden gjør det mulig for standardisering og kvantifisering av enpodet tumorområde og respons på narkotikabehandling på tvers av et stort antall sebrafisklarver. Samlet sett er denne metoden en fordel fremfor tradisjonell cellekultur medikamentscreening, da det gir mulighet for vekst av tumorceller i et in vivo-miljø gjennom narkotikabehandling, og er mer praktisk og kostnadseffektiv enn mus for store in vivo-legemiddelskjermer.
Introduction
Xenografting av primærpasientkreft eller menneskelige kreftcellelinjer i modellorganismer er en mye brukt teknikk for å studere tumorprogresjon og atferd in vivo, tumorrespons på narkotikabehandling og kreftcelleinteraksjon med mikromiljøet, blant andre. Tradisjonelt er celler xenografted til immunkompromitterte mus, og dette er fortsatt standarden i feltet. Dette modellsystemet har imidlertid flere begrensninger, for eksempel høye kostnader, lave replikeringstall, vanskeligheter med nøyaktig kvantifiserende tumorbyrde in vivo, og den utvidede tiden det tar for svulster å engraft og narkotikatesting som skal fullføres. I de senere årene har sebrafisk dukket opp som en alternativ xenograft modell, med den første som ble rapportert i 2005, med grønt fluorescerende protein (GFP)-merket humant melanom cellelinjer transplantert inn blastula-stadium embryoer1,2. Mer nylig, 2 dagers post-befruktning (dpf) sebrafisk larver har blitt brukt som xenograft mottakere for å tillate kontroll av anatomisk injeksjonssted og for bruk i høy oppløsning in vivo avbildning av tumorinteraksjon med det omkringliggende mikromiljøet3,4.
Zebrafish tilbyr mange fordeler som en xenograft modell. For det første kan voksen sebrafisk plasseres og raskt avlet i store mengder til en relativt lav pris. Hvert par voksne sebrafisk kan produsere hundrevis av larvefisk per uke. På grunn av sin lille størrelse kan disse larvesebrafiskenopprettholdes i 96-brønnplater for høy gjennomstrømning av narkotikascreening. Larver trenger ikke å bli matet i løpet av et typisk xenografteksperiment, da deres eggeplommesekk gir næringsstoffene for å opprettholde dem i sin første uke av livet. Videre har sebrafisk ikke et fullt funksjonelt immunsystem før 7 dpf, noe som betyr at de ikke krever bestråling eller immunsuppressive regimer før xenograft injeksjon. Til slutt, optisk klare sebrafisk linjer tillate høyoppløselig avbildning av tumor-mikromiljø interaksjoner.
Kanskje den mest lovende anvendelsen av sebrafisk som en xenograft modell er evnen til å utføre høy gjennomstrømning narkotika screening på menneskelige kreftprøver på en måte som ikke er mulig å bruke noen annen modell organisme. Larver absorberer stoffer fra vannet gjennom huden, og forbedrer brukervennligheten av legemiddeladministrasjon5. Fordi dyr vedlikeholdes i 96-brønnplater, vanligvis i 100-300 μL vann, krever skjermer mindre legemiddelmengder sammenlignet med mus. For tiden er det flere forskjellige metoder for standardisering og kvantifisering av effekten av legemidler på menneskelig tumorbyrde i sebrafisk, hvorav noen er mer praktiske enn andre for skalering av enkeltnarkotikatesting til høy gjennomstrømningsscreening. For eksempel, noen grupper dissosiere fisk i encellede suspensjoner, og kvantifisere fluorescerende merkede eller farget tumorceller ved å bilde individuelle dråper av suspensjon og kvantifisere fluorescens ved hjelp av en semi-automatisert ImageJ makro4. En halvautomatisert hellarver bildemetode ble utviklet der larvefisk ble festet i 96-brønnplater og avbildet ved hjelp av et omvendt fluorescerende mikroskop før omstilling av sammensatte bilder og kvantifisering av tumorcellefoci6. Begge disse påstandene er ganske arbeidsintensive metoder for kvantifisering, noe som har gjort virkelig høy gjennomstrømning narkotika screening i sebrafisk xenograft modeller upraktisk.
Dette problemet har blitt løst av utviklingen av Vertebrate Automated Screening Technology (VAST) Bioimager og Large Particle (LP) Sampler, et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet (Figur 1 og Table of Materials), som er en virkelig automatisert metode for høy gjennomstrømning bildebehandling av sebrafisk larver7,,8,9. Med denne enheten blir fisk bedøvet, samplet automatisk fra en 96-brønnplate, plassert i en kapillær og rotert inn i den innstilte retningen basert på en forhåndsinnstilt brukerpreferanse, avbildet, og deretter enten plassert tilbake i samme brønn av en ny 96-brønnplate for videre studier eller kassert. Kombinere denne bildeteknologi med sebrafisk xenografts kan tillate muligheten for personlig medisin som bruker høy gjennomstrømning narkotika screening av store stoffet sammensatte biblioteker mot individuelle pasientsvulster. Sebrafisk xenografts tilbyr også en storskala og rimelig metode for testing av både toksisitet og effekt av nye forbindelser in vivo. Sebrafisk kan brukes som et foreløpig screeningtrinn før du går videre til mus xenograft modeller.
Vi har utviklet en strømlinjeformet arbeidsflyt for xenografting primære pasient leukemi celler i sebrafisk og utføre høy gjennomstrømning narkotika skjermer med automatisert bildebehandling og kvantifisering, som kan brukes på andre primære pasient tumorceller eller kreft celle linje. Denne arbeidsflyten benyttet en fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert samplerenhet for å forbedre på gjeldende standardiserings- og kvantifiseringsmetoder og tilbyr et automatisert alternativ til tidligere, mer arbeidsintensive metoder for kvantifiserende tumormasse in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er godkjent av University of Kentucky's Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll 2015-2225). Pasientprøver ble samlet inn under University of Kentucky's Institutional Review Board (protokoll 44672). Alle dyreforsøk som utføres etter denne protokollen, må godkjennes av brukerens institutional animal care and use committee.
1. Tining primær pasient akutt lymfoblastiske leukemi celler
- Tin primær pasient perifere blod mononukleære celler (PBMCs) fra frosset lager i en 37 °C vannbad. Umiddelbart etter at cellene har tint, overføre celler i sine frysemedier (90% FBS + 10% dimetylsulfoksid [DMSO]) til en 15 ml konisk rør med langsom pipettering, unngå luftbobler. Tilsett 10 ml førvormed 37 °C tiningsmidler (25 % føtal storfeserum [FBS] i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium [IMDM]) dropwise (ca. 2–3 per ml) til cellene i det 15 ml koniske røret.
MERK: PBMCer ble samlet inn fra pasientens blodprøver på diagnosetidspunktet. Buffy pelsen ble skilt av tetthet sentrifugering og celler ble vasket 2x i RPMI 1640 + 10% FBS. Cellene ble talt og 107 celler ble frosset per kryovial i 1 ml frysemedier, og lagret ved -80 °C. - Sentrifugeceller på 100 x g i 10 min og aspirere medier fra cellepellet. Gjenta tillegg av tining av medier, sentrifugering og aspirasjon en ekstra tid til å fjerne eventuelle gjenværende DMSO.
- Resuspender celler i 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og fjern 10 μL for å regne med en automatisert celleteller eller hemocytometer. Tilsett 10 μL trypan blå til 10 μL celler fjernet for telling. Telle antall celler per ml og post for senere å beregne volumet for å resuspendere celler i for xenografting (se trinn 2.5).
MERK: Vanligvis er 500 celler xenografted per larval sebrafisk. For eksempel er det nødvendig med 5 x 105 celler for å injisere 1000 sebrafisk. Levedyktighet bør være > 85% å bruke for xenografting. I dette eksperimentet var cellelevedyktighet 96% etter tining, vurdert av trypan blå farging.
2. Fluorescerende merking celler med DiI
- Sentrifuge ønsket cellenummer i 5 ml PBS ved 200 x g i 5 min og aspirer supernatant. Beis minst 2 x 106 celler ved klumping eller problemer med å laste nålen under injeksjon.
- Lag 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) farging løsning (5 ml PBS som inneholder 4 μL per ml DiI flekk, Materialtabell) og resuspend cellen pellet i farging løsning.
MERK: Celletetthet bør ikke overstige 2 x 106 celler/ml når den suspenderes på nytt i fargeoppløsningen. - Inkuber celler ved 37 °C beskyttet mot lys i 20 min, vortex forsiktig, deretter inkubere celler på is i 15 min beskyttet mot lys.
- Sentrifugeceller på 200 x g i 5 min og aspirerende supernatant. Vask celler med 5 ml PBS, sentrifuge på 200 x g i 5 min og aspirer supernatant. Gjenta vask, sentrifugering og aspirasjon en ekstra gang.
- Resuspender celler i 1 μL pbs per 250.000 levende celler og overføre til en 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Hold resuspenderte celler på is i mørket og fortsett umiddelbart til mikroinjeksjoner.
MERK: Dette sikrer at 500 pasientceller injiseres i sebrafisken med hver injeksjonspumpe på 2 nL-volum.
3. Mikroinjiserende Zebrafish Larver
MERK: Mikroinjeksjoner bør fullføres innen 1–3 timer etter farging for å forbedre levedyktigheten til cellene.
- Før flekker celler og injisere, lage agarose plater for injeksjon ved å helle 25 ml 3% agarose i 1x Tris / borat / EDTA (TBE) i en Petri parabolen og la den stivne. Oppbevar platene ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Også før farging celler og injisere, dechorionate 2 dpf sebrafisk ved hjelp av tang under en dissekering mikroskop. For manuell dechorionation, trekk fra motsatte ender av den beskyttende chorion av sebrafisk med tang til chorion tårer og sebrafisk blir unenveloped10.
MERK: Dechorionation kan også utføres ved hjelp av enzymatisk behandling med pronase, som tidligere beskrevet10. Casper (roy-/-;nacre-/-) sebrafisk ble brukt til disse eksperimentene11. Enhver sebrafisk larve stamme kan brukes til xenografting. Hvis pigment forstyrrer bildebehandling eller visualisering, kan propylthiouracil (PTU) behandling brukes til å blokkere melaninsyntese hvis optisk klare sebrafiskstammer ikke ertilgjengelige 12. - Fortynn kanyler ved 4 °C eller på is for å hindre klumping av celler under mikroinjeksjon. Last 5 μL fargede celler i en kjølt nonfilamentous borosilikat glassnål ved hjelp av mikrolasterpipettespisser.
MERK: Mikroinjektor- og nåleoppsettmetoder er tidligere publisert13. - Legg nålen i mikroinjektorarmen. Skrå kanylespissen ved hjelp av et sterilt barberblad. Mål dråpestørrelsen i mineralolje ved hjelp av et stadium mikrometer, holde dråpevolumet konsekvent ved 2 nL (~ 0,15 mm diameter) gjennom.
- Bruk 350 μL av 4 mg/ml tricaine-S for å bedøve ~ 30 dechorionated 2 dpf sebrafisk i en Petri-skål som inneholder 25 ml E3-medier. Etter ~ 1 min overføring bedøvet larver til en flat overflate injeksjon plate (3% agarose i en Petri skål) og injisere larver med en pumpe av fargede celler på ønsket injeksjonssted (f.eks eggeplommen eller perikardiet; se figur 2A, B).
MERK: Injeksjonsstedet bør velges basert på målet med eksperimentet. Det vanligste injeksjonsstedet er eggeplommen. For å få celler som sirkulerer i blodet, kan perikardiet, kanalen til Cuvier, perivitelline plass eller retro-orbital plass brukes som injeksjonssteder. Ortotopiske injeksjonssteder kan også brukes, for eksempel hjernen. - Vask larver av injeksjonsplaten i en 10 cm2 Petriskål (30 larver per plate) som inneholder E3-medier14 uten metylenblå og inkuber ved 28 °C i en 1-h restitusjonsperiode. Fortsett å injisere til et ønsket antall larver har blitt injisert.
MERK: Ideelt sett injiserer du 2-2,5 ganger antall larver som trengs for eksperimenter. Det vil være noen dø-off av larver på grunn av stress fra injeksjon og økt inkubasjonstemperatur. Vanligvis, etter praksis med teknikken, kan 800-1500 sebrafisk larver injiseres av en enkelt person i 1-3 h når fargede celler skal injiseres. - Flytt plater av injiserte larver til en 34 °C inkubator. Ikke plasser Petri-ladene til larver direkte på en metallhylle i inkubatoren for å forhindre overoppheting av E3-vannet. For eksempel plassere en tom Petri skål mellom hyllen og Petri parabolen av larver for å fungere som en buffer. Fjern døde sebrafisk larver etter 24 og 48 timer etter injeksjon (hpi).
4. Sette opp narkotika skjerm med Xenografted Zebrafish
-
Ved 48 hpi, skjermen sebrafisk larver for fluorescens / tumor engraftment og helse(Figur 2C, D). Fjern eventuell død eller misformet sebrafisk og velg sebrafisk med lignende engraftment (Figur 2C, D, 1−3 og 1'−3'). Fjern utransplantert sebrafisk (Figur 2C, D, 5 og 5").).
- For eggeplomme injisert fisk, fjern fisk der grensene til eggeplommen ikke kan sees rundt enpodet cellemasse (Figur 2C, 4) som det gjør kvantifisering vanskelig. For perikardiet injisert fisk, fjern fisk der injisert cellemasse inngrep i eggeplommen sac (Figur 2D, 4').
- Tilsett sebrafisk til en 96-brønnplate. For å gjøre dette, kutt spissen av en 200 μL pipettespiss, akkurat stor nok til at en 4 dpf sebrafisk passer gjennom. Aspirer 150 μL Av E3-medier med en sebrafisk fra platen ved hjelp av en P200-pipette, og legg til en tom brønn på en flat bunn 96-brønnplate.
- Fortynn stoffet som skal testes i det nødvendige volumet av E3-medier, ved 150 μL per brønn. Forbered stoffet ved 2 ganger ønsket konsentrasjon. For eksempel, forberede 20 μM av stoffet i E3 hvis ønsket endelig konsentrasjon er 10 μM, siden halvparten av det totale volumet i hver brønn består av narkotikaløsningen. For DMSO kontrollgruppen, legg DMSO på samme volum som stoffet.
- Tilsett 150 μL 2x fortynnet legemiddelløsning til hver brønn som inneholder sebrafisklarver i 150 μL E3, for et endelig volum på 300 μL med 1x legemiddelløsning per brønn.
- Inkuber platen ved 34 °C. Se etter død sebrafisk daglig. Etter 2 dager, om ønskelig, oppdater stoffet ved å fjerne 200 μL væske fra hver brønn av 96-brønnplaten og erstatte med 200 μL 1x fortynnet legemiddelløsning eller DMSO i E3-medier.
MERK: De beste resultatene ble funnet etter 3 dager med narkotikabehandling for dette eksperimentet; Lengden på narkotikabehandlingen kan imidlertid variere mellom 2–4 dager og må kanskje optimaliseres basert på at eksperimentet blir gjort eller legemidler som brukes.
5. Bildebehandling Xenografted Sebrafisk ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert samplerenhet
- Forbered 1 l frisk 4 mg/ml tricaine og 1,5 l e3-medier. Fyll medieflaske 1 med E3-medier og medieflaske 2 med tricaine.
- Fjern alle uønskede fluorescerende kanaler i bildeprogramvaren og legg til ønsket kanal (DiI for dette eksperimentet). Merk av for ønsket fluorescerende kanal, da et bilde kun tas for kanalene med en hake. Velg også hvordan bildene skal tas (z-stabler, automatisering, løkker i serien osv.).
MERK: For dette eksperimentet ble fokuset manuelt satt for hver fisk avbildet for å oppnå det høyeste antallbilder med optimalt fokus. - Bilde DMSO kontroll fisk før narkotika-behandlet fisk slik at riktig eksponering ser ut i bildeprogramvaren. Når eksponeringen er angitt, må du ikke endre eksponeringstiden for varigheten av eksperimentet.
MERK: Fokuset kan enten justeres manuelt for hver sebrafisk for å sikre at det ikke er noen ut av fokusbilder, eller for helautomatisk bildebehandling, kan det samme fokuset brukes mellom fisk med ut av fokusbilder som kastes eller fisk reimaged før analyse. Videre kan dette eksperimentet utføres ved hjelp av fluorescerende imager etterfulgt av kvantifisering av fluorescens ved hjelp av ImageJ-programvaren.
6. Kvantifisere fluorescens ved hjelp av ImageJ
- Åpne ImageJ programvare.
-
Gå til Fil | Åpne og velg ønsket .czi-fil. Programvaren vil få opp et importalternativer vindu.
- For stakkvisning velger du Hyperstacks, sjekk Åpne filer individuelt, sjekk Autoskalaog sjekk Del kanaler. Velg Fargeførtfor fargealternativet .
- Klikk på Programtillegg | Makroer | Ta opp.
- Klikk på Bilde | Juster | Terskel. Velg bildetype som rød i rullegardinmenyen til høyre i terskelvinduet. Juster minimumsterskelen til programvaren bare utheveområder med fluorescens (figur 3A) og klikk på Bruk. Programvaren vil konvertere bildet til svart og hvitt, med det valgte området i svart.
MERK: Bruk samme terskel for hvert bilde på legemiddelskjermen for å holde resultatene standardiserte og sammenlignbare. - Klikk på Analyser | Mål. Programvaren vil trekke opp et resultatvindu som inneholder fluorescerende området for det bildet.
- Klikk Opprett i makroopptakervinduet. Dette åpner et nytt vindu med koden for makroen. Fremhev alle de ønskede bildene for analyse og åpne som i trinn 6.2.
- Velg Kjør i vinduet med makroen. Resultatvinduet inneholder nå området for hvert bilde.
MERK: Bildeanalysen kan gjøres individuelt uten å registrere og kjøre en makro, samt ved å gjenta trinnene ovenfor for hvert bilde. - Kopier de målte dataene til et regneark. Gjennomsnittlig den totale fluorescensen til alle kontrollprøver (DMSO). Beregn prosentdifferansen ved hjelp av følgende formel: –[(gjennomsnittlig DMSO-område – eksperimentelt område)/gjennomsnittlig DMSO-område] x 100 % (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen beskrevet ovenfor, sebrafisk ble xenografted i eggeplomme og perikardium med primær pasient PBMCs som opprinnelig ble isolert fra en T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (T-ALL) pasient ved diagnose og banket som en levedyktig, frossen prøve. Ved 48 hk i ble xenografted fisk screenet for fluorescerende merkede tumorceller (Figur 2C, D) og behandlet med kjemoterapi (deksametason eller vinkristin) eller DMSO. Fisk ble avbildet ved 7 dpi, etter 3 dager på medikamentell behandling ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet (Figur 3A).
Fluorescerende område/tumorbyrden ble målt for hver fisk avbildet ved hjelp av ImageJ og sammenlignet mellom de ulike behandlingsgruppene og DMSO (Figur 3B). Samlet sett viste xenografted fisk behandlet med vinkristin den største og mest konsistente nedgangen i xenografted cellemasse sammenlignet med DMSO behandlet fisk. Deksametasonbehandlet fisk viste omtrent halvparten av reduksjonen i tumorområdet sammenlignet med vinkristin, men viste fortsatt en reduksjon i tumorområdet sammenlignet med DMSO (Figur 3). Dette etterlignet det som ble sett hos pasienten, da deres leukemi raskt reagerte på terapi med en kombinasjon av deksametason og vinkristin. Disse resultatene viser evnen til sebrafisk xenograft modeller for å være mottagelig for narkotika screening og automatisert bildebehandling og kvantifisering, gir en plattform for å teste ulike pasientprøver eller cellelinjer med ulike legemidler eller narkotika kombinasjoner.
Figur 1: Xenograft narkotikaskjerm og bildebehandlingsarbeidsflyt. Skjematisk arbeidsflyt av xenografting sebrafisk larver og utføre narkotika skjermen, inkludert bildebehandling på en fluorescens mikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Injeksjonssted og representative bilder av screening xenografted fisk. Bilder av mikroinjektol på injeksjonstidspunktet i enten eggeplommen (A) eller perikardiet (B) av 2 dpf sebrafisk larver. Representative bilder av screening på 2 dpi skildrer valg av sebrafisk for narkotikaskjerm (C,D). Sebrafisk med lignende engraftment (1−3 og 1'−3') bør velges, utransplanterte sebrafisk (5 og 5') bør fjernes. For eggeplomme injisert fisk, fjern fisk der grensene til eggeplommen ikke kan sees rundt engrafted cellemasse (4) som det gjør kvantifisering vanskelig. For perikardiet injisert fisk, fjern fisk der injisert cellemasse inngrep i eggeplommesekk (4").). Skala bar = 0,5 mm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Legemiddelbehandling kan redusere xenografted tumorområde in vivo. Representative bilder av sebrafisk injisert i perikardiet eller eggeplomme etter 3 dager med behandling med DMSO eller narkotika, enten vincristine eller deksametason. Arealet av engrafted tumormasse ble kvantifisert ved å sette en fluorescensterskel ved hjelp av ImageJ, velge alle piksler over den innstilte terskelen, og måle området og gjennomsnittlig fluorescens av de valgte regionene. Piksler over den valgte terskelen vises i svart, mens piksler under terskelen vises i hvitt. Piksler ble målt i både eggeplommen og perikardiet injisertsebrafisk bilder (A). Behandling med vinkristin førte til en reduksjon i etpodet tumorområde sammenlignet med DMSO-kontroll med n = 4 fisk behandlet per gruppe (B). SD = standardavvik. Skala bar = 250 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien demonstrerte vi en standardisert metode for tining og injeksjon av primære pasientleukemiceller i sebrafisk som en xenograftmodell. Vi etablerte også en protokoll for høy gjennomstrømning serutt screening av xenografted sebrafisk ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet. Tidligere har xenografts blitt rapportert med menneskelige cellelinjer, og kvantifisering av xenografted svulster på en høy gjennomstrømning måte har vært en utfordring i feltet. Denne metoden fungerer som grunnlag for studier for å bruke et fluorescensmikroskop utstyrt bildeenhet og automatisert sampler enhet som en måte å automatisere avbildning av xenografted sebrafisk, med det endelige målet om å utføre høy gjennomstrømning narkotika skjermer for å forutsi hvilke stoffer en bestemt pasientkreft kan reagere på, åpne muligheten for mer personlig medisin.
Til tross for evnen til å automatisere mye av denne protokollen, er det fortsatt mange tekniske utfordringer som ikke bør overses. For det første er det viktig at celler injiseres i sebrafisk så raskt som mulig etter farging for å forhindre celleklumping og celledød. Larver må dechorionated før du utfører cellefargingsprotokollen. Glassfilamentnåler bør også holdes kalde før du legger i nålen for å redusere nåletilstopping. I tillegg er bruk av embryoer produsert av sunn voksen sebrafisk i alderen 6 måneder til 1 år avgjørende for å sikre den beste levedyktigheten til xenografted larver. Til slutt bør xenografted fisk screenes nøye for tumorengraftment, og bare de med lignende tumorvolumer bør brukes i legemiddelscreening for å redusere variasjonen i de endelige resultatene.
Selv om vi brukte primære pasient leukemi PBMCs for våre eksperimenter, denne protokollen kan utføres med noen tumor type eller kreft cellelinje. For cellelinjer i kultur, bør tilhengerceller prøves på og deretter vaskes i PBS før du fortsetter med fargingsprotokollen. Det er også viktig å merke seg at engraftment priser kan variere fra ett utvalg til neste og mellom utvalgstyper15. For eksempel, i vår PBMC-prøve, > 90% av sirkulerende PBMCer var leukemiske eksplosjoner, men dette tallet kan variere betydelig fra en pasient til den neste, noe som kan påvirke engraftment rate. Fordi resultatene sammenlignes med en DMSO-kontroll innenfor samme prøvetype, er det en intern kontroll for engraftment rate, men denne variasjonen bør tas i betraktning når du bestemmer hvor mange celler som skal injiseres per sebrafisk. Vi har funnet suksess når vi bruker 250-1000 celler injisert per dyr, med 500 som optimal for våre studier. Mens våre eksperimenter konkluderte da larver var 7 dpf, ville vi ikke forvente xenografts å overleve i dyrene for lengre tidspunkter, som immunsystemet begynner å utvikle seg på dette punktet, og vil trolig føre til avvisning av menneskelige celler. Immunkompromitterte sebrafisklinjer er opprettet, med prkdc-/-;il2rga-/- sebrafisk som er i stand til å innpode menneskelige kreftceller16,17, som kan være nyttige for lengre sikt xenografts eller vurdere tumortilbakefall etter medikamentbehandling. Imidlertid må disse immunmangelfulle linjene opprettholdes som heterozygotes, så larver må genotypees før bruk. Homozygot fisk må også behandles med legemidler for å tømme makrofager for å muliggjøre pålitelig engraftment av menneskelige celler, noe som kan komplisere narkotikascreeningresultater. For tiden er disse linjene verken praktiske eller nødvendige for storskala legemiddelscreening på larver, som kan fullføres før immunsystemet er fullt funksjonell ved 7 dpf18.
Våre representative resultater fokuserer på injeksjon av celler i perikardiet og eggeplommen for enkel og hastighet på injeksjon og økt levedyktighet; Kreftceller kan imidlertid injiseres i mange andre anatomiske steder, og vi har hatt suksess med å bruke denne arbeidsflyten på andre steder, inkludert kanalen cuvier, hjerne, retro-orbital, og perivitelline sac. I tillegg er det vanskelig å anslå hvor mye av hvert stoff larvefisken absorberer; hvis få legemidler brukes, vil ideelt sett en toksisitetsskjerm ved en rekke doser (vanligvis 0,1 til 25 μM) bli utført før storskalaanalysen for å bestemme maksimal tolerert dose (MTD). Vi valgte å bruke MTD for hvert stoff for vår analyse, men 10 μM av stoffet brukes vanligvis i sebrafiskfeltet som en startkonsentrasjon for høy gjennomstrømning serutrede narkotikascreening og tolereres generelt godt. Kombinasjoner av legemidler i bassenger kan også brukes som en startskjerm for å øke effektiviteten av screening gjennom et stort volum sammensatt bibliotek19.
Selv om denne tilnærmingen er mer automatisert og effektiv enn tidligere rapporterte arbeidsflyter, er dette fortsatt en arbeidskrevende og teknisk utfordrende protokoll for alle uten forutgående erfaring med mikroinjeksjon av sebrafisk. Narkotikascreening i sebrafisk xenografts er usannsynlig å noensinne nå den enkle og effekten av in vitro screening av sammensatte biblioteker og mangler noen fordeler med mus xenograft modeller. For eksempel er en stor begrensning med sebrafisk xenografts at kreftceller ikke lett kan hentes fra fisk etter xenografting på nyttige tall for cellebank eller de fleste nedstrømseksperimenter. Selv om dette var mulig, ville de menneskelige kreftcellene ha vokst i flere dager i ikke-fysiologiske temperaturer og miljøer, og ville ikke være praktisk for bruk i senere applikasjoner. Effekten av en litt lavere enn fysiologisk temperatur på narkotikakinetikk og tumorcellerespons er heller ikke kjent, og kan gi forvirrende resultater. Til tross for disse advarsler, zebrafish xenografts fylle et tomrom i å være en mer praktisk og kostnadseffektiv metode for å utføre større skala in vivo narkotika skjermer enn det som er mulig i mus xenograft modeller. I tillegg krever sebrafisk xenografts langt færre celler for injeksjon enn musemodeller, slik at en liten mengde pasientprøve kan spres blant hundrevis til tusenvis av sebrafisk, noe som åpner for narkotikaskjermer med store prøvenumre. Med fluorescerende merking kan tumorceller overvåkes fra det øyeblikket de er xenografted inn i larval sebrafisk, noe som gir noen standardisering mellom dyrene som brukes i narkotikaskjermer. Ved å kombinere disse fordelene med sebrafisk xenografts med mulighet for automatisert avbildning og kvantifisering av transplanterte celler åpner opp mange muligheter for å gjøre høy gjennomstrømning narkotika screening av pasientsvulster for personlig medisin en realitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av en V Foundation V Scholar Award og NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (til J.S. Blackburn) og NIH Training Grant T32CA165990 (til M.G. Haney).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
