Summary
السرطان هو مرض قاتل بسبب قدرته على الانبثاث إلى أعضاء مختلفة. تحديد قدرة الخلايا السرطانية على الهجرة والغزو في ظل ظروف علاجية مختلفة أمر بالغ الأهمية لتقييم الاستراتيجيات العلاجية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقييم القدرات النقيلية في الوقت الحقيقي لخط الخلايا السرطانية الورم الأرومي الدبقي.
Abstract
ينشأ السرطان بسبب الانتشار غير المنضبط للخلايا التي بدأتها عدم الاستقرار الوراثي, الطفرات, والعوامل البيئية وغيرها من عوامل الإجهاد. هذه التشوهات المكتسبة في شبكات الإشارات الجزيئية المعقدة والمتعددة الطبقات تحفز انتشار الخلايا الشاذة والبقاء على قيد الحياة ، وتدهور المصفوفة خارج الخلية ، والانبثاث إلى الأعضاء البعيدة. وتشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 90 في المائة من الوفيات المرتبطة بالسرطان ناجمة عن الآثار المباشرة أو غير المباشرة للنشر النقيلي. لذلك ، من المهم إنشاء نظام شامل وموثوق به للغاية لتوصيف سلوكيات الخلايا السرطانية على التلاعب الجيني والبيئي. مثل هذا النظام يمكن أن يعطي فهما واضحا للتنظيم الجزيئي للانبثاث السرطان وفرصة لتطوير ناجحة للاستراتيجيات العلاجية الطبقية والدقيقة. وبالتالي ، فإن التحديد الدقيق لسلوكيات الخلايا السرطانية مثل الهجرة والغزو مع كسب أو فقدان وظيفة الجينات (الجينات) يسمح بتقييم الطبيعة العدوانية للخلايا السرطانية. نظام القياس في الوقت الحقيقي على أساس مقاومة الخلايا تمكن الباحثين من الحصول على البيانات باستمرار خلال تجربة كاملة ومقارنة النتائج وقياسها على الفور في ظل ظروف تجريبية مختلفة. على عكس الطرق التقليدية، لا تتطلب هذه الطريقة التثبيت وتلطيخ ومعالجة العينة لتحليل الخلايا التي تهاجر أو تغزو. هذه الورقة الأسلوب يؤكد الإجراءات التفصيلية لتحديد في الوقت الحقيقي للهجرة وغزو الخلايا السرطانية الورم الأرومي الدبقي.
Introduction
السرطان هو مرض قاتل بسبب قدرته على الانبثاث إلى أعضاء مختلفة. تحديد الأنماط الجينية للسرطان والأنماط الظاهرية أمر بالغ الأهمية لفهم وتصميم استراتيجيات علاجية فعالة. وقد أدت عقود من أبحاث السرطان إلى تطوير وتكييف أساليب مختلفة لتحديد الأنماط الجينية للسرطان والأنماط الظاهرية. واحدة من أحدث التطورات التقنية هو قياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا والغزو على أساس مقاومة الخلايا. الالتصاق الخلية إلى ركائز وخلية الخلية الاتصالات تلعب دورا هاما في الاتصالات خلية إلى خلية، وتطوير، وصيانة الأنسجة. تؤدي التشوهات في التصاق الخلايا إلى فقدان ملامسة الخلية ، وتدهور المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، واكتساب قدرات الهجرة والغزو من قبل الخلايا ، وكلها تساهم في انتشار الخلايا السرطانية إلى أجهزة مختلفة1،2. تتوفر طرق مختلفة لتحديد هجرة الخلايا (تئام الجروح ومقالات غرفة بويدن) والغزو (ماتريغل- بويدن الحجرة)3,4,5. هذه الطرق التقليدية شبه كمية لأن الخلايا تحتاج إلى أن تكون وصفت بصبغة الفلورسنت أو الأصباغ الأخرى إما قبل أو بعد التجربة لقياس الأنماط الظاهرية للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى اضطرابات ميكانيكية في بعض الحالات لخلق جرح لقياس هجرة الخلايا إلى موقع الجرح. فضلاً عن ذلك فإن هذه الأساليب القائمة تستغرق وقتاً طويلاً، وكثيفة العمالة، وتقيس النتائج في وقت واحد فقط. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الأساليب عرضة لإجراء قياسات غير دقيقة بسبب التعامل غير المتسق أثناء الإجراء التجريبي6.
على عكس الطرق التقليدية، يقيس نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي مقاومة الخلايا في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى تلف الخلايا قبل أو ما بعد تلطيخ هاوية. والأهم من ذلك، يمكن تمديد مدة التجربة بحيث يمكن تحديد الآثار البيولوجية بطريقة تعتمد على الوقت. تنفيذ التجربة هو الوقت الفعال وليس كثيف العمالة. تحليل البيانات بسيط نسبيا ودقيق. بالمقارنة مع أساليب أخرى، وهذا الأسلوب هو واحد من أفضل القياسات في الوقت الحقيقي لقياس هجرة الخلايا والغزو6،7،8،9.9
كان جيافير وكيس أول من وصف القياس القائم على المعاوقة لخلايا السكان على سطح الأقطاب الكهربائية10. يعمل نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي على نفس المبدأ. مساحة كل بئر microplate هو ما يقرب من 80٪ مغطاة بمجموعة من الأقطاب الدقيقة الذهب. عندما تكون منطقة سطح القطب تشغلها الخلايا بسبب الالتزام أو انتشار الخلايا ، يتغير المعاوقة الكهربائية. يتم عرض هذا المعاوقة كمؤشر الخلية ، والذي يتناسب مباشرة مع الخلايا التي تغطي مساحة سطح القطب بعد أن تخترق الغشاء المسامي (متوسط حجم المسام لهذا الغشاء هو 8 ميكرومتر)11.
Crk وCrkL هي بروتينات محول تحتوي على مجالات SH2 و SH3 وتلعب أدوارًا مهمة في وظائف خلوية مختلفة ، مثل تنظيم الهيكل الخلوي ، وتحويل الخلايا ، والانتشار ، والالتصاق ، والظهارية - mesenchymal الانتقال ، والهجرة ، والغزو ، والانبثاث عن طريق التوسط بين البروتين البروتين والبروتين التفاعلات في العديد من مسارات الإشارات1،12،13،14،15،16،17، 18. لذلك ، من المهم تحديد قدرات الهجرة والغازية التي تعتمد على Crk / CrkL للخلايا السرطانية. تم إجراء تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي لتحديد القدرات المهاجرة والغازية لخلايا الورم الأرومي عند الضربة القاضية الجينية لـ Crk و CrkL.
تصف ورقة الأسلوب هذه قياسات تفصيلية للهجرة وغزو خلايا الورم الأرومي البشري بوساطة كرك وCrkL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب أن تكون جميع مواد زراعة الخلايا معقمة ويجب إجراء التجربة بأكملها في خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة.
1. الثقافة والكهربية من U-118MG خط الخلايا الأرومية الدبقية
- ثقافة خط الخلايا U-118MG في مصل البقر الجنين 5٪ (FBS) التي تحتوي على جلنسر متوسط تعديل دولبكو (DMEM) (الثقافة المتوسطة) والحفاظ على 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO2 حاضنة (ظروف الثقافة).
- استخدام 70-80٪ خلايا صحية متجانسة للتكهرب.
- لحصاد الخلايا، وغسل الخلايا المتنامية في الأطباق الثقافية مع 1x PBS وإضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA. مكان في حاضنة لمدة 30 s وإزالة التربسين-EDTA. جمع الخلايا في وسط الثقافة في أنبوب 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلية المحمولة، وخلايا الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 5 دقيقة، والتخلص من supernatant.
- قم بتعليق بيليه الخلية في وسط الثقافة وخذ 600,000 خلية لكل حالة في أنبوب ميكروكفورتي. ضبط عدد الخلايا اعتمادا على التصاميم التجريبية ومعدلات النمو.
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإضافة 800 ميكرولتر من ملالين دولبيكو المخزن ة مؤقتاً (DPBS). تدور أسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لمدة 30 s وتجاهل supernatant.
- أضف 60 ميكرولتر من العازلة R إلى بيليه الخلية وأضف siRNAs (أي siRNA غير المستهدفة، Crk siRNA، CrkL siRNA، أو كل من Crk و CrkL siRNAs) بتركيز 6 ميكرومتر إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعني. اخلطها بلطف عن طريق النقر.
- كهربية 10 ميكرولتر من الخلايا مع نظام الكهربية في 1350 V لمدة 10 مللي ثانية مع ثلاثة نبضات ونقل الخلايا الكهربائية إلى 5 مل من الوسط الثقافة. كرر الكهربية لبقية الخلايا المعدة لكل حالة.
- إكمال كل الكهربية ذات الصلة. نقل الخلايا الكهربائية إلى اثنين من الأطباق 35 ملم لكل شرط والثقافة لهم في ظل ظروف الثقافة لمدة 3 أيام.
- في اليوم الثالث، علاج جميع الخلايا الكهربائية في 0.5٪ FBS تحتوي على DMEM (متوسطة المصل منخفضة) لمدة 6 ساعة قبل قياس مقاومة الخلية الفعلية.
2. إعداد نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي ، وغزو الخلايا والهجرة (CIM) لوحات ، والخلايا الكهربائية U - 118MG للطلاء
- ضع نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي في حاضنة CO2 تحت ظروف الثقافة 5-6 ساعة قبل بدء التجربة لتثبيت النظام في ظروف الثقافة.
- بالنسبة للكمية الغزوية، لوحة 50 ميكرولتر من DMEM (متوسط عادي) تحتوي على مصفوفة خارج الخلية (ECM) هلام في 0.1 ميكروغرام/ميكرولتر في كل بئر من الغرفة العليا من لوحة CIM. لتجنب وجود أي فقاعات الهواء، واستخدام طريقة الأنابيب العكسي. إزالة على الفور 30 ميكرولتر من هلام ECM، وترك 20 ميكرولتر في البئر.
- بعد طلاء هلام ECM، والحفاظ على لوحة في الحاضنة في ظل ظروف الثقافة لمدة 4 ساعة مع غطاء على. خلال طلاء هلام ECM والتجفيف ، واتخاذ تدابير وقائية لتجنب الاتصال المباشر للأقطاب الكهربائية من الغرفة العليا من لوحات مع اليدين ، وأسطح مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، أو حاضنة CO2.
- لإعداد برنامج قياس المعاوقة، انقر نقرًا مزدوجًا على رمز البرنامج المرتبط (انظر جدول المواد)لفتح تطبيق برنامج النظام (وحدة التحكم). كل مهد لديه نافذة فردية مع علامات تبويب مختلفة لتعيين الشروط التجريبية ، والفاصل الزمني لقياس المعاوقة والمدة ، وتحليل البيانات.
- تحت علامة التبويب التخطيط، قم بتعيين آبار رباعية لكل حالة بيولوجية وتعيين قياسات مقاومة الخلية من خطوتين تحت علامة التبويب الجدول. الخطوة الأولى هي لقياس خط الأساس لمرة واحدة (اكتساح واحد مع فاصل زمني 1 دقيقة) ، والخطوة الثانية هي قياس مقاومة الخلية في المهد الفردية المعنية لتجربة فعلية. للهجرة، استخدم 145 الاجتياحات مع فاصل زمني 10 دقيقة، وللغزو، 577 الاجتياحات مع فاصل زمني 10 دقيقة، تعيين بشكل فردي) في مهد الفردية المعنية.
- ح واحد قبل بدء قياس مقاومة الخلية، إضافة 160 ميكرولتر من DMEM مع FBS 10٪ كجاذب كيميائي في آبار الغرفة السفلى من لوحة. قم بتجميع إما الغرفة العليا التي تحتوي على الآبار المغلفة بهلام ECM أو الآبار غير المصقولة مع الغرفة السفلية لقياس الغزو والهجرة، على التوالي.
- ملء الآبار في الغرفة العليا مع 50 ميكرولتر من متوسط المصل منخفضة ووضعها في مهد النظام. تحقق مما إذا كانت وحدة التحكم تعرف على جميع الآبار بالنقر فوق علامة التبويب الرسائل. إذا تم عرض الرسالة على أنها موافق، فإن اللوحة في المهد جاهزة للتجربة.
- Preincubate لوحات معبأة تماما في الحاضنة في ظل ظروف الثقافة لمدة 1 ساعة قبل القياسات في الوقت الحقيقي في وقت واحد من مهد نظام تحليل الخلية ، وهو أمر ضروري لتأقلم لوحة معبأة لظروف ثقافة الخلية.
- لحصاد الخلايا المعالجة مع انخفاض متوسط المصل، trypsinize الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1.3، وجمعها في وسط مصل منخفض، وحساب الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1.4.
- بعد العد، خلايا الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 5 دقيقة والتخلص من supernatant.
- إعادة تعليق 800،000 خلية في 800 ميكرولتر من متوسط المصل المنخفض للهجرة والغزو. بالإضافة إلى ذلك، إعادة تعليق 300،000 الخلايا في 2 مل من الثقافة المتوسطة والبذور في طبق 35 ملم لتحليل لطخة الغربية لتأكيد الضربة القاضية المنظمة من كرك وCrkL.
3. القراءة الأساسية، بذر الخلايا، وقياس مقاومة الخلية والتصور
- قياس القراءة الأساسية بالنقر فوق زر بدء المهد. وينبغي قراءة خط الأساس بعد الاحتضان المسبق لوحات لمدة 1 ساعة في مهد نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي في ظل ظروف الثقافة في حاضنة CO2 وقبل البذر الخلايا إلى الآبار المعنية في الغرفة العليا.
ملاحظة: بمجرد النقر على زر بدء المهد، ستسأل وحدة التحكم عما إذا كنت تريد حفظ الملف التجريبي. بعد حفظ الملف، يقيس محلل المهد مقاومة الخلية الأساسية كما تم تعيينها في البرنامج في البداية ويدخل وضع الإيقاف المؤقت حتى يتم النقر على زر بدء المهد مرة أخرى لقياس مقاومة الخلية في الخطوة الثانية. - إخراج كل من لوحات للهجرة والغزو من المهد بعد قياس خط الأساس والاحتفاظ بها في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- البذور 100 ميكرولتر من الخلايا (100،000 خلية) في رباعية لكل حالة بيولوجية في الغرفة العليا من لوحة CIM في الآبار المعنية كما هو مبرمج في وحدة التحكم في المهد عن طريق الأنابيب العكسي لتجنب فقاعات الهواء.
- بعد البذر، والحفاظ على لوحة تحت خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا ليستقر بالتساوي وصولا الى القاع. نقل لوحة مرة أخرى إلى المهد المعنية وانقر على زر بداية المهد لبدء قياس مقاومة الخلية كما هو مبرمج في الخطوة الثانية من 2.5.
- بعد الاجتياح الأخير، يتم الانتهاء من التجربة، ويتم حفظ النتائج تلقائيًا.
- ضمن علامة التبويب تحليل البيانات، قم بتصور التغييرات في مقاومة الخلية كفهرس للخلايا بطريقة تعتمد على الوقت أثناء أو بعد الانتهاء من التجربة. يمكن تصور كل شرط من الشروط ذات الصلة من رباعية إما بشكل فردي أو كمتوسطات و / أو الانحرافات المعيارية عن طريق النقر فوق مربعات الخيار للانحراف المتوسط والمعياري.
- لتصدير بيانات فهرس الخلية إلى ملف جدول بيانات، افتح ملف جدول بيانات فارغًا، وضع المؤشر في منتصف نافذة تحليل البيانات، وانقر بزر الماوس الأيمن. في مربع الحوار الذي يظهر، اختر خيار نسخ البيانات في تنسيق القائمة،ولصق البيانات في جدول البيانات المفتوح.
- ضبط الوقت في البيانات الخام لتمثيل وقت البدء الفعلي لقياس مقاومة الخلية. يتم تعيين وقت بدء الخطوة الثانية كصفر.
ملاحظة: وحدة التحكم لديها خيار الحصول على فهرس الخلية مع أو بدون تطبيع (أي فهرس الخلية العادية) وتصور النتائج كعرض تقديمي رسومي بطريقة تعتمد على الوقت. في هذا المثال، يتم تصدير بيانات فهرس الخلية دون تطبيع للمعالجة والعرض التقديمي الرسومي. - حرر التجربة بالنقر على زر الإصدار في كل مهد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد اقترح أن Crk وCrkL مهمة لهجرة الخلايا والغزو في مختلف خطوط الخلايا السرطانية13،17. على الرغم من أن بروتينات Crk و CrkL تشبه كل منهما بعضها البعض بشكل هيكلي ووظيفي وتلعب وظائف متداخلة أساسية16،19،20،21، العديد من دراسات الضربة القاضية للجينات لـ Crk و CrkL لم تعالج بوضوح ما إذا كان الضربة القاضية خاصة إما Crk أو CrkL أو كليهما. لذلك ، من غير الواضح أي من البروتينين يساهم في هجرة الخلايا والغزو. كدراسة إثبات المبدأ، استخدمنا siRNAs محددة لCrk أو CrkL ودرسنا آثارها على الهجرة وغزو خط الخلية U-118MG GBM. انخفاض الضربة القاضية من Crk Crk مستويات البروتين CrkII وCrkI بنسبة 85٪ و 86٪، على التوالي، دون تقليل مستوى البروتين CrkL. الضربة القاضية لـ CrkL خفضت مستوى بروتين CrkL بنسبة 85٪(الشكل 1). CrkL الضربة القاضية خفضت قليلا من مستويات CrkII وCrkI، أيضا. الاستخدام المشترك للسيرانات لCrk وCrkL خفض CrkII، CrkI، ومستويات CrkL بأكثر من 80٪(الشكل 1B). من ناحية أخرى ، لم يؤثر الضربة القاضية لـ Crk و CrkL على مستويات vinculin و α-tubulin(الشكل 1).
الخلايا U-118MG هاجر إلى مصل عالية (10٪ FBS)، لتصل إلى المستوى الأقصى للهجرة في 13 ساعة، والتي كانت بمثابة تجربة الرقابة الداخلية(الشكل 2A). مع ضربة قاضية Crk ، تأخرت هجرة الخلايا ، واستمرت الخلايا في الهجرة حتى 23 ساعة . فقدت خلايا U-118MG قدرتها على الهجرة عند الضربة القاضية لكل من Crk و CrkL(الشكل 2A)، مما يشير إلى أن Crk و CrkL يلعبان أدوارًا متداخلة أساسية في هجرة الخلايا السرطانية. ومع ذلك، لا يتضح هذا الاستنتاج بوضوح إذا تم فحص ترحيل الخلايا في نقطة زمنية محددة. عندما تمت مقارنة هجرات الخلايا في 6 أو 13 ساعة ، كانت الموانع من قبل Crk و CrkL بالضربة القاضية واضحة(الشكل 2B،C). في المقابل، لم يكن لـ Crk knockdown تأثير مثبط على هجرة الخلايا في 18 ساعة(الشكل 2D)،مما أدى إلى نتائج متضاربة اعتمادا على النقطة الزمنية المحددة للمقارنة. وكانت الآثار المثبطة لضرب ة CrkL وCrk/ CrkL ضربة قاضية مزدوجة واضحة للعيان في جميع النقاط الثلاث. وتبين هذه النتائج بوضوح أنه يجب تقييم هجرة الخلايا على مدى فترة هجرة الخلايا بأكملها لتحليل الآثار بدقة عن طريق التلاعب الجيني أو المخدرات.
غزت خلايا U-118MG المصل العالي ، لتصل إلى الحد الأقصى من الغزو في 52 ساعة ، والتي كانت بمثابة تجربة الرقابة الداخلية(الشكل 3A). مع ضربة قاضية Crk ، تأخر غزو الخلايا ، لكنه وصل إلى مستوى أقصى مماثل في 60 ساعة. مع ضربة قاضية CrkL ، أظهرت خلايا U-118MG تأخر وقل الغزو مقارنة بخلايا التحكم. ضرب مجتمعة من Crk وCrkL مزيد من تثبيط غزو الخلايا(الشكل 3A). مقارنة غزو الخلايا في 36 ساعة، عندما كانت خلايا التحكم تخضع بنشاط للغزو، أظهرت بوضوح تثبيط من قبل الضربة القاضية الفردية من كرك وCrkL وتثبيط التآزر من قبل Crk / CrkL ضربة قاضية مزدوجة(الشكل 3B). ومع ذلك ، أظهرت مقارنة غزو الخلايا في 52 أو 60 ساعة تأثيرًا مثبطًا طفيفًا أو لا تأثير ضار من قبل Crk Knockdown(الشكل 3C،D). وتؤيد هذه النتائج بوضوح الاقتراح القائل بضرورة تحليل غزو الخلايا على مدى فترة التجربة بأكملها.
هذه النتائج تثبت أن كل من Crk و CrkL التوسط هجرة الخلايا والغزو، وأن نظام تحليل الخلية في الوقت الحقيقي لديه ميزة واضحة على الأساليب التقليدية في فهم الحركية المختلفة من هجرة الخلايا والغزو و تأثيرات محددة على الأنماط الظاهرية للخلايا بطريقة تعتمد على الوقت.
الشكل 1: الضربة القاضية بوساطة siRNA لـ CrkI و CrkII و CrkL في خلايا U-118MG. (أ)تم إعداد تحللات الخلايا الإجمالية بعد 4 أيام من استخدام خلايا U-118MG بالكهرباء مع siRNA (NT) أو Crk siRNA أو CrkL siRNA أو كل من Crk و CrkL siRNAs ، وتم تحديد مستويات البروتين بواسطة تحليلات لطخة غربية كما هو موضح سابقًا1. (ب)تم قياس كثافة الإشارة في النطاقات المعنية كمياً باستخدام نظام التصوير وحسابها كنسب مئوية من NT. يتم عرض متوسط قيم SD الخاصة بهم في الرسم البياني. فينكولين وتوبولين بمثابة ضوابط داخلية. تم إجراء التحليلات الإحصائية للبيانات باستخدام اختبار t الطالب غير المقترن بذيلين للمقارنة بين المجموعتين التجريبيتين. *p < 0.05 و **p < 0.01، مقارنة بالإقليم الشمالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: آثار ضربة القلب Crk/CrkL على هجرة الخلايا U-118MG: (A)بعد ثلاثة أيام من خلايا U-118MG تم تقييمها بالكهرباء مع siRNA التحكم غير الاستهداف (NT)، Crk siRNA، Crk siRNA، أو كل من كرك وCrkL siRNAs، تم حصاد الخلايا وتم فحص هجرة الخلايا باستخدام نظام التحليل في الوقت الحقيقي. تم منع هجرة خلايا U-118MG مع ضربة قاضية واحدة من Crk أو CrkL بطريقة تعتمد على الوقت. الضربة القاضية لكل من Crk و CrkL منعت تماما هجرة الخلايا. يتم تقديم قيم فهرس الخلية عند 6(B)و 13(C)و 18 ساعة(D)لمقارنة ترحيل الخلايا في نقاط زمنية مختلفة (أسهم). في 13 ساعة وصلت خلايا التحكم (NT) إلى الترحيل الأقصى. في 18 ساعة كل من السيطرة وخلايا الضربة القاضية Crk أظهرت مستويات مماثلة من هجرة الخلايا. تم إجراء التحليلات الإحصائية للبيانات باستخدام اختبار t الطالب غير المقترن بذيلين للمقارنة بين المجموعتين التجريبيتين. ** ع < 0.01، مقارنة NT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: آثار ضربة قاضية Crk/CrkL على غزو الخلايا U-118MG: (A)بعد ثلاثة أيام من تم كهربية خلايا U-118MG مع siRNA التحكم غير الاستهداف (NT)، Crk siRNA، Crk siRNA، أو كل من كرك وCrkL siRNAs، تم حصاد الخلايا وفحص غزو الخلايا لمدة 4 أيام باستخدام نظام التحليل في الوقت الحقيقي. تم منع غزو خلايا U-118MG مع ضربة قاضية واحدة من Crk أو CrkL بطريقة تعتمد على الوقت. الضربة القاضية لكل من Crk و CrkL في خط الخلية U-118MG خفضت قدرتها الغازية تصل إلى 48 ساعة مقارنة مع NT. قيم مؤشر الخلية في 36(B)، 52(C)، و 60 ح(D)يتم تقديمها لمقارنة غزو الخلايا في نقاط زمنية مختلفة (الأسهم). في 52 ساعة، وصلت خلايا التحكم (NT) إلى الذروة الأولية للغزو. في 60 ساعة، وصلت خلايا ضربة قاضية Crk إلى الذروة الأولية للغزو. تم إجراء التحليلات الإحصائية للبيانات باستخدام اختبار t الطالب غير المقترن بذيلين للمقارنة بين المجموعتين التجريبيتين. *p < 0.05 و **p < 0.01، مقارنة بالإقليم الشمالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القياس في الوقت الحقيقي من هجرة الخلايا والغزو باستخدام نظام تحليل الخلية في الوقت الحقيقي هو عملية مراقبة بسيطة وسريعة ومستمرة مع مزايا متعددة وهامة على الأساليب التقليدية التي توفر البيانات في نقطة زمنية واحدة. كما هو الحال مع الأساليب التقليدية ، يجب تحسين الشروط التجريبية لكل خط خلية لنظام تحليل الخلية في الوقت الحقيقي ، لأن كل خط خلية قد يكون مختلفًا من حيث التصاقه بالركيزة والنمو وجهات الاتصال من خلية إلى خلية ، والمهاجرة و قدرات الغازية. بسبب هذه الاختلافات، قد يظهر كل خط خلية حركية خلوية مختلفة ومقاومة للخلايا. تتأثر المعاوقة بشكل كبير بعدد الخلايا المزروعة في البئر ، ووقت التصاق الخلايا ، ووقت التأخر قبل أن تبدأ الخلايا في الهجرة أو الغزو ، وتركيز هلام ECM على لوحات CIM. أولا ، في الوقت الحقيقي تحليل الخلية يجعل التحسين أسهل لأنه يوفر نتائج في الوقت الحقيقي على مدى فترة زمنية محددة ، وتمكين الباحثين لتحديد نقطة الوقت عندما تظهر خلايا التحكم نشطة الهجرة والغزو الخلايا وعندما السيطرة الخلايا تصل إلى أقصى مستويات الهجرة والغزو. ثانياً، قد تحتاج الدراسات المفرطة للجين خارج الرحم أو الجين إلى تحسينات إضافية، لأن الخلايا تحتاج إلى اعتماد الأنماط الظاهرية من التغيرات الغيرمتجانسة المعدلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد تركيزات العقاقير الفعالة وفعالية العقاقير بالاقتران مع الظروف الوراثية العادية أو المعدلة باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي.
وقد استخدمت الطرق التقليدية مثل التئام الجروح، أجار لينة، والهجرة غرفة بويدن، أو مقالات الغزو لتحديد أن الضربة القاضية إما Crk أو CrkL يؤدي إلى انخفاض الهجرة والغزو في خطوط الخلايا السرطانية المختلفة13،17. في هذه الدراسة، قمنا بإنزال واحد أو مزدوج من كرك وCrkL في خط الخلايا U-118MG والتحقيق في هجرة الخلايا والغزو. في الوقت الحقيقي قياس مقاومة الخلية على التجربة بأكملها قدمت معلومات متعمقة حول حركية هجرة الخلايا والغزو، مما يسمح لنا لتحديد اثنين من وسائط مختلفة من تثبيط. في حين أن ضربة لك تأخر الهجرة والغزو ، فإن ضربة CrkL منعت الهجرة والغزو على مدى الفترة الزمنية بأكملها. وعلاوة على ذلك، فإن الضربة القاضية المزدوجة لكل من كرك وكركل منعت تماما هجرة الخلايا وأعاقت إلى حد كبير غزو الخلايا.
توفر هذه الدراسة دليلا على المفهوم الذي يجمع بين نهج الضربة القاضية المنهجي للحث على ضربة قاضية واحدة ومزدوجة من Crk و CrkL مع تحليلات في الوقت الحقيقي لهجرة الخلايا والغزو على مدى فترة كاملة من التجارب أمر ضروري ل تحليلات شاملة لوظائف Crk- وCrkL بوساطة في الخلايا السرطانية. البيانات المعروضة في هذه الدراسة تشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لاختبار الأدوية المرشحة لآثارها المثبطة على Crk وCrkL. بشكل عام ، فإن نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي مفيد في إعداد تجارب لهجرة الخلايا أو غزو الخلايا ويجعل في الوقت الحقيقي ، ومتعمقة ، وتحليلات شاملة ممكنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر أوليفيا فونك على مساعدتها التقنية في بيانات نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي. كما نشكر مركز الكتابة الطبية في مدينة ميرسي كانساس سيتي للأطفال على تحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل توم كيفيني الموهوب صندوق لأبحاث سرطان الأطفال (إلى TP) ومستشفى الأطفال الرحمة الغرب الأوسط السرطان تحالف شريك المجلس الاستشاري (إلى TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
