Summary
Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.
Abstract
Hasta türetilmiş ksenogreft modelleri, farklı kanserlerin in vivo bir sistemde ilaç tedavisine nasıl tepki verecek lerini tanımlamada kritik öneme karşıdır. Fare modelleri alanında standart, ancak zebra balığı çeşitli avantajları ile alternatif bir model olarak ortaya çıkmıştır, yüksek üretim ve düşük maliyetli ilaç tarama yeteneği de dahil olmak üzere. Zebrabalığı da daha önce sadece in vitro sistemleri ile elde edildi büyük çoğaltma numaraları ile in vivo ilaç tarama için izin verir. Hızlı bir şekilde büyük ölçekli ilaç ekranları gerçekleştirmek için yeteneği geri kliniğe sonuçların hızlı çevirisi ile kişiselleştirilmiş tıp için olasılık açılabilir. Zebrabalığı ksenogreft modelleri de hızla hedeflenen tedavilere tümör yanıtı dayalı eyleme mutasyonlar için tarama veya büyük kütüphanelerden yeni anti-kanser bileşikleri belirlemek için kullanılabilir. Bu alandaki mevcut büyük sınırlama, ilaç ekranların daha büyük ölçekte yapılabilecek ve daha az emek yoğun hale getirilebilmek için süreci nicelleştirmekte ve otomatikleştirmekte verilmiştir. Birincil hasta örneklerini zebrabalığı larvalarına dönüştürmek ve floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi kullanarak büyük ölçekli ilaç ekranları gerçekleştirmek için bir iş akışı geliştirdik. Bu yöntem, engrafted tümör alanının standardizasyonu ve nice sayıda zebra balığı larvası arasında ilaç tedavisine yanıt lanmasına olanak sağlar. Genel olarak, bu yöntem geleneksel hücre kültürü ilaç taraması üzerinde avantajlı ilaç tedavisi boyunca bir in vivo ortamda tümör hücrelerinin büyümesine olanak sağlar, ve vivo ilaç ekranlarında büyük ölçekli fareler daha pratik ve maliyet-etkin.
Introduction
Model organizmalar içine primer hasta kanserleri veya insan kanser hücresi hatları xenografting in vivo tümör progresyonu ve davranışını incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ilaç tedavisine tümör yanıtı, ve mikroçevre ile kanser hücresi etkileşimi, diğerleri arasında. Geleneksel olarak, hücreler bağışıklık tehlikeye fareler içine ksenogreftli, ve bu alanda standart kalır. Ancak, bu model sistemi gibi çeşitli sınırlamalar vardır, yüksek maliyet gibi, düşük çoğaltma numaraları, doğru in vivo tümör yükünü niteleme zorluklar, ve tümörler için gereken uzun süre engraft ve ilaç testi tamamlanması için. Son yıllarda, zebra balığı alternatif bir ksenogreft modeli olarak ortaya çıkmıştır, ilk rapor ile 2005, yeşil floresan protein ile (GFP) etiketli insan melanom hücre hatları blastula-evre embriyolar içine nakledilen1,2. Daha yakın zamanda, 2 gün post-fertilizasyon (dpf) zebra balığı larvaları enjeksiyonanatomik yerinin kontrolü için ksenogreft alıcıları olarak ve çevredeki mikroçevre ile tümör etkileşiminin vivo görüntüleme yüksek çözünürlükte kullanılmak üzere kullanılmıştır3,4.
Zebra balığı ksenogreft modeli olarak birçok avantaj sunar. İlk olarak, yetişkin zebra balıkları nispeten düşük bir maliyetle büyük miktarlarda yetiştirilebilir ve ağırlanabilir. Yetişkin zebra balıklarının her çiftleşerek haftada yüzlerce larva balığı üretebilir. Küçük boyutları nedeniyle, bu larva zebra balıkları yüksek iş itme ilaç taraması için 96-iyi plakalar muhafaza edilebilir. Larvalar tipik bir ksenogreft deneyi sırasında beslenmek zorunda değildir, çünkü sarısı keseleri yaşamın ilk haftasında besinleri devam ettirir. Ayrıca, zebra balıkları 7 dpf'ye kadar tam işlevsel bir bağışıklık sistemine sahip değildir, yani ksenogreft enjeksiyonundan önce ışınlama veya immünsupresif rejimlere ihtiyaç duymaz. Son olarak, optik olarak berrak zebra balığı hatları tümör-mikroçevre etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine olanak sağlar.
Belki de bir ksenogreft modeli olarak zebra balığının en umut verici uygulaması, insan kanser örnekleri üzerinde başka bir model organizma kullanılarak mümkün olmayan bir şekilde yüksek kapsamlı ilaç taraması yapabilme yeteneğidir. Larvalar deri yoluyla sudan ilaç absorbe, ilaç yönetimi kolaylığını artırmak5. Hayvanlar genellikle 100−300 μL suda 96 kuyulu tabaklarda muhafaza edildiklerinden, ekranlar farelere göre daha küçük ilaç miktarları gerektirir. Şu anda, zebra balığında ilaçların insan tümör yükü üzerindeki etkisinin standardizasyonu ve ölçülmesi için birkaç farklı yöntem vardır ve bunların bazıları yüksek iş yapma taraması için tek ilaç testinin ölçeklendirilmesi için diğerlerinden daha pratiktir. Örneğin, bazı gruplar tek hücreli süspansiyonlar halinde balık ayırmak ve süspansiyon bireysel damlacıkları görüntüleme ve yarı otomatik ImageJ makro4kullanarak floresan ölçerek floresan etiketli veya lekeli tümör hücreleri ölçmek 4 . Larva balıklarının 96 kuyulu plakalarda sabitlendiği ve kompozit görüntülerin yeniden düzenlenmesi nden ve tümör hücre foci6'nınsayısallaştırılmasından önce ters floresan mikroskop kullanılarak görüntülendiği yarı otomatik tam larva görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir. Bu tahlillerin her ikisi de, zebrabalığı ksenogreft modellerinde gerçekten yüksek işlem li ilaç taraması pratik hale getiren nicelikselleştirme için oldukça emek yoğun yöntemlerdir.
Bu sorun Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi (VAST) Biyoimager ve Büyük Parçacık (LP) Örnekleyici, bir floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi(Şekil 1 ve Malzeme Tablosu)geliştirilmesi ile ele alınmıştır, zebrabalığı larvalarıyüksekişlem görüntüleme için gerçekten otomatik bir yöntemdir 7,8,9. Bu ünite ile balıklar anestezi altına alınır, otomatik olarak 96 kuyulu bir plakadan örneklenir, kılcal damara yerleştirilir ve önceden ayarlanmış bir kullanıcı tercihine göre set oryantasyonuna döndürülür, görüntülenir ve daha sonraki çalışmalar için 96 kuyulu yeni bir plakanın aynı kuyuya geri yerleştirilir veya atılır. Zebrabalığı ksenogreftleri ile bu görüntüleme teknolojisi nin birleştirilmesi, bireysel hasta tümörlerine karşı büyük ilaç bileşik kütüphanelerinin yüksek işlem li ilaç taraması kullanan kişiselleştirilmiş ilaç olasılığına olanak sağlayabilir. Zebra balığı ksenogreftler de vivo yeni bileşiklerin toksisitesi ve etkinliğini test etmek için büyük ölçekli ve düşük maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Zebra balığı fare ksenogreft modellerine geçmeden önce bir ön tarama adımı olarak kullanılabilir.
Birincil hasta lösemi hücrelerinin zebra balığına dönüştürülmesi ve diğer primer hasta tümör hücrelerine veya kanser hücresi hattına uygulanabilen otomatik görüntüleme ve niceleme ile yüksek iş yapma lı ilaç ekranları gerçekleştirmek için düzenli bir iş akışı geliştirdik. Bu iş akışı, mevcut standardizasyon ve niceleme yöntemlerini geliştirmek için floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesinden yararlanmış ve in vivo tümör kütlesini ölçmek için daha önceki, daha emek yoğun yöntemlere otomatik bir alternatif sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol 2015-2225) tarafından onaylanmıştır. Hasta örnekleri University of Kentucky Kurumsal İnceleme Kurulu (protokol 44672) altında toplanmıştır. Bu protokolden sonra yapılan tüm hayvan deneyleri kullanıcının Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmalıdır.
1. Erime Primer Hasta Akut Lenfoblastik Lösemi Hücreleri
- 37 °C'lik bir su banyosunda dondurulmuş stoktan birincil hasta periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) eritin. Hücreler çözüldükten hemen sonra, dondurucu ortamlarındaki hücreleri (%90 FBS + %10 dimetil sülfoksit [DMSO]) yavaş pipetleme li 15 mL konik bir tüpe aktarın ve hava kabarcıklarından kaçının. Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun orta [IMDM]'inde önceden ısıtılmış 37 °C'lik erime ortamının 10 mL'sini (%25 fetal sığır serumu [FBS]) 15 mL'lik konik tüpteki hücrelere damla şeklinde (mL başına yaklaşık 2−3 s) ekleyin.
NOT: PBMC'ler tanı sırasında hasta kan örneklerinden alındı. Buffy kat yoğunluk santrifüj ile ayrılmış ve hücreler RPMI 1640 + 10% FBS 2x yıkandı. Hücreler sayıldı ve 1 mL dondurucu ortamda cryovial başına 107 hücre donduruldu ve -80 °C'de depolandı. - 10 dk için 100 x g centrifuge hücreleri ve hücre peletinden aspire ortam. Çözülme ortamı, santrifüj ve aspirasyon ekini, kalan DMSO'yu kaldırmak için bir kez daha tekrarlayın.
- Fosfat tamponlu salin (PBS) 5 mL hücreleri resuspend ve otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre saymak için 10 μL kaldırın. Sayım için kaldırılan 10 μL'lik hücrelere 10 μL trypan mavisi ekleyin. ML başına hücre sayısını sayın ve daha sonra ksenogreftleme için hücreleri yeniden askıya almak için hacmi hesaplamak için kaydedin (bkz. adım 2.5).
NOT: Tipik olarak, 500 hücre larva zebra balığı başına ksenogreftli. Örneğin, 1.000 zebra balığı enjekte etmek için 5 x 105 hücre gereklidir. Ksenogreftleme için kullanılabilirlik >%85 olmalıdır. Bu deneyde, hücre canlılığı erime den sonra% 96 oldu, trypan mavi boyama ile değerlendirildi.
2. DiI ile Floresan Etiketleme Hücreleri
- 5 dk için 200 x g pbs 5 mL istenilen hücre numarasını santrifüj ve aspire supernatant. Enjeksiyon sırasında iğnenin yüklenmesinde sorun veya sorun olması durumunda en az 2 x 106 hücreyi lekelendirin.
- 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindokargloyanin perklorat (DiI) boyama çözeltisi (5 mL PBS içeren 4 μL DiI leke, Malzeme Tablosu)yapın ve leke çözeltisindeki hücre peletini yeniden askıya alın.
NOT: Boyama çözeltisinde yeniden askıya alınan hücre yoğunluğu 2 x 106 hücre/mL'yi geçmemelidir. - 37 °C'deki inkübleri ışıktan 20 dakika, girdap yavaşça korunur, daha sonra ışıktan korunan 15 dk boyunca buz üzerindeki hücreleri kuluçkaya yatırır.
- 5 dk ve aspire supernatant için 200 x g santrifüj hücreleri. 5 mL PBS, santrifüj 200 x g 5 dk ve aspire supernatant ile hücreleri yıkayın. Yıkama, santrifüj ve aspirasyon bir kez daha tekrarlayın.
- 250.000 canlı hücrede 1 μL PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrosentrifuge tüpüne aktarın. Karanlıkta buzun üzerindeki hücreleri yeniden askıya alın ve hemen mikroenjeksiyonlara devam edin.
NOT: Bu, 2 nL hacimli her enjeksiyon pompası ile zebra balığına 500 hasta hücresi enjekte edilmesini sağlar.
3. Mikroenjeksiyon zebra balığı larvaları
NOT: Mikroenjeksiyonlar hücrelerin canlılığını artırmak için boyama 1−3 saat içinde tamamlanmalıdır.
- Hücreleri boyama ve enjekte edilmeden önce, 1x Tris/borate/EDTA (TBE) içine 25 mL %3 agarose dökerek enjekte etmek için agarose plakalar yapın ve katılaşmasını bekleyin. Plakaları 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- Ayrıca hücreleri boyama ve enjekte önce, bir diseksiyon mikroskop altında forceps kullanarak 2 dpf zebra balığı dechorionate. Manuel dechorionation için, chorion gözyaşları ve zebra balığı unenveloped10hale gelene kadar forseps ile zebrabalığı koruyucu chorion zıt uçlarından çekin.
NOT: Dechorionation da pronase ile enzimatik tedavi kullanılarak yapılabilir, daha önce açıklandığı gibi10. Casper (roy-/-;nacre-/-) zebra balığı bu deneyler de kullanılmıştır11. Herhangi bir zebra balığı larva sıyrık ksenografting için kullanılabilir. Pigment görüntüleme veya görüntülemeile müdahale ederse, optik berrak zebra balığı suşları mevcut değilse melanin sentezini engellemek için proylthiourasil (PTU) tedavisi kullanılabilir12. - Mikroenjeksiyon sırasında hücrelerin kümelenmesini önlemek için 4 °C'de veya buz üzerinde önceden iğneler. Mikroyükleyici pipet uçları kullanarak 5 μL'lik vitrifiyeyi soğutulmuş nonfilamentöz borosilikat cam iğneye yükleyin.
NOT: Mikroenjektör ve iğne kurulum yöntemleri daha önce13yayınlanmıştır . - İğneyi mikroenjektör koluna yükleyin. İğne ucunu steril bir jilet kullanarak bevel. Bir aşama mikrometresi kullanarak mineral yağdaki damlacık boyutunu ölçün ve damlacık hacmini 2 nL (~0,15 mm çapında) boyunca tutarlı bir şekilde tutarak ölçün.
- ~30 dechorionated 2 dpf zebra balığı 25 mL E3 ortam içeren bir Petri kabında anestezi kullanabilirsiniz 4 mg/mL tricaine-S 350 μL kullanın. ~1 dk anesteziedilmiş larvayı düz yüzeyenjeksiyon plakasına (Petri kabında %3 agarose) aktardıktan ve larvaları istenilen enjeksiyon yerinde bir pompa lekeli hücre ile enjekte ettikten sonra (örn. sarısı veya perikard; bkz. Şekil 2A,B).
NOT: Enjeksiyon yeri deney amacına göre seçilmelidir. En sık enjeksiyon bölgesi sarısıdır. Kan dolaşımında dolaşan hücreleri almak için, perikard, Cuvier kanalı, perivitellin uzay, veya retro-orbital uzay enjeksiyon siteleri olarak kullanılabilir. Ortotopik enjeksiyon siteleri de kullanılabilir, beyin gibi. - Enjeksiyon plakasını 10 cm2 Petri kabına (plaka başına 30 larva) yıkayın ve 1 saat iyileşme süresi boyunca 28 °C'de metilen mavisi olmayan E3 media14 ve inkübasyon içeren bir kaplayın. İstenilen sayıda larva enjekte edilene kadar enjekte edin.
NOT: İdeal olarak, deneyler için gereken larva sayısını 2−2,5 kat enjekte edin. Enjeksiyondan kaynaklanan stres ve artan kuluçka sıcaklığı nedeniyle larvaların bir miktar kesilmesi olacaktır. Tipik olarak, teknik ile uygulamadan sonra, 800−1.500 zebrabalığı larvaları lekeli hücreler enjekte edilmelidir 1−3 h içinde tek bir kişi tarafından enjekte edilebilir. - Enjekte edilen larva plakalarını 34 °C'lik bir kuluçka makinesine taşıyın. Petri larvalarını, E3 suyunun aşırı ısınmasını önlemek için kuvözdeki metal bir rafa doğrudan yerleştirmeyin. Örneğin, bir tampon olarak hareket etmek için raf ve larva Petri çanak arasında boş bir Petri çanak yerleştirin. 24 ve 48 saat sonrası enjeksiyon (hpi) sonra ölü zebra balığı larvaları çıkarın.
4. Xenografted Zebrafish ile İlaç Ekran Kurma
-
48 hpi'de, floresan/tümör engraftment ve sağlık için ekran zebra balığı larvaları(Şekil 2C,D). Ölü veya yanlış biçimli zebra balıklarını çıkarın ve benzer engraftment ile zebra balıklarını seçin(Şekil 2C,D, 1−3 ve 1'−3'). Aşılanmamış zebra balıklarını çıkarın(Şekil 2C,D, 5 ve 5').
- Sarısı enjekte edilen balıklar için, kantifikasyonu zorlaştırdığı için, engrafted hücre kütlesi(Şekil 2C, 4) etrafında yumurta sarısı sınırları görülemeyen balıkları çıkarın. Perikard enjekte edilen balıklar için, enjekte edilen hücre kitlesinin sarısı kesesine girdiği balıkları çıkarın(Şekil 2D, 4').
- 96-iyi plaka zebra balığı ekleyin. Bunu yapmak için, 4 dpf zebra balığının sığması için yeterince büyük olan 200°L pipet ucunu kesin. P200 pipetkullanarak plakadan bir zebra balığı ile 150 μL E3 ortam alıvurun ve düz tabanlı 96 kuyulu bir plakanın boş bir kuyuya ekleyin.
- E3 media gerekli hacimde test edilecek ilaç seyreltmek, iyi başına 150 μL. 2 kat istenilen konsantrasyonda ilaç hazırlayın. Örneğin, her kuyudaki toplam hacmin yarısı ilaç çözeltisi olduğundan, istenilen nihai konsantrasyon 10 μM ise, E3'te 20 μM'lik ilaç hazırlayın. DMSO kontrol grubu için, ilaçla aynı hacimde DMSO ekleyin.
- 150 μL E3'te zebra balığı larvası içeren her kuyuya 150 μL 2x seyreltilmiş ilaç çözeltisi ekleyin, kuyu başına 1x ilaç çözeltisi ile 300°L'lik son bir hacim için.
- Plakayı 34 °C'de kuluçkaya yatırın. Her gün ölü zebra balığı olup yok. 2 gün sonra, istenirse, 96 kuyulu plakanın her kuyusundan 200 μL sıvıyı çıkararak ve E3 ortamlarında 200°L 1x seyreltik ilaç çözeltisi veya DMSO ile değiştirerek ilacı yenileyin.
NOT: En iyi sonuçlar bu deney için ilaç tedavisi 3 gün sonra bulundu; ancak, ilaç tedavisinin süresi 2−4 gün arasında değişebilir ve yapılan deneye veya kullanılan ilaçlara bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir.
5. Floresan Mikroskop Donanımlı Görüntüleme Ünitesi ve Otomatik Örnekleyici Ünitesi Kullanılarak Xenografted ZebraFish Görüntüleme
- Taze 1 L 4 mg/mL triain ve 1.5 L E3 ortam hazırlayın. Ortam şişesi 1'i E3 media ve media bottle 2'yi tricaine ile doldurun.
- Görüntüleme yazılımındaki tüm istenmeyen floresan kanalları kaldırın ve istediğiniz kanalı ekleyin (Bu deneme için DiI). Bir görüntü sadece bir onay işareti ile kanallar için alınacaktır gibi istenilen floresan kanal kontrol edin. Ayrıca, görüntülerin nasıl çekileceklerini seçin (z-yığınları, otomasyon, seri döngüler, vb.).
NOT: Bu deney için, en iyi odaklama ile en yüksek sayıda görüntü elde etmek için görüntülenmiş her balık için odak el ile ayarlandı. - Uygun maruz kalma süresi görüntüleme yazılımı ayarlanabilir, böylece ilaç tedavi balık önce DMSO kontrol balık görüntü. Pozlama ayarlandıktan sonra, deneme süresince pozlama süresini değiştirmeyin.
NOT: Odak, odak dışı görüntülerin olmadığından emin olmak için her zebra balığı için manuel olarak ayarlanabilir veya tam otomatik görüntüleme için, aynı odak, analiz gerçekleştirmeden önce atılan veya balık yeniden görüntülenen odak dışı görüntülerle balıklar arasında kullanılabilir. Ayrıca, bu deney herhangi bir floresan görüntüleyici kullanılarak ve ardından ImageJ yazılımı kullanılarak floresan nicelik kullanılarak yapılabilir.
6. ImageJ kullanarak Floresan Miktarını Niteleme
- ImageJ yazılımLarını açın.
-
Dosyaya Git | İstediğiniz .czi dosyasını açın ve seçin. Yazılım bir alma seçenekleri penceresi getirecektir.
- Stack görüntüleme için select Hyperstacks, Dosyaları Tek tekişaretleyin, Otomatik Ölçek'i denetleyinve Bölünmüş Kanalları denetleyin. Renk seçeneği için Colorized'iseçin.
- Eklentiler | Makrolar | Kaydet.
- Resim | Ayarla | Eşik. Eşik penceresinin sağ tarafındaki açılır menüde resim türünü kırmızı olarak seçin. Yazılım yalnızca floresan(Şekil 3A)alanları vurgulayana kadar minimum eşiği ayarlayın ve Uygula'yı tıklatın. Yazılım siyah ve beyaz, siyah seçilen alan ile fotoğraf dönüştürecektir.
NOT: Sonuçları standart ve karşılaştırılabilir tutmak için ilaç ekranındaki her görüntü için aynı eşiği kullanın. - Analiz Et ' i tıklatın | Ölçün. Yazılım, bu görüntü için floresan alanı içeren bir sonuç penceresi yukarı çekecektir.
- Makro Kaydedici penceresinde Oluştur'u tıklatın. Bu, makronun koduyla birlikte yeni bir pencere açar. Analiz için istenen tüm görüntüleri vurgulayın ve adım 6.2'deki gibi açın.
- Makroile pencerede Çalıştır'ı seçin. Sonuç penceresi artık her görüntü için alan içerir.
NOT: Görüntü analizi, bir makroyu kaydetmeden ve çalıştırmadan ve her görüntü için yukarıdaki adımları yineleyerek ayrı ayrı yapılabilir. - Ölçülen verileri elektronik tabloya kopyalayın. Tüm kontrol (DMSO) örneklerinin toplam floresansının ortalaması. Aşağıdaki formülü kullanarak yüzde farkını hesaplayın: –[(ortalama DMSO alanı – deneysel alan)/ortalama DMSO alanı] x %100 (Şekil 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü takiben, zebra balıkları, tanı sırasında t-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) hastasından izole edilmiş ve uygun, dondurulmuş bir örnek olarak lanse edilen primer hasta PBMC'leri ile yolk ve perikard da ksenogreftlendi. 48 hpi'de, ksenogreftli balıkfloresan etiketli tümör hücreleri(Şekil 2C,D)için tarandı ve kemoterapi (deksametazon veya vinkristin) veya DMSO ile tedavi edildi. Floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi kullanılarak ilaç tedavisine 3 gün sonra balıklar 7 dpi olarak resmedilmiştir(Şekil 3A).
Floresan alan/tümör yükü ImageJ kullanılarak görüntülenmiş her balık için ölçüldü ve farklı ilaç tedavi grupları ile DMSO arasında karşılaştırıldı (Şekil 3B). Genel olarak, vinkristin ile tedavi edilen ksenogreftli balıklar, DMSO'ya göre ksenogreftli hücre kitlesinde en büyük ve en tutarlı düşüşü gösterdi. Deksametazon tedavi edilen balıklar, tümör bölgesinde vinkristine göre yaklaşık yarısı azalma göstermiş, ancak yine de DMSO'ya göre tümör alanında azalma göstermiştir(Şekil 3). Bu durum, löseminin deksametazon ve vinkristin kombinasyonuyla tedaviye hızla yanıt vermesiyle hastada görülenleri taklit etti. Bu sonuçlar, zebra balığı ksenogreft modellerinin ilaç taraması ve otomatik görüntüleme ve nicelemeye uygun olma yeteneğini göstererek, çeşitli hasta örneklerini veya hücre hatlarını farklı ilaç veya ilaç kombinasyonları ile test etmek için bir platform sağlamaktadır.
Şekil 1: Ksenogreft ilaç ekranı ve görüntüleme iş akışı. Bir floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi görüntüleme de dahil olmak üzere ksenogreftleme zebra balığı larvaları ve performans ilaç ekranı iş akışı şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Enjeksiyon bölgesi ve tarama ksenogreftli balıkların temsili görüntüleri. 2 dpf zebra balığı larvasının sarısı(A)veya perikard(B)içine enjeksiyon sırasında mikroenjektör iğnesi görüntüleri. 2 dpi tarama temsili görüntüler ilaç ekranı için zebra balığı seçimi tasvir(C,D). Benzer engraftment (1−3 ve 1'−3') ile zebra balıkları seçilmeli, aşılanmamış zebra balıkları (5 ve 5') çıkarılmalıdır. Sarısı enjekte edilen balıklar için, kantitatifikasyonu zorlaştırdığı için, engrafted hücre kütlesi (4) etrafında sarısı sınırları görülemeyen balık ları çıkarın. Perikard enjekte edilen balıklar için, enjekte edilen hücre kitlesinin sarı kesenin içine girdiği balıkları çıkarın (4'). Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İlaç tedavisi in vivo ksenogreftli tümör alanını azaltabilir. DMSO veya ilaçlar, vinkristin veya deksametazon ile tedavi 3 gün sonra perikard veya sarısı enjekte zebra balığı temsili görüntüler. Engrafted tümör kütlesinin alanı ImageJ kullanılarak bir floresan eşiği ayarlayarak, belirlenen eşiğin üzerindeki tüm pikseller seçilerek ve seçilen bölgelerin alanı ve ortalama floresansını ölçerek ölçüldü. Seçili eşiğin üzerindeki pikseller siyah, eşiğin altındaki pikseller ise beyaz renkte görünür. Pikseller hem sarısı hem de perikard enjekte edilen zebra balığı görüntülerinde ölçüldü (A). Vinkristin ile tedavi, grup başına tedavi edilen n = 4 balık ile DMSO kontrolüne göre engrafted tümör bölgesinde azalmaya yol açmıştır (B). SD = standart sapma. Ölçek çubuğu = 250 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, primer hasta lösemi hücrelerinin ksenogreft modeli olarak zebra balığına doğru çözülmesi ve enjeksiyonu için standart laştırılmış bir yöntem gösterilmiştir. Ayrıca floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesi kullanılarak ksenogreftli zebra balıklarının yüksek iş itimatlı ilaç taraması için bir protokol oluşturduk. Daha önce insan hücre hatları ile ksenogreftler bildirilmiştir ve ksenogreftli tümörlerin yüksek iş lenme li bir şekilde nicelleştirilmesi bu alanda bir sorun olmuştur. Bu yöntem, belirli bir hastanın kanserinin hangi ilaçlara yanıt verebileceğini tahmin etmek için yüksek kapsamlı ilaç ekranları gerçekleştirmek amacıyla, floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesini, daha fazla kişiselleştirilmiş tıp için olanaklar sunan, yüksek kapsamlı ilaç ekranları gerçekleştirmek amacıyla, floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi ve otomatik örnekleyici ünitesini kullanma çalışmaları için temel teşkil etmektedir.
Bu protokolün büyük bir kısmını otomatikleştirme yeteneğine rağmen, hala göz ardı edilmemesi gereken birçok teknik zorluk vardır. İlk olarak, hücrelerin hücre kümelenme ve hücre ölümünü önlemek için boyama sonra mümkün olduğunca çabuk zebra içine enjekte edilmesi önemlidir. Larvaların hücre boyama protokolünü gerçekleştirmeden önce dechorionated edilmesi gerekir. Cam filament iğneler de iğne tıkanmasını azaltmak için iğne yüklemeden önce soğuk tutulmalıdır. Ayrıca, 6 ay ile 1 yıl arası sağlıklı yetişkin zebra balığı tarafından üretilen embriyoların kullanılması, ksenogreftli larvaların en iyi canlılığını sağlamak için çok önemlidir. Son olarak, ksenogreftli balıklar tümör engraftment için dikkatle taranmalıdır, ve sadece benzer tümör hacimleri olanlar nihai sonuçlarda değişkenliği azaltmak için ilaç taramasında kullanılmalıdır.
Her ne kadar bizim deneyler için birincil hasta lösemi PBMCs kullanılan, Bu protokol herhangi bir tümör tipi veya kanser hücresi hattı ile yapılabilir. Kültürdeki hücre hatları için, yapışık hücreler boyama protokolüne geçmeden önce pbs ile yıkanmalı ve yıkanmalıdır. Engreftleme oranlarının bir örnekten diğerine ve örnek tip15arasında değişebileceğini de belirtmek önemlidir. Örneğin, PBMC örneğimizde, dolaşımdaki PBMC'lerin %90'ı lösemik patlamalardır, ancak bu sayı bir hastadan diğerine önemli ölçüde farklılık gösterebilir ve bu da engreftasyon oranını etkileyebilir. Sonuçlar aynı örnek türü ndeki Bir DMSO kontrolüyle karşılaştırıldığından, engreftleme oranı için bir iç kontrol vardır, ancak zebra balığı başına kaç hücre enjekte edilsin karar verirken bu varyasyon göz önünde bulundurulmalıdır. Hayvan başına enjekte edilen 250−1.000 hücreyi kullanırken başarı yakaladık ve 500'ün çalışmalarımız için en uygun uyguluyoruz. Deneylerimiz larvaların 7 dpf iken sonuçlandığı halde, bağışıklık sistemi bu noktada gelişmeye başladığından ve insan hücrelerinin reddedilmesine neden olacağından, ksenogreftlerin hayvanlarda daha uzun süre hayatta kalmalarını beklemeyiz. Bağışıklık tehlikeye zebra balığı hatları, prkdc ile oluşturuldu-/-;il2rga-/- zebrabalığı insan kanser hücrelerini engrafting yeteneğinesahip 16,17, hangi uzun vadeli ksenogreftler için yararlı olabilir veya ilaç tedavisi sonrası tümör nüks değerlendirmek. Ancak, bu immünyficient hatları heterozigot olarak muhafaza edilmelidir, bu yüzden larvalar kullanmadan önce genotipli olmalıdır. Homozigot balıklar da insan hücrelerinin güvenilir engraftment sağlamak için makrofajlar tüketmek için ilaçlar ile tedavi edilmelidir, hangi ilaç tarama sonuçları zorlaştırabilir. Şu anda, bu hatlar ne pratik ne de larvalar üzerinde büyük ölçekli ilaç taraması için gerekli, bağışıklık sistemi tamamen işlevsel önce tamamlanabilir 7 dpf18.
Bizim temsilcisi sonuçlar perikard içine hücrelerin enjeksiyonu odaklanmak ve enjeksiyon kolaylığı ve hızı ve artan canlılık için sarısı; Ancak, kanser hücreleri diğer birçok anatomik yerlere enjekte edilebilir ve biz cuvier kanalı da dahil olmak üzere diğer sitelerde bu iş akışını kullanarak başarı elde ettik, beyin, retro-orbital, ve perivitellin kese. Ayrıca, her bir ilacın ne kadarını larva balığının emdi olduğunu tahmin etmek zordur; birkaç ilaç kullanılırsa, maksimum tolere edilen dozu (MTD) belirlemek için büyük ölçekli tsay öncesinde çeşitli dozlarda (genellikle 0,1 ila 25 μM) ideal bir toksisite ekranı yapılacaktır. Biz bizim kontrol için her ilaç için MTD kullanmayı seçti, ancak, ilaç 10 μM yaygın yüksek iş itimat ilaç taraması için bir başlangıç konsantrasyonu olarak zebrabalığı alanında kullanılır ve genellikle iyi tolere edilir. Havuzlarda ilaç kombinasyonları bir başlangıç ekranı olarak da kullanılabilir, büyük hacimli bileşik kütüphane ile tarama verimliliğini artırmak için19.
Bu yaklaşım daha önce bildirilen iş akışlarına göre daha otomatik ve verimli olmasına rağmen, bu yine de mikroenjekte zebra balığı konusunda önceden deneyimi olmayan herkes için emek yoğun ve teknik açıdan zorlu bir protokoldür. Zebrabalığı ksenogreftlerinde ilaç taraması, bileşik kütüphanelerin in vitro taramasının kolaylığı ve etkinliğine ulaşma olasılığı düşüktür ve fare ksenogreft modellerinin bazı avantajlarından yoksundur. Örneğin, zebra balığı ksenogreftleri ile önemli bir sınırlama kanser hücrelerinin kolayca hücre bankacılığı veya en downstream deneyler için yararlı sayılarda ksenogreftleme sonra balık elde edilemez olmasıdır. Bu mümkün olsaydı bile, insan kanser hücreleri fizyolojik olmayan sıcaklıklar ve ortamlarda birkaç gün için büyüyen olurdu ve daha sonraki uygulamalarda kullanım için pratik olmaz. İlaç kinetik ve tümör hücre yanıtı üzerinde fizyolojik sıcaklık biraz daha düşük etkileri de bilinmemektedir, ve şaşırtıcı sonuçlar üretebilir. Bu uyarılara rağmen, zebra balığı xenografts fare xenograft modellerinde mümkün olandan daha vivo ilaç ekranlarında daha büyük ölçekli gerçekleştirmek için daha pratik ve maliyet-etkin bir yöntem olma boşluğu doldurmak yok. Ayrıca, zebra balığı xenografts fare modelleri ne kadar az enjeksiyon için gerektirir, bu nedenle hasta örnek küçük bir miktar zebra balığı binlerce yüzlerce arasında yayılabilir, büyük örnek numaraları ile ilaç ekranları için izin. Floresan etiketleme ile tümör hücreleri larva zebra balığına xenogreftedildikleri andan itibaren izlenebilir ve ilaç ekranlarında kullanılan hayvanlar arasında bir miktar standardizasyon sağlar. Zebrabalığı ksenogreftlerinin bu faydalarının otomatik görüntüleme ve engreftli hücrelerin sayısallaştırılması olasılığı ile birleştirilmesi, kişiselleştirilmiş tıp için hasta tümörlerinin yüksek iş yapma lı ilaç taraması yapılması için birçok olasılık açılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma V Vakfı V Scholar Ödülü ve NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. Blackburn için) ve NIH Eğitim Hibe T32CA165990 (M.G. Haney için) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
