Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Published: April 10, 2020 doi: 10.3791/60996

Summary

Zebrafish xenograft modeller möjliggör hög genomströmning läkemedelsscreening och fluorescerande avbildning av mänskliga cancerceller i en in vivo mikromiljö. Vi utvecklade ett arbetsflöde för storskalig, automatiserad läkemedelsscreening på patientbaserade leukemiprover i zebrafiskar med hjälp av en automatiserad fluorescensmikroskop utrustad bildenhet.

Abstract

Patientbaserade xenograftmodeller är avgörande för att definiera hur olika cancerformer svarar på läkemedelsbehandling i ett in vivo-system. Musmodeller är standard på området, men zebrafiskar har vuxit fram som en alternativ modell med flera fördelar, bland annat möjligheten till hög genomströmning och billig drogscreening. Zebrafisk möjliggör också in vivo drogscreening med stora replikattal som tidigare endast kunde erhållas med in vitro-system. Förmågan att snabbt utföra storskaliga läkemedelsskärmar kan öppna upp möjligheten för personlig medicin med snabb översättning av resultat tillbaka till kliniken. Zebrafish xenograft modeller kan också användas för att snabbt skärmen för användbara mutationer baserat på tumör svar på riktade terapier eller för att identifiera nya anti-cancer föreningar från stora bibliotek. Den nuvarande stora begränsningen inom området har kvantifierat och automatiserat processen så att läkemedelsskärmar kan göras i större skala och vara mindre arbetsintensiva. Vi har utvecklat ett arbetsflöde för att xenografting primära patientprover i zebrafisklarver och utföra storskaliga läkemedelsskärmar med hjälp av en fluorescensmikroskop utrustad bildenhet och automatiserad sampler enhet. Denna metod möjliggör standardisering och kvantifiering av engrafted tumörområde och svar på läkemedelsbehandling över ett stort antal zebrafisklarver. Sammantaget är denna metod fördelaktigt jämfört med traditionell cellkultur drog screening eftersom det möjliggör tillväxt av tumörceller i en in vivo miljö under hela läkemedelsbehandling, och är mer praktisk och kostnadseffektiv än möss för storskaliga in vivo läkemedelsskärmar.

Introduction

Xenografting av primära patientcancer eller mänskliga cancer cellinjer i modellorganismer är en allmänt använd teknik för att studera tumör progression och beteende in vivo, tumör svar på läkemedelsbehandling, och cancer cell interaktion med mikromiljön, bland annat. Traditionellt är celler xenografted i immun-äventyras möss, och detta är fortfarande standard i fältet. Emellertid, denna modell system har flera begränsningar, såsom höga kostnader, låga replikera nummer, svårigheter att exakt kvantifiera tumör börda in vivo, och den förlängda tid som det tar för tumörer att engraft och drogtester som skall slutföras. Under de senaste åren har zebrafiskar vuxit fram som en alternativ xenograft modell, med den första rapporteras i 2005, med grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt humant melanom cellinjer transplanteras till blastula-steg embryon1,2. På senare tid har 2 dagars post-befruktning (dpf) zebrafisklarver använts som xenograft mottagare för att möjliggöra kontroll av anatomisk placering av injektion och för användning i hög upplösning in vivo imaging av tumör interaktion med den omgivande mikromiljö3,4.

Zebrafish erbjuder många fördelar som xenograftmodell. För det första kan vuxna zebrafiskar inhysas och snabbt födas upp i stora mängder till en relativt låg kostnad. Varje parning par vuxna zebrafiskar kan producera hundratals larvfisk per vecka. På grund av sin ringa storlek kan dessa larv zebrafiskar underhållas i 96-brunnsplattor för drogscreening med hög genomströmning. Larver behöver inte matas under loppet av ett typiskt xenograftexperiment, eftersom deras äggula-säck ger näringsämnen för att upprätthålla dem under sin första vecka i livet. Dessutom har zebrafiskar inte ett fullt fungerande immunsystem förrän 7 dpf, vilket innebär att de inte kräver bestrålning eller immunsuppressiva regimer före xenograft injektion. Slutligen, optiskt tydliga zebrafisk linjer möjliggör högupplöst avbildning av tumör-mikromiljö interaktioner.

Kanske den mest lovande tillämpningen av zebrafisk som en xenograft modell är förmågan att utföra hög genomströmning läkemedelsscreening på mänskliga cancerprover på ett sätt som inte är möjligt att använda någon annan modell organism. Larver absorberar droger från vattnet genom huden, vilket ökar nyttan av läkemedelsadministration5. Eftersom djur hålls i 96-brunnsplattor, vanligtvis i 100−300 μl vatten, kräver skärmar mindre läkemedelsmängder jämfört med möss. För närvarande finns det flera olika metoder för standardisering och kvantifiering av effekten av läkemedel på mänskliga tumör börda i zebrafisk, av vilka några är mer praktiska än andra för uppskalning enda drogtester till hög genomströmning screening. Till exempel, vissa grupper separera fisk i encelliga suspensioner, och kvantifiera fluorescerande märkta eller färgade tumörceller genom att avbilda enskilda droppar av suspensionen och kvantifiera fluorescens med hjälp av en halvautomatisk ImageJ makro4. En halvautomatisk hellarv imaging metod utvecklades där larvfisk fastställdes i 96-väl plattor och avbildas med hjälp av en inverterad fluorescerande mikroskop innan omjustering av sammansatta bilder och kvantifiering av tumörcellfoci6. Båda dessa analyser är ganska arbetsintensiva metoder för kvantifiering, vilket har gjort verkligt hög genomströmning drog screening i zebrafish xenograft modeller opraktiskt.

Detta problem har åtgärdats genom utvecklingen av vertebrate automated screening technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, en fluorescensmikroskop utrustad bildenhet och automatiserad provtagare enhet (figur 1 och tabell över material), som är en verkligt automatiserad metod för hög genomströmning imaging av zebrafisk larver7,,8,9. Med denna enhet, fisk sövs, provsatts automatiskt från en 96-brunn platta, placerad i en kapillär och roteras i den inställda orienteringen baserat på en förinställd användarpreferens, avbildas, och sedan antingen placeras tillbaka i samma brunn av en ny 96-brunn platta för ytterligare studier eller kasseras. Kombinera denna bildframställning teknik med zebrafish xenografts kan möjliggöra möjligheten att personlig medicin som använder hög genomströmning drog screening av stora drog sammansatta bibliotek mot enskilda patienttumörer. Zebrafish xenografts erbjuder också en storskalig och billig metod för att testa både toxicitet och effekt av nya föreningar in vivo. Zebrafiskar kan användas som ett preliminärt screeningsteg innan man fortsätter till mus xenograft modeller.

Vi har utvecklat ett strömlinjeformat arbetsflöde för xenografting primära patienten leukemi celler till zebrafisk och utför hög genomströmning läkemedelsskärmar med automatiserad avbildning och kvantifiering, som kan tillämpas på alla andra primära patienttumörceller eller cancer cellinje. Detta arbetsflöde utnyttjas en fluorescens mikroskop utrustade imaging enhet och automatiserad sampler enhet för att förbättra på nuvarande standardisering och kvantifiering metoder och erbjuder ett automatiserat alternativ till tidigare, mer arbetsintensiva metoder för att kvantifiera tumör massa in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll har godkänts av University of Kentucky's Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll 2015-2225). Patientprover samlades in under University of Kentucky's Institutional Review Board (protokoll 44672). Alla djurförsök som utförs enligt detta protokoll måste godkännas av användarens kommitté för institutionsvård och användning av djur.

1. Upptining primär patient akut lymfatisk leukemi celler

  1. Tina primära patienten perifert blod mononukleära celler (PBMCs) från frysta lager i en 37 °C vattenbad. Omedelbart efter att cellerna har tinat, överföra celler i deras frysmedia (90% FBS + 10% dimetylsulfaoxid [DMSO]) till en 15 ml konisk rör med långsam pipettering, undvika luftbubblor. Tillsätt 10 ml förkrigsmedel 37 °C upptiningsmedia (25% fetala bovinserum [FBS] i Iscoves modifierade Dulbeccos medium [IMDM]) dropwise (ca 2−3 s per ml) till cellerna i det koniska röret på 15 ml.
    OBS: PBMCs samlades in från patientens blodprov vid tidpunkten för diagnosen. Den buffy pälsen separerades av densitet centrifugering och celler tvättades 2x i RPMI 1640 + 10% FBS. Celler räknades och 107 celler frystes per cryovial i 1 ml frysning media, och lagras på -80 °C.
  2. Centrifugceller vid 100 x g i 10 min och aspirerar media från cellpelleten. Upprepa tillsatsen av tömedia, centrifugering och strävan ytterligare en gång för att avlägsna eventuella kvarvarande DMSO.
  3. Resuspend celler i 5 ml fosfat-buffrad saltlösning (PBS) och ta bort 10 μL för att räkna med en automatiserad cellräknare eller hemocytometer. Tillsätt 10 μl trypanblå till 10 μL celler som avlägsnats för räkning. Räkna antalet celler per mL och registrera för att senare beräkna volymen för att återanvända celler i för xenografting (se steg 2.5).
    OBS: Vanligtvis är 500 celler xenografted per larv zebrafisk. Till exempel behövs 5 x 105 celler för att injicera 1000 zebrafiskar. Lönsamheten bör vara >85% att använda för xenografting. I detta experiment var cellens livskraft 96% efter upptining, bedöms av trypan blå färgning.

2. Fluorescerande märkning celler med DiI

  1. Centrifugera önskat cellnummer i 5 ml PBS vid 200 x g i 5 min och aspirate supernatant. Fläcka minst 2 x 106 celler vid klumpar eller problem med att ladda nålen under injektionen.
  2. Gör 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperklorat (DiI) färgningslösning (5 ml PBS som innehåller 4 μL per ml DiI-fläck, Tabell över material)och återsuspend cellpellet i färgningslösningen.
    OBS: Celltätheten bör inte överstiga 2 x 106 celler/ml vid återutnyttjad i färgningslösningen.
  3. Inkubera celler vid 37 °C skyddade från ljus i 20 min, virvel försiktigt, inkubera sedan celler på is i 15 min skyddad från ljus.
  4. Centrifugceller vid 200 x g i 5 min och aspirate supernatant. Tvätta celler med 5 ml PBS, centrifug vid 200 x g i 5 min och aspirerande supernatant. Upprepa tvätt, centrifugering och strävan en extra gång.
  5. Återsuspend celler i 1 μL PBS per 250.000 levande celler och överför till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Håll återsuspenderade celler på is i mörkret och fortsätt omedelbart att mikroinjektioner.
    OBS: Detta säkerställer att 500 patientceller injiceras i zebrafisken med varje insprutningspump på 2 nL volym.

3. Microinjecting Zebrafish Larver

OBS: Mikroinfektioner bör slutföras inom 1−3 h efter färgning för att förbättra cellernas livskraft.

  1. Före färgningsceller och injicering, gör agarosplattor för injicering genom att hälla 25 ml 3% agaros i 1x Tris/borate/EDTA (TBE) till en petriskål och låt den stelna. Förvara plattorna vid 4 °C i upp till 2 veckor.
  2. Även före färgning celler och injicera, dechorionate 2 dpf zebrafisk med pincett under en dissekera mikroskop. För manuell dechorionation, dra från motsatta ändar av den skyddande chorion av zebrafisk med pincett tills chorion tårar och zebrafish blir unenveloped10.
    OBS: Dechorionation kan också utföras med hjälp av enzymatisk behandling med pronas, som tidigare beskrivits10. Casper (roy-/-;nacre-/-) zebrafisk användes för dessa experiment11. Alla zebrafisklarv kan användas för xenografting. Om pigment stör bildbehandling eller visualisering kan propylthiouracil (PTU) behandling användas för att blockera melaninsyntes om optiskt klara zebrafiskstammar inte finnstillgängliga 12.
  3. Prechill nålar vid 4 °C eller på is för att förhindra klumpning av celler under mikroinjektion. Ladda 5 μL målat celler i en kyld icke-filamentous borosilikat glas nål med microloader pipett tips.
    OBS: Microinjector och nål setup metoder har tidigare publicerats13.
  4. Lasta nålen i mikroinjektorarmen. Avfasning av nålspetsen med ett sterilt rakblad. Mät droppstorleken i mineralolja med hjälp av en stegmikrometer och håll droppvolymen konsekvent vid 2 nL (~0,15 mm diameter) hela.
  5. Använd 350 μL 4 mg/ml trikain-S för att bedöva ~30 dechorionerade 2 dpf zebrafiskar i en petriskål som innehåller 25 ml E3-media. Efter ~1 min överför sövda larver till en injektionsplatta med plan yta (3 % agaros i en petriskål) och injicerar larver med en pump av färgade celler vid önskat injektionsställe (t.ex. äggulan eller hjärtsäcken; se figur 2A,B).
    OBS: Injektionsstället ska väljas baserat på experimentets mål. Det vanligaste injektionsstället är äggulan. För att få celler som cirkulerar i blodomloppet kan hjärtsäcken, kanalen Cuvier, perivitelline rymden, eller retro-orbital utrymme användas som injektionsställen. Orthotopic injektionsställen kan också användas, såsom hjärnan.
  6. Tvätta larverna från injektionsplattan i en 10 cm2 Petriskål (30 larver per platta) som innehåller E3-medium14 utan metylenblått och inkubera vid 28 °C under en återhämtningsperiod på 1 h. Fortsätt injicera tills ett önskat antal larver har injicerats.
    OBS: Helst injicera 2−2,5 gånger antalet larver som behövs för experiment. Det kommer att finnas en del die-off av larver på grund av stress från injektion och den ökade inkubationstemperaturen. Vanligtvis, efter träning med tekniken, kan 800−1 500 zebrafisklarver injiceras av en enda person inom 1−3 h när färgade celler ska injiceras.
  7. Flytta plattor av injicerade larver till en 34 °C-inkubator. Placera inte larvernas petriskålar direkt på en metallhylla i inkubatorn för att förhindra överhettning av E3-vattnet. Till exempel placera en tom petriskål mellan hyllan och petriskålen av larver för att fungera som en buffert. Ta bort döda zebrafisklarver efter 24 och 48 timmar efter injektion (hpi).

4. Ställa in drug screen med Xenografted Zebrafish

  1. Vid 48 hpi, skärm zebrafisk larver för fluorescens / tumör engraftment och hälsa (Figur 2C,D). Ta bort alla döda eller missbildade zebrafiskar och välj zebrafiskar med liknande engraftment (figur 2C, D, 1−3 och 1'−3' Ta bort oenograferade zebrafiskar (figur 2C, D, 5 och 5').
    1. För äggula injicerad fisk, ta bort fisk där äggulans gränser inte kan ses runt engrafted cellmassa (figur 2C, 4) eftersom det gör kvantifiering svårt. För perikardvätska injicerad fisk, avlägsna fisk där injicerad cellmassa inkräktar i gulesäcken (figur 2D,4').
  2. Tillsätt zebrafisk till en 96-brunnsplatta. För att göra detta, skär spetsen av en 200 μL pipettspets, precis tillräckligt stor för att en 4 dpf zebrafisk ska passa igenom. Sug 150 μL E3-medier med en zebrafisk från plattan med en P200 pipett och lägg till en tom brunn av en platt botten 96-brunnsplatta.
  3. Späd läkemedlet som ska testas i den erforderliga volymen E3-media, vid 150 μL per brunn. Förbered läkemedlet vid 2-vik önskad koncentration. Till exempel, förbereda 20 μM läkemedel i E3 om den önskade slutliga koncentrationen är 10 μM, eftersom hälften av den totala volymen i varje brunn består av läkemedelslösningen. För DMSO-kontrollgruppen, lägg till DMSO på samma volym som läkemedlet.
  4. Tillsätt 150 μL 2x utspädd läkemedelslösning till varje brunn som innehåller zebrafisklarver i 150 μL E3, för en slutlig volym på 300 μL med 1x läkemedelslösning per brunn.
  5. Inkubera plattan vid 34 °C. Kontrollera om det är död zebrafisk varje dag. Efter 2 dagar, om så önskas, uppdatera läkemedlet genom att ta bort 200 μL vätska från varje brunn av 96-brunnsplattan och ersätta med 200 μL 1x utspädd läkemedelslösning eller DMSO i E3-media.
    OBS: De bästa resultaten hittades efter 3 dagars läkemedelsbehandling för detta experiment; Dock kan längden på läkemedelsbehandling variera mellan 2−4 dagar och kan behöva optimeras baserat på experimentet som görs eller läkemedel som används.

5. Imaging Xenografted Zebrafish Med hjälp av en fluorescens mikroskop utrustad imaging enhet och automatiserad Sampler Enhet

  1. Förbered 1 L färsk 4 mg/ml trikain och 1,5 L E3 media. Fyll medieflaska 1 med E3 media och mediaflaska 2 med tricaine.
  2. Ta bort alla oönskade fluorescerande kanaler i bildhanteringsprogrammet och lägg till önskad kanal (DiI för det här experimentet). Kontrollera önskad fluorescerande kanal eftersom en bild endast tas för kanalerna med en bock. Välj också hur bilderna ska tas (z-stackar, automatisering, loopar i serie osv.).
    OBS: För det här experimentet sattes fokus manuellt för varje fisk som avbildas för att få det högsta antalet bilder med optimal fokus.
  3. Bild dmso kontroll fisken innan den drogbehandlade fisken så att lämplig exponeringstid kan ställas in i bildbehandlingsprogrammet. När exponeringen är inställd ska du inte ändra exponeringstiden under experimentets varaktighet.
    OBS: Fokus kan antingen justeras manuellt för varje zebrafisk för att säkerställa att det inte finns några ofokuserade bilder, eller för helt automatiserad bildbehandling, kan samma fokus användas mellan fisk med ofokuserade bilder kasseras eller fisk reimaged innan analysen utförs. Dessutom kan detta experiment utföras med hjälp av fluorescerande imager följt av kvantifiering av fluorescens med hjälp av ImageJ-programvaran.

6. Kvantifiera fluorescens med imagej

  1. Öppna ImageJ programvara.
  2. Gå till arkiv | Öppna och välj önskad CZI-fil. Programvaran kommer att ta upp ett fönstret importalternativ.
    1. Markera Hyperstacksför stackering markerar du Öppna filer individuellt,markerar Automatisk skalningoch markerar Dela kanaler. För färgalternativet väljer du Färglägga .
  3. Klicka på Plugins | Makron | Spela in.
  4. Klicka på Bild | Justera | Tröskelvärdet. Välj bildtyp som röd i rullgardinsmenyn till höger i tröskelfönstret. Justera minimitröskeln tills programvaran bara markerar områden med fluorescens(figur 3A)och klicka på Verkställ. Programvaran kommer att konvertera bilden till svartvitt, med det valda området i svart.
    OBS: Använd samma tröskel för varje bild i läkemedelsskärmen för att hålla resultaten standardiserade och jämförbara.
  5. Klicka på Analysera | Mät. Programvaran kommer att dra upp ett resultat fönster som innehåller fluorescerande område för den bilden.
  6. Klicka på Skapa i fönstret Makroinspelare. Då öppnas ett nytt fönster med koden för makrot. Markera alla önskade bilder för analys och öppna som i steg 6.2.
  7. Välj Kör i fönstret med makrot. Resultatfönstret kommer nu att innehålla området för varje bild.
    OBS: Bildanalysen kan göras individuellt utan att registrera och köra ett makro samt genom att upprepa ovanstående steg för varje bild.
  8. Kopiera de uppmätta data till ett kalkylblad. I genomsnitt är den totala fluorescensen för alla kontrollprover (DMSO). Beräkna procentskillnaden med hjälp av följande formel: –[(genomsnittlig DMSO-område – experimentellt område)/genomsnittlig DMSO-område] x 100 % (figur 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter protokollet som beskrivs ovan, var zebrafish xenografted i äggula och hjärtsäcken med primära patienten PBMCs som ursprungligen isolerades från en T-cells akut lymfatisk leukemi (T-ALL) patient vid diagnos och bankas som en livskraftig, fryst prov. Vid 48 hpi, xenografted fisk screenades för fluorescerande märkta tumör celler (figur 2C,D) och behandlas med kemoterapi (dexametason eller vincristine) eller DMSO. Fisk avbildades vid 7 dpi, efter 3 dagar på läkemedelsbehandling med hjälp av en fluorescens mikroskop utrustad bildbehandling enhet och automatiserad sampler enhet (figur 3A).

Den fluorescerande området/ tumör bördan mättes för varje fisk avbildas med ImageJ och jämfört mellan de olika läkemedelsbehandling grupper och DMSO (Figur 3B). Totalt sett visade xenografted fisk behandlas med vincristine den största och mest konsekventa minskningen av xenografted cell massa jämfört med DMSO behandlad fisk. Dexametasonbehandlad fisk visade ungefär hälften av minskningen av tumörområdet jämfört med vincristine, men visade fortfarande en minskning av tumörområdet jämfört med DMSO (figur 3). Detta härmade vad som sågs i patienten, som deras leukemi snabbt svarat på terapi med en kombination av dexametason och vincristine. Dessa resultat visar förmågan hos zebrafisk xenograft modeller att vara mottagliga för drogscreening och automatiserad avbildning och kvantifiering, vilket ger en plattform för att testa olika patientprover eller cellinjer med olika läkemedel eller kombinationer drog.

Figure 1
Bild 1: Xenograft drogskärm och bildhanteringsarbetsflöde. Schematisk av arbetsflödet för xenografting zebrafisklarver och utföra drogskärm, inklusive bildbehandling på en fluorescens mikroskop utrustad bildenhet och automatiserad sampler enhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Injektionsställe och representativa bilder av screening xenografted fisk. Bilder av mikroinjektornål vid injektionstillfället i antingen äggulan (A) eller hjärtsäcken (B) av 2 dpf zebrafisklarver. Representativa bilder av screening vid 2 dpi skildrar urval av zebrafiskar för drogskärm(C,D). Zebrafiskar med liknande engraftment (1−3 och 1'−3') bör väljas, oenograferade zebrafiskar (5 och 5') bör avlägsnas. För äggula injicerad fisk, ta bort fisk där gränserna för äggulan inte kan ses runt engrafted cellmassa (4) eftersom det gör kvantifiering svårt. För perikardvätska injicerad fisk, ta bort fisk där injicerad cellmassa inkräktar i gulesäck (4'). Skala bar = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Läkemedelsbehandling kan minska xenografted tumör område in vivo. Representativa bilder av zebrafiskar injiceras i hjärtsäcken eller äggula efter 3 dagars behandling med DMSO eller droger, antingen vincristine eller dexametason. Område av engrafted tumör massa kvantifierades genom att ställa in en fluorescens tröskel med ImageJ, välja alla pixlar över den inställda tröskeln, och mäta området och genomsnittlig fluorescens i de valda regionerna. Pixlar över det valda tröskelvärdet visas i svart, medan pixlar under tröskelvärdet visas i vitt. Pixlar mättes i både äggula och hjärtsäck injiceras zebrafisk bilder (A). Behandling med vincristine ledde till en minskning av engrafted tumör område jämfört med DMSO kontroll med n = 4 fisk behandlas per grupp (B). SD = standardavvikelse. Skala bar = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna studie visade vi en standardiserad metod för upptining och injektion av primära patienten leukemi celler i zebrafish som en xenograft modell. Vi etablerade också ett protokoll för hög genomströmning drog screening av xenografted zebrafisk med hjälp av en fluorescens mikroskop utrustad bildhantering enhet och automatiserad sampler enhet. Tidigare har xenografts rapporterats med mänskliga cellinjer, och kvantifiering av xenografted tumörer i en hög genomströmning sätt har varit en utmaning i området. Denna metod fungerar som en grund för studier för att utnyttja en fluorescens mikroskop utrustad bildbehandling enhet och automatiserad sampler enhet som ett sätt att automatisera bildbehandling av xenografted zebrafisk, med det slutliga målet att utföra hög genomströmning läkemedelsskärmar att förutsäga vilka läkemedel en viss patientens cancer kan svara på, vilket öppnar möjligheten för mer personlig medicin.

Trots möjligheten att automatisera mycket av detta protokoll, det finns fortfarande många tekniska utmaningar som inte bör förbises. För det första är det viktigt att celler injiceras i zebrafisk så snabbt som möjligt efter färgning för att förhindra cellklumpning och celldöd. Larver måste dechorionated innan du utför cellen färgning protokollet. Glasglödnålar bör också hållas kalla innan nålen laddas för att minska nåltäppningen. Dessutom är det viktigt att använda embryon som produceras av friska vuxna zebrafiskar i åldern 6 månader till 1 år för att säkerställa bästa livskraft hos xenografted larver. Slutligen bör xenografted fisk noggrant kontrolleras för tumör engraftment, och endast de med liknande tumör volymer bör användas i läkemedelsscreening för att minska variabiliteten i slutresultatet.

Även om vi använde primära patienten leukemi PBMCs för våra experiment, kan detta protokoll utföras med någon tumör typ eller cancer cellinje. För cellinjer i kultur, vidhäftande celler bör trypsinized och sedan tvättas i PBS innan du fortsätter med färgning protokollet. Det är också viktigt att notera att engraftmentfrekvensen kan variera från ett prov till ett annat och mellan provtyperna15. Till exempel, i vårt PBMC-prov, var >90% av cirkulerande PBMCs leukemic blaster, men detta antal kan variera avsevärt från en patient till nästa, vilket kan påverka engraftment hastighet. Eftersom resultaten jämförs med en DMSO-kontroll inom samma provtyp finns det en intern kontroll för engraftmenthastighet, men denna variation bör beaktas när man beslutar hur många celler som ska injiceras per zebrafisk. Vi har funnit framgång när vi använder 250−1 000 celler som injiceras per djur, och 500 är optimalt för våra studier. Medan våra experiment avslutades när larver var 7 dpf, skulle vi inte förvänta xenografts att överleva i djuren under längre tidspunkter, som immunsystemet börjar utvecklas vid denna punkt, och skulle sannolikt orsaka avvisande av mänskliga celler. Immunkomprometerade zebrafisk linjer har skapats, med prkdc-/-;il2rga-/- zebrafisk som kan engrafting mänskliga cancerceller16,17, som kan vara användbara för längre sikt xenografts eller bedöma tumör återkommer efter läkemedelsbehandling. Dessa immunodeficientlinjer måste dock bibehållas som heterozygoter, så larver måste genotypas före användning. Homozygous fisk måste också behandlas med läkemedel för att tömma makrofager för att möjliggöra tillförlitlig engraftment av mänskliga celler, vilket kan komplicera resultaten av läkemedelsscreening. För närvarande är dessa linjer varken praktiska eller nödvändiga för storskalig läkemedelsscreening på larver, som kan slutföras innan immunsystemet är fullt fungerande vid 7 dpf18.

Våra representativa resultat fokuserar på injektion av celler i hjärtsäcken och äggula för enkel och hastighet av injektion och ökad lönsamhet; emellertid, cancerceller kan injiceras i många andra anatomiska platser och vi har haft framgång med hjälp av detta arbetsflöde på andra platser, inklusive kanalen av Cuvier, hjärnan, retro-orbital, och perivitelline sac. Dessutom är det svårt att uppskatta hur mycket av varje läkemedel larvfisken absorberar; om få läkemedel används, helst en toxicitet skärm vid en rad doser (vanligtvis 0,1 till 25 μM) kommer att utföras före den storskaliga analysen för att bestämma den maximala tolererad dos (MTD). Vi valde att använda MTD för varje läkemedel för vår analys, men 10 μM av läkemedel används ofta i zebrafisk fältet som en startkoncentration för hög genomströmning drogscreening och är i allmänhet tolereras väl. Kombinationer av läkemedel i pooler kan användas som en första skärm, liksom, för att öka effektiviteten i screening genom en stor volym sammansatta bibliotek19.

Även om detta tillvägagångssätt är mer automatiserad och effektivt än tidigare rapporterade arbetsflöden, är detta fortfarande ett arbetsintensivt och tekniskt utmanande protokoll för alla utan tidigare erfarenhet av mikroinjecting zebrafisk. Drogscreening i zebrafisk xenografts är osannolikt att någonsin nå lätthet och effekt av in vitro screening av sammansatta bibliotek och saknar vissa fördelar med mus xenograft modeller. En stor begränsning med zebrafiskar är till exempel att cancerceller inte lätt kan hämtas från fisk efter att ha xenografting på användbara tal för mobilbank eller de flesta experiment nedströms. Även om detta var möjligt, skulle de mänskliga cancercellerna har vuxit i flera dagar i icke-fysiologiska temperaturer och miljöer och skulle inte vara praktiskt för användning i senare tillämpningar. Effekterna av en något lägre än fysiologisk temperatur på läkemedelskinetik och tumörcell svar är inte heller känt, och kan ge förvirrande resultat. Trots dessa varningar fyller zebrafiskar ett tomrum i att vara en mer praktisk och kostnadseffektiv metod för att utföra större skala in vivo drogskärmar än vad som är möjligt i mus xenograft modeller. Dessutom, zebrafisk xenografts kräver mycket färre celler för injektion än mus modeller, så en liten mängd patientprov kan spridas bland hundratals till tusentals zebrafiskar, vilket möjliggör läkemedelsskärmar med stora provnummer. Med fluorescerande märkning kan tumörceller övervakas från det ögonblick de xenografted i larv zebrafisk, vilket ger viss standardisering mellan de djur som används i läkemedelsskärmar. Genom att kombinera dessa fördelar med zebrafiskar med möjligheten till automatiserad avbildning och kvantifiering av engrafted celler öppnar många möjligheter för att göra hög genomströmning läkemedelsscreening av patienttumörer för personlig medicin till verklighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av en V Foundation V Scholar Award och NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (till JS Blackburn) och NIH Training Grant T32CA165990 (till M.G. Haney).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x TBE Liquid Concentrate VWR 0658-5L
96-well plate, flat bottom CELLTREAT 229195 VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary without Filament Sutter Instrument Company B100-50-10
Dexamethasone Enzo Life Sciences BML-EI126-0001
DMSO Sigma-Aldrich D2438-5X10ML
E3 media N/A 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Femtotips Microloader Tips Eppendorf 930001007
Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) Atlanta Biologicals S11150H
ImageJ FIJI N/A https://imagej.net/Fiji
Iscove's Modified Dulbecco's Medium STEMCELL Technologies 36150
Large Particle (LP) Sampler Union Biometrica N/A automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10MG
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
Phosphate Buffered Saline (1x) Caisson labs PBL06-6X500ML
Stage Micrometer (400-Stage) Hausser Scientific 400-S
Tricaine-S Pentair Aquatic TRS1
Trypan Blue Thermo Fisher T10282
VAST Bioimager Union Biometrica N/A fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/
Vincristine Sulfate Enzo Life Sciences BML-T117-0005
Vybrant DiI Stain Thermo Fisher V22885

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
  2. Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
  3. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
  4. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
  5. Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
  6. Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
  7. Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
  8. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
  9. Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
  10. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
  11. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  12. Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
  13. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  14. Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
  15. Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
  16. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  17. Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
  18. Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  19. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).

Tags

Cancerforskning zebrafisk patient-härledda xenograft hög genomströmning drog skärm leukemi automatiserad
Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haney, M. G., Moore, L. H.,More

Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish. J. Vis. Exp. (158), e60996, doi:10.3791/60996 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter