Summary
Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung der Fähigkeit von Krebszellen, unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu wandern und einzudringen, ist entscheidend für die Beurteilung therapeutischer Strategien. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der metastasierenden Fähigkeiten einer Glioblastom-Krebszelllinie in Echtzeit dar.
Abstract
Krebs entsteht durch unkontrollierte Proliferation von Zellen, die durch genetische Instabilität, Mutationen sowie Umwelt- und andere Stressfaktoren ausgelöst werden. Diese erworbenen Anomalien in komplexen, mehrschichtigen molekularen Signalnetzwerken induzieren aberrante Zellproliferation und Überleben, extrazellulären Matrixabbau und Metastasierung enferner Organe. Schätzungen zufolge werden etwa 90 % der krebsbedingten Todesfälle durch die direkten oder indirekten Auswirkungen der metastasierenden Verbreitung verursacht. Daher ist es wichtig, ein hochzuverlässiges, umfassendes System zur Charakterisierung des Verhaltens von Krebszellen bei genetischen und Umweltmanipulationen zu etablieren. Ein solches System kann ein klares Verständnis der molekularen Regulation von Krebsmetastasen und die Möglichkeit für eine erfolgreiche Entwicklung geschichteter, präziser therapeutischer Strategien vermitteln. Daher ermöglicht eine genaue Bestimmung von Krebszellverhalten wie Migration und Invasion mit Gewinn oder Verlust der Funktion der Gene(n) die Beurteilung der aggressiven Natur von Krebszellen. Das auf Derimpedanz basierende Echtzeit-Messsystem ermöglicht es Forschern, während eines ganzen Experiments kontinuierlich Daten zu erfassen und die Ergebnisse unter verschiedenen experimentellen Bedingungen sofort zu vergleichen und zu quantifizieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden erfordert diese Methode keine Fixierung, Färbung und Probenverarbeitung, um Zellen zu analysieren, die migrieren oder eindringen. Dieses Methodenpapier legt den Schwerpunkt auf detaillierte Verfahren zur Echtzeitbestimmung der Migration und Invasion von Glioblastom-Krebszellen.
Introduction
Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung von Krebsgenotypen und Phänotypen ist entscheidend für das Verständnis und die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien. Jahrzehnte der Krebsforschung haben zur Entwicklung und Anpassung verschiedener Methoden zur Bestimmung von Krebsgenotypen und Phänotypen geführt. Eine der neuesten technischen Entwicklungen ist die Echtzeitmessung der Zellmigration und -invasion auf der Grundlage der Zellimpedanz. Die Zellhaftung an Substraten und Zell-Zell-Kontakten spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-zu-Zell-Kommunikation und -Regulierung, Entwicklung und Pflege von Geweben. Anomalien in der Zelladhäsion führen zum Verlust des Zell-Zell-Kontakts, zum Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) und zur Verstärkung von Migrations- und Invasionsfähigkeiten durch Zellen, die alle zur Metastasierung von Krebszellen in verschiedene Organe beitragen1,2. Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung, um die Zellmigration (Wundheilung und Boyden-Kammer-Assays) und Invasion (Matrigel-Boyden Chamber Assay)3,4,5zu bestimmen. Diese konventionellen Methoden sind semiquantitativ, da Zellen vor oder nach dem Experiment mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder anderen Farbstoffen gekennzeichnet werden müssen, um Zellphänotypen zu messen. Darüber hinaus sind in einigen Fällen mechanische Störungen erforderlich, um eine Wunde zur Messung der Migration von Zellen an die Wundstelle zu bilden. Darüber hinaus sind diese bestehenden Methoden zeitaufwändig, arbeitsintensiv und messen die Ergebnisse nur zu einem Zeitpunkt. Darüber hinaus sind diese Methoden anfällig für ungenaue Messungen aufgrund inkonsistenter Handhabung während des experimentellen Verfahrens6.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden misst das Echtzeit-Zellanalysesystem die Zellimpedanz in Echtzeit, ohne dass eine Vor- oder Nachfärbung und mechanische Beschädigung von Zellen erforderlich ist. Noch wichtiger ist, dass die Dauer eines Experiments verlängert werden kann, so dass biologische Effekte zeitabhängig bestimmt werden können. Die Durchführung des Experiments ist zeiteffizient und nicht arbeitsintensiv. Die Analyse von Daten ist relativ einfach und genau. Im Vergleich zu anderen Methoden ist diese Methode eine der besten Echtzeitmessungen zur Messung der Zellmigration und Invasion6,7,8,9.
Giaever und Keese waren die ersten, die die Impedanz-basierte Messung einer Zellpopulation auf der Oberfläche von Elektroden10 beschrieben. Das Echtzeit-Zellanalysesystem arbeitet nach dem gleichen Prinzip. Die Fläche jedes Mikroplattenbrunnens ist zu ca. 80% mit einer Reihe von Goldmikroelektroden bedeckt. Wenn die Elektrodenoberfläche aufgrund der Haftung oder Desasion der Zellen von Zellen belegt wird, ändert sich die elektrische Impedanz. Diese Impedanz wird als Zellindex angezeigt, der direkt proportional zu den Zellen ist, die die Elektrodenoberfläche abdecken, nachdem sie die mikroporöse Membran durchdrungen haben (die mittlere Porengröße dieser Membran beträgt 8 m)11.
Crk und CrkL sind Adapterproteine, die SH2- und SH3-Domänen enthalten und spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Funktionen, wie Zytoskelettregulation, Zelltransformation, Proliferation, Adhäsion, epithelialer-mesenchymaler Übergang, Migration, Invasion und Metastasierung durch Vermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vielen Signalwegen1,12,13,14,15,16,17, 18. Daher ist es wichtig, die Crk/CrkL-abhängigen Migrations- und invasiven Fähigkeiten von Krebszellen zu bestimmen. Die Echtzeit-Zellanalyse wurde durchgeführt, um die migrations- und invasiven Fähigkeiten von Glioblastomzellen nach dem Gen-Knockdown von Crk und CrkL zu bestimmen.
Dieses Methodenpapier beschreibt detaillierte Messungen der crk- und CrkL-vermittelten Migration und Invasion menschlicher Glioblastomzellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Alle Zellkulturmaterialien müssen steril sein und das gesamte Experiment muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
1. Kultur und Elektroporation der U-118MG Glioblastom-Zelllinie
- Kultur die U-118MG-Zelllinie in 5% fetalem Rinderserum (FBS), das Dulbeccoes Modified Eagle Medium (DMEM) (Kulturmedium)2 enthält, und Bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre halten, die 5% CO2-Inkubator (Kulturbedingungen) enthält.
- Verwenden Sie 70– 80% konfluente gesunde Zellen für die Elektroporation.
- Für die Ernte von Zellen, waschen Sie die Zellen, die in Kulturgerichten mit 1x PBS wachsen, und fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzu. Legen Sie in den Inkubator für 30 s und entfernen Sie die Trypsin-EDTA. Sammeln Sie Zellen im Kulturmedium in einem 15 ml Rohr.
- Zählen Sie die Zellen mit einem handgeführten automatisierten Zellzähler, Zentrifugenzellen bei 100 x g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium aus und nehmen Sie 600.000 Zellen für jede Bedingung in ein Mikrozentrifugenrohr. Passen Sie die Zellenzahl in Abhängigkeit von experimentellen Designs und Wachstumsraten an.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie 800 L der Phosphat-gepufferten Saline (DPBS) von Dulbecco hinzu. Drehen Sie mit einer Minizentrifuge für 30 s nach unten und entsorgen Sie den Überstand.
- Fügen Sie dem Zellpellet 60 l Resuspensionspuffer R hinzu und fügen Sie die siRNAs (d. h. nicht zielgerichtete siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA oder crk und CrkL siRNAs) mit einer Konzentration von 6 M in das jeweilige Mikrozentrifugenrohr ein. Mischen Sie sie sanft durch Tippen.
- Elektropoat 10 l Zellen mit einem Elektroporationssystem bei 1.350 V für 10 ms mit drei Impulsen und übertragen die elektropoierten Zellen in 5 ml des Kulturmediums. Wiederholen Sie die Elektroporation für die restlichen Zellen, die für jede Bedingung vorbereitet sind.
- Vervollständigen Sie alle entsprechenden Elektroporationen. Übertragen Sie elektropoierte Zellen in zwei 35 mm Gerichte pro Zustand und kulturkultural für 3 Tage.
- Behandeln Sie am dritten Tag alle elektropoierten Zellen in 0,5% FBS, die DMEM (niedriges Serummedium) enthalten, 6 h vor der eigentlichen Messung der Zellimpedanz.
2. Vorbereitung des Echtzeit-Zellanalysesystems, Zellinvasions- und -migrationsplatten (CIM) und elektropoierter U-118MG-Zellen zur Beschichtung
- Platzieren Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem2 in einem CO2-Inkubator unter Kulturbedingungen 5–6 h vor Dem Beginn des Experiments, um das System an die Kulturbedingungen zu stabilisieren.
- Für den Invasionstest die Platte 50 l DMEM (einfaches Medium) mit extrazellulärem Matrix-Gel (ECM) bei 0,1 g/l in jeder Bohrung der oberen Kammer der CIM-Platte. Um Luftblasen zu vermeiden, verwenden Sie die Reverse Pipetting-Methode. Entfernen Sie sofort 30 l ECM-Gel, so dass 20 l im Brunnen bleiben.
- Nach der ECM-Gelbeschichtung die Platte im Inkubator unter Kulturbedingungen für 4 h mit eingeschaltetem Deckel aufbewahren. Während der ECM-Gelbeschichtung und -trocknung vorbeugende Maßnahmen ergreifen, um einen direkten Kontakt der Elektroden der oberen Kammer2 der Platten mit den Händen, den Oberflächen des Biosicherheitsschranks oder des CO2-Inkubators zu vermeiden.
- Um das Impedanzmessprogramm einzurichten, doppelklicken Sie auf das zugehörige Softwaresymbol (siehe Tabelle der Materialien), um die Systemsoftwareanwendung (Steuereinheit) zu öffnen. Jede Wiege verfügt über ein individuelles Fenster mit unterschiedlichen Registerkarten, um die experimentellen Bedingungen, das Impedanzmessintervall und die Dauer sowie die Datenanalyse festzulegen.
- Legen Sie unter der Registerkarte Layout Quadruplicate-Bohrungen für jeden biologischen Zustand fest, und legen Sie zweistufige Zellimpedanzmessungen unter der Registerkarte Zeitplan fest. Der erste Schritt ist eine einmalige Basismessung (ein Sweep mit einem Intervall von 1 min), und der zweite Schritt besteht darin, die Zellimpedanz in den jeweiligen einzelnen Wiegen für ein tatsächliches Experiment zu messen. Für die Migration verwenden Sie 145 Sweeps mit einem Intervall von 10 min, und für die Invasion 577 Sweeps mit einem 10 min Intervall, einzeln eingestellt) in den jeweiligen einzelnen Wiegen.
- Ein h vor Beginn der Zellimpedanzmessung fügen Sie 160 l DMEM mit 10% FBS als Chemoattraktion in den Brunnen der unteren Kammer der Platte hinzu. Montieren Sie entweder die obere Kammer mit den ECM-Gel-beschichteten Brunnen oder unbeschichtete Brunnen mit der unteren Kammer, um Invasion bzw. Migration zu messen.
- Füllen Sie die Brunnen in der oberen Kammer mit 50 l niedrigem Serummedium und legen Sie sie in die Wiege des Systems. Überprüfen Sie, ob alle Brunnen von der Steuereinheit erkannt werden, indem Sie auf die Registerkarte Nachricht klicken. Wenn die Meldung als OKangezeigt wird, ist die Platte in der Wiege für das Experiment bereit.
- Die vollständig verpackten Platten im Inkubator unter Kulturbedingungen vor Messungen in der In-Time-Zellanalyse-System-Wiege voranlegen, was für die Akklimatisierung einer verpackten Platte an die Zellkulturbedingungen unerlässlich ist.
- Für die Ernte von Zellen, die mit niedrigem Serummedium behandelt werden, versuchen Sie die Zellen wie in Schritt 1.3, sammeln Sie sie in niedrigem Serummedium und zählen Sie die Zellen wie in Schritt 1.4.
- Zentrifugenzellen nach dem Zählen 5 min bei 100 x g und den Überstand entsorgen.
- Setzen Sie 800.000 Zellen in 800 L niedrigem Serummedium für die Migrations- und Invasionstests aus. Zusätzlich, resuspend 300,000 Zellen in 2 ml Kulturmedium und Samen in einer 35 mm Schale für Western Blot Analyse, um die regulierte Knockdown von Crk und CrkL zu bestätigen.
3. Baseline-Lesung, Seeding der Zellen und Zellimpedanzmessung und -visualisierung
- Messen Sie den Basiswert, indem Sie auf die Schaltfläche "Start in der Wiege" klicken. Die Grundlinie sollte nach der Vorinkubation der Platten für 1 h in der Wiege des Echtzeit-Zellanalysesystems unter Kulturbedingungen im CO2-Inkubator und vor dem Aussaat der Zellen an die jeweiligen Brunnen in der oberen Kammer gelesen werden.
HINWEIS: Sobald auf die Schaltfläche "Start" der Wiege geklickt wurde, fragt das Steuergerät, ob die experimentelle Datei gespeichert werden soll. Nachdem die Datei gespeichert wurde, misst der Wiegeanalysator die im Programm festgelegte Grundwertzellenimpedanz und wechselt in den Pausenmodus, bis im zweiten Schritt erneut auf die Schaltfläche "Start" der Wiege geklickt wird, um die Zellimpedanz zu messen. - Nehmen Sie beide Platten für Migration und Invasion aus den Wiegen nach der Basismessung heraus und halten Sie sie im Biosicherheitsschrank.
- Samen 100 l Zellen (100.000 Zellen) in Quadruplizierten für jeden biologischen Zustand in der oberen Kammer der CIM-Platte in den jeweiligen Brunnen, wie in der Steuereinheit der Wiege durch umgekehrte Pipettierung programmiert, um Luftblasen zu vermeiden.
- Nach der Aussaat die Platte 30 min bei Raumtemperatur unter einem Biosicherheitsschrank aufbewahren, damit sich die Zellen gleichmäßig nach unten absetzen können. Übertragen Sie die Platte zurück auf die jeweilige Wiege und klicken Sie auf die Wiegestarttaste, um die im zweiten Schritt 2.5 programmierte Messzellenimpedanz wie programmiert zu starten.
- Nach dem letzten Sweep ist das Experiment abgeschlossen, und die Ergebnisse werden automatisch gespeichert.
- Visualisieren Sie auf der Registerkarte Datenanalyse die Änderungen der Zellimpedanz als Zellindex zeitabhängig während oder nach Abschluss des Experiments. Jede der jeweiligen Bedingungen von Quadruplizierten kann entweder einzeln oder als Mittelwerte und/oder Standardabweichungen visualisiert werden, indem Sie auf die Optionsfelder für Durchschnitts- und Standardabweichungen klicken.
- Um Zellindexdaten in eine Tabellenkalkulationsdatei zu exportieren, öffnen Sie eine leere Tabellenkalkulationsdatei, platzieren Sie den Cursor in der Mitte des Fensters Datenanalyse, und klicken Sie mit der rechten Maustaste. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld die Option Daten in listenformat kopierenaus, und fügen Sie die Daten in die geöffnete Kalkulationstabelle ein.
- Passen Sie die Zeit in den Rohdaten an, um die tatsächliche Startzeit der Zellenimpedanzmessung darzustellen. Die Startzeit im zweiten Schritt wird als Null festgelegt.
HINWEIS: Das Steuergerät hat die Möglichkeit, den Zellindex mit oder ohne Normalisierung (d. h. normalisierter Zellindex) zu erhalten und die Ergebnisse zeitabhängig als grafische Darstellung zu visualisieren. In diesem Beispiel werden Zellindexdaten ohne Normalisierung für die Verarbeitung und grafische Darstellung exportiert. - Lösen Sie das Experiment, indem Sie in jeder Wiege auf die Schaltfläche "Freigeben" klicken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Es wurde vorgeschlagen, dass Crk und CrkL sind wichtig für die Zellmigration und Invasion in verschiedenen Krebszelllinien13,17. Obwohl Crk- und CrkL-Proteine strukturell und funktional einander ähnlich sind und wesentliche überlappende Funktionen16,19,20,21spielen, haben viele Gen-Knockdown-Studien für Crk und CrkL nicht klar angesprochen, ob der Knockdown spezifisch für Crk, CrkL oder beides ist. Daher ist unklar, welches der beiden Proteine zur Zellmigration und Invasion beiträgt. Als Proof-of-Principle-Studie verwendeten wir siRNAs spezifisch für Crk oder CrkL und untersuchten deren Auswirkungen auf migration und Invasion der U-118MG GBM-Zelllinie. Der Knockdown von Crk verringerte den CrkII- und CrkI-Proteinspiegel um 85 % bzw. 86 %, ohne den CrkL-Proteinspiegel zu senken. Der Knockdown von CrkL reduzierte den CrkL-Proteinspiegel um 85 %(Abbildung 1). CrkL Knockdown reduzierte auch die CrkII- und CrkI-Werte leicht. Die kombinierte Verwendung von siRNAs für Crk und CrkL reduzierte die CrkII-, CrkI- und CrkL-Spiegel um mehr als 80 %(Abbildung 1B). Auf der anderen Seite hatte der Knockdown von Crk und CrkL keinen Einfluss auf die Vinkulin- und Tubulinspiegel (Abbildung 1).
Die U-118MG-Zellen migrierten in ein hohes Serum (10% FBS) und erreichten das maximale Migrationsniveau bei 13 h, das als interne Kontrolle des Experiments diente (Abbildung 2A). Mit Crk Knockdown verzögerte sich die Zellmigration, und die Zellen wanderten weiter bis 23 h. CrkL-Knockdown hemmte die Zellmigration erheblich. U-118MG-Zellen verloren ihre Migrationsfähigkeit, wenn crk und CrkL(Abbildung 2A)abgeschlagen wurden, was darauf hindeutet, dass Crk und CrkL wesentliche überlappende Rollen bei der Migration von Krebszellen spielen. Diese Schlussfolgerung ist jedoch nicht eindeutig, wenn die Zellmigration zu einem festen Zeitpunkt untersucht wird. Wenn Zellmigrationen bei 6 oder 13 h verglichen wurden, waren Hemmungen durch Crk und CrkL Knockdowns offensichtlich (Abbildung 2B,C). Im Gegensatz dazu hatte Crk Knockdown keine hemmende Wirkung auf die Zellmigration bei 18 h (Abbildung 2D), was zu widersprüchlichen Ergebnissen in Abhängigkeit vom für den Vergleich ausgewählten Zeitpunkt führte. Die hemmenden Effekte von CrkL Knockdown und Crk/CrkL Double Knockdown waren an allen drei Zeitpunkten deutlich sichtbar. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Zellmigration über den gesamten Zeitraum der Zellmigration bewertet werden muss, um Effekte durch genetische Manipulationen oder Medikamente genau zu analysieren.
Die U-118MG-Zellen drangen in hohes Serum ein und erreichten den maximalen Invasionsgrad bei 52 h, der als interne Kontrolle des Experiments diente (Abbildung 3A). Mit Crk Knockdown verzögerte sich die Zellinvasion, erreichte aber ein ähnliches Höchstniveau bei 60 h. Mit CrkL Knockdown zeigten U-118MG-Zellen eine verzögerte und reduzierte Invasion im Vergleich zu den Kontrollzellen. Kombinierter Knockdown von Crk und CrkL hemmte die Zellinvasion weiter (Abbildung 3A). Vergleich der Zellinvasion bei 36 h, als die Kontrollzellen aktiv invasionsfest waren, zeigte deutlich Hemmung durch individuellen Knockdown von Crk und CrkL und eine synergistische Hemmung durch Crk/CrkL Doppelknockdown (Abbildung 3B). Ein Vergleich der Zellinvasion bei 52 oder 60 h zeigte jedoch eine leichte oder keine hemmende Wirkung durch Crk Knockdown (Abbildung 3C,D). Diese Ergebnisse unterstützen eindeutig den Vorschlag, dass die Zellinvasion während des gesamten Zeitraums des Experiments analysiert werden sollte.
Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Crk als auch CrkL die Zellmigration und -invasion vermitteln und dass das Echtzeit-Zellanalysesystem einen klaren Vorteil gegenüber den traditionellen Methoden hat, die unterschiedliche Kinetik der Zellmigration und -invasion und die spezifische Auswirkungen auf Zellphänotypen in zeitabhängiger Weise.
Abbildung 1: siRNA-vermittelter Knockdown von CrkI, CrkII und CrkL in U-118MG-Zellen. (A) Alle Zelllysate wurden 4 Tage nach der Elektropolung von U-118MG-Zellen mit nicht zielgerichteter Kontrolle siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA oder crk und CrkL siRNAs hergestellt, und der Proteingehalt wurde durch Western Blot-Analysen bestimmt, wie zuvorbeschrieben 1. (B) Die Signalintensitäten der jeweiligen Bänder wurden mit Hilfe des Bildgebungssystems quantifiziert und als Nt-Prozentsätze berechnet. Ihre mittleren SD-Werte werden im Diagramm angezeigt. Vinculin und a-Tubulin dienten als interne Kontrollen. Statistische Auswertungen der Daten wurden mit dem t-Test des ungepaarten zweischwanzigen Schülers zum Vergleich zwischen den beiden experimentellen Gruppen durchgeführt. *p < 0.05 und **p < 0.01, im Vergleich zu NT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswirkungen von Crk/CrkL-Knockdown auf die U-118MG-Zellmigration: (A) Drei Tage nach der Elektroporating von U-118MG-Zellen mit nicht zielgerichteter Steuerung siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA oder crkund- und CrkL-SiRNAs wurden Zellen geerntet und die Zellmigration mit dem Echtzeitanalysesystem untersucht. Die Migration von U-118MG-Zellen wurde zeitabhängig durch einen einzigen Knockdown von Crk oder CrkL gehemmt. Der Knockdown von Crk und CrkL blockierte die Zellmigration vollständig. Zellindexwerte bei 6 (B), 13 (C) und 18 h (D) werden dargestellt, um die Zellmigration zu verschiedenen Zeitpunkten (Pfeile) zu vergleichen. Bei 13 h erreichten die Kontrollzellen (NT) die maximale Migration. Bei 18 h zeigten sowohl Kontroll- als auch Crk-Knockdown-Zellen ähnliche Ebenen der Zellmigration. Statistische Auswertungen der Daten wurden mit dem t-Test des ungepaarten zweischwanzigen Schülers zum Vergleich zwischen den beiden experimentellen Gruppen durchgeführt. **p < 0.01, im Vergleich zu NT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auswirkungen von Crk/CrkL-Knockdown auf die U-118MG-Zellinvasion: (A) Drei Tage nachdem U-118MG-Zellen mit nicht zielgerichteter Kontrolle siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA oder crkund siRNAs, wurden Zellen geerntet und die Zellinvasion 4 Tage lang mit dem Echtzeitanalysesystem untersucht. Die Invasion von U-118MG-Zellen wurde zeitabhängig durch einen einzigen Knockdown von Crk oder CrkL gehemmt. Der Knockdown von Crk und CrkL in der U-118MG-Zelllinie reduzierte seine invasive Kapazität auf bis zu 48 h im Vergleich zu NT. Zellindexwerte bei 36 (B), 52 (C) und 60 h (D) werden vorgestellt, um die Zellinvasion zu verschiedenen Zeitpunkten (Pfeile) zu vergleichen. Mit 52 h erreichten die Kontrollzellen (NT) den ersten Höhepunkt der Invasion. Um 60 Uhr erreichten crk knockdown Zellen den ersten Höhepunkt der Invasion. Statistische Auswertungen der Daten wurden mit dem t-Test des ungepaarten zweischwanzigen Schülers zum Vergleich zwischen den beiden experimentellen Gruppen durchgeführt. *p < 0.05 und **p < 0.01, im Vergleich zu NT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Echtzeitmessung der Zellmigration und -invasion mit hilfe des Echtzeit-Zellanalysesystems ist ein einfacher, schneller und kontinuierlicher Überwachungsprozess mit mehreren, signifikanten Vorteilen gegenüber den herkömmlichen Methoden, die Daten zu einem einzigen Zeitpunkt bereitstellen. Wie bei den herkömmlichen Methoden müssen die experimentellen Bedingungen für jede Zelllinie für das Echtzeit-Zellanalysesystem optimiert werden, da jede Zelllinie hinsichtlich ihrer Haftung auf dem Substrat, dem Wachstum, den Zell-zu-Zell-Kontakten sowie der Migration und invasive Fähigkeiten. Aufgrund dieser Unterschiede kann jede Zelllinie unterschiedliche zelluläre Kinetik und Zellimpedanzen aufweisen. Die Impedanz wird stark beeinflusst durch die Anzahl der Zellen, die in einem Brunnen gesät werden, die Zeit für die Zelladhäsion, die Verzögerungszeit, bevor Zellen zu wandern oder einzudringen, und die Konzentration von ECM-Gel auf CIM-Platten. Erstens erleichtert die Echtzeit-Zellanalyse die Optimierung, da sie Ergebnisse in Echtzeit über einen bestimmten Zeitraum liefert, sodass die Forscher den Zeitpunkt identifizieren können, zu dem die Kontrollzellen aktive Zellmigration und -invasion anzeigen und wann die Kontrolle Zellen erreichen die maximalen Migrations- und Invasionsniveaus. Zweitens können ektopische Genüberexpression oder Gen-Knockdown-Studien zusätzliche Optimierungen benötigen, da die Zellen die Phänotypen aus den modifizierten genotypischen Veränderungen übernehmen müssen. Darüber hinaus können wirksame Arzneimittelkonzentrationen und die Wirksamkeit von Medikamenten in Kombination mit normalen oder modifizierten genetischen Bedingungen mit dem Echtzeit-Zellanalysesystem bestimmt werden.
Traditionelle Methoden wie Wundheilung, weicher Agar, Boyden-Kammermigration oder Invasions-Assays wurden verwendet, um zu bestimmen, dass der Knockdown von Crk oder CrkL zu einer reduzierten Migration und Invasion in verschiedenen Krebszelllinien führt13,17. In dieser Studie induzierten wir single oder double knockdown von Crk und CrkL in der U-118MG Zelllinie und untersuchten Zellmigration und Invasion. Die Echtzeitmessung von Zellimpedanzen während des gesamten Experiments lieferte detaillierte Informationen über die Kinetik der Zellmigration und -invasion, so dass wir zwei verschiedene Hemmungsmodi identifizieren konnten. Während Crk Knockdown Migration und Invasion verzögerte, hemmte CrkL Knockdown Migration und Invasion über den gesamten Zeitraum. Darüber hinaus blockierte der doppelseitige Knockdown von Crk und CrkL die Zellmigration vollständig und hemmte die Zellinvasion erheblich.
Diese Studie liefert einen Proof-of-Concept, dass die Kombination des systematischen Knockdown-Ansatzes, um Single- und Double-Knockdown von Crk und CrkL mit Echtzeit-Analysen der Zellmigration und -invasion über den gesamten Zeitraum der Experimente zu induzieren, für die umfassende Analysen von Crk- und CrkL-vermittelten Funktionen in Krebszellen. Die in dieser Studie vorgestellten Daten deuten darauf hin, dass diese Methode auch verwendet werden kann, um Kandidatenmedikamente auf ihre hemmende Wirkung auf Crk und CrkL zu testen. Insgesamt ist das Echtzeit-Zellanalysesystem nützlich bei der Einrichtung von Experimenten für Zellmigration oder Zellinvasion und macht Echtzeit-, tiefgehende und umfassende Analysen möglich.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Olivia Funk für ihre technische Unterstützung bei den Echtzeit-Zellanalysesystemdaten. Wir danken auch dem Medical Writing Center bei Children es Mercy Kansas City für die Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde von Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) und von Children es Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (to TP) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
