Summary
Рак является смертельным заболеванием из-за его способности метастазировать в различные органы. Определение способности раковых клеток мигрировать и вторгаться в различных условиях лечения имеет решающее значение для оценки терапевтических стратегий. Этот протокол представляет метод оценки метастатических способностей в реальном времени линии раковых клеток глиобластомы.
Abstract
Рак возникает из-за неконтролируемого распространения клеток, инициированных генетической нестабильностью, мутациями, а также экологическими и другими факторами стресса. Эти приобретенные аномалии в сложных, многослойных молекулярных сигнальных сетях вызывают аномальное пролиферацию и выживание клеток, внеклеточную деградацию матрицы и метастазирование в отдаленные органы. Приблизительно 90% случаев смерти, связанных с раком, по оценкам, вызваны прямыми или косвенными последствиями метастатического распространения. Поэтому важно создать высоконадежную, всеобъемлющую систему для характеристики поведения раковых клеток при генетических и экологических манипуляциях. Такая система может дать четкое представление о молекулярной регуляции метастазах рака и возможности для успешного развития стратифицированных, точных терапевтических стратегий. Таким образом, точное определение поведения раковых клеток, таких как миграция и вторжение с увеличением или потерей функции генов (ы) позволяет оценить агрессивный характер раковых клеток. Система измерений в реальном времени, основанная на клеточной импедании, позволяет исследователям постоянно получать данные в ходе всего эксперимента и мгновенно сравнивать и количественно оценивать результаты в различных экспериментальных условиях. В отличие от обычных методов, этот метод не требует фиксации, окрашивания и обработки образцов для анализа клеток, которые мигрируют или вторгаются. В этом методическом документе особое внимание уделяется подробным процедурам определения миграции и вторжения раковых клеток глиобластомы в режиме реального времени.
Introduction
Рак является смертельным заболеванием из-за его способности метастазировать в различные органы. Определение генотипов и фенотипов рака имеет решающее значение для понимания и разработки эффективных терапевтических стратегий. Десятилетия исследований рака привели к разработке и адаптации различных методов определения генотипов и фенотипов рака. Одним из последних технических разработок является измерение миграции и вторжения в реальном времени на основе клеточного импеданса. Сливки клеток к субстратам и контактам клеток играют важную роль в связи и регуляции, развитии и поддержании тканей. Аномалии в клеточной адгезии приводят к потере клеточного контакта, деградации внеклеточной матрицы (ECM) и приобретению мигрирующих и вторгающихся возможностей клетками, которые способствуют метастазам раковых клеток в различные органы1,2. Различные методы доступны для определения миграции клеток (заживление ран и Бойден камеры анализы) и вторжения (Matrigel-Boyden камеры анализ)3,4,5. Эти обычные методы являются полуколичественными, потому что клетки должны быть помечены флуоресцентным красителем или другими красителями до или после эксперимента для измерения фенотипов клеток. Кроме того, в некоторых случаях необходимы механические сбои для создания раны для измерения миграции клеток в место раны. Более того, эти существующие методы отнимают много времени, трудоемки и измеряют результаты только в одно время. Кроме того, эти методы склонны к неточным измерениям из-за непоследовательной обработки во время экспериментальной процедуры6.
В отличие от обычных методов, система анализа клеток в реальном времени измеряет клеточные импеданс в режиме реального времени, не требуя предварительного или постстождения и механического повреждения клеток. Что еще более важно, продолжительность эксперимента может быть продлена, с тем чтобы биологические эффекты могли определяться зависящим от времени образом. Выполнение эксперимента является эффективным по времени и не трудоемким. Анализ данных является относительно простым и точным. По сравнению с другими методами, этот метод является одним из лучших измерений в реальном времени для измерения миграции клеток и вторжения6,,77,8,,9.
Giaever и Keese были первыми, кто описал импеданс-измерение популяции клеток на поверхности электродов10. Система анализа клеток в реальном времени работает по тому же принципу. Площадь каждого микроплитного колодца составляет примерно 80% покрыто массивом золотых микроэлектродов. Когда площадь поверхности электрода занята клетками из-за присоединения или распространения клеток, электрический импульс меняется. Этот импеданс отображается как индекс клеток, который прямо пропорционален клеткам, покрывающим область поверхности электрода после того, как они проникают в микропористую мембрану (средний размер пор этой мембраны 8 мкм)11.
Crk и CrkL являются адаптерными белками, содержащими SH2 и SH3 домены и играют важную роль в различных клеточных функций, таких как цитоскелет регулирования, преобразование клеток, пролиферация, адгезия, эпителиал-мезенхимальный переход, миграция, вторжение, и метастазирование по среде белково-белковых взаимодействий во многих сигнальных путей1,12,13,14,15,16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16 , 16,151617, 18. Поэтому важно определить, что crk/CrkL-зависимые мигрирующие и инвазивные возможности раковых клеток. Анализ клеток в реальном времени был проведен для определения мигрирующих и инвазивных способностей клеток глиобластомы при подделке генов Crk и CrkL.
Этот метод документ описывает подробные измерения Crk- и CrkL-опосредованной миграции и вторжения клеток глиобластомы человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы клеточной культуры должны быть стерильными, и весь эксперимент должен быть выполнен в шкафу биобезопасности в стерильных условиях.
1. Культура и электропорация линии глиобластомы U-118MG
- Культура U-118MG клеточной линии в 5% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS), содержащий Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) (культура среды) и поддерживать при 37 градусов по Цельсию во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 инкубатор (культурные условия).
- Используйте 70- 80% сольясь здоровые клетки для электропорации.
- Для сбора клеток, мыть клетки, растущие в культуре блюда с 1x PBS и добавить 2 мл 0,05% трипсин-EDTA. Поместите в инкубатор на 30 с и удалите трипсин-ЭДТА. Сбор клеток в среде культуры в трубку 15 мл.
- Подсчитайте клетки с помощью портативного автоматизированного счетчика клеток, центрифуги на 100 х г в течение 5 минут, и отбросить супернатант.
- Приостановить клеточные гранулы в среде культуры и принять 600000 клеток для каждого состояния в микроцентрифугтрубки. Отрегулируйте число клеток в зависимости от экспериментальных конструкций и темпов роста.
- Перенесите суспензию клеток в микроцентрифуговую трубку и добавьте 800 Л л фосфатно-буферного солина Дульбекко (DPBS). Спин вниз с помощью миницентрифуги в течение 30 с и отказаться от супернатанта.
- Добавьте 60 зЛ буфера повторного действия R в клеточные гранулы и добавьте siRNA (т.е. нетаргетингss siRNA, Crk siRNA, или crk и CrkL siRNA) в концентрации 6 мкм в соответствующую микроцентрифугную трубку. Смешайте их осторожно, нажав.
- Электропорет 10 л клеток с системой электропорации на 1350 В на 10 мс с тремя импульсами и переносит электропоранные клетки в 5 мл культуры среды. Повторите электропорацию для остальных клеток, подготовленных для каждого состояния.
- Завершите все соответствующие электропорации. Перенесите электропорированные клетки в две 35 мм посуды на состояние и культивацию их в культурных условиях в течение 3 дней.
- На третий день, лечить все электропонные клетки в 0,5% FBS, содержащий DMEM (низкая среда сыворотки) в течение 6 ч до фактического измерения импеданс клетки.
2. Подготовка системы анализа клеток в режиме реального времени, клеточного вторжения и миграции (CIM) пластин, а также электропоганных U-118MG ячеек для покрытия
- Поместите систему анализа клеток в реальном времени в инкубатор CO2 в культурных условиях 5–6 ч до начала эксперимента по стабилизации системы в культурных условиях.
- Для проведения интаф-ассса пластина 50 зл DMEM (простая средняя), содержащая внеклеточный матричного матечного (ECM) гель на уровне 0,1 мкг/л в каждой скважине верхней камеры пластины CIM. Чтобы избежать пузырьков воздуха, используйте метод обратного пипетки. Немедленно удалите 30 л eCM геля, оставляя 20 Лл в колодце.
- После eCM гель покрытие, держать пластину в инкубаторе в культурных условиях в течение 4 ч с его крышкой. Во время eCM гель покрытие и сушки, принять превентивные меры, чтобы избежать прямого контакта электродов верхней камеры пластин с руками, поверхностей шкафа биобезопасности, или CO2 инкубатора.
- Чтобы настроить программу измерения импеданса, дважды щелкните значок связанного программного обеспечения (см. Таблица Материалов),чтобы открыть системное программное приложение (блок управления). Каждая колыбель имеет отдельное окно с различными вкладками, чтобы установить экспериментальные условия, impedance измерения интервала времени и продолжительности, а также анализа данных.
- Под вкладкой Layout установите четырехсторонние скважины для каждого биологического состояния и установите двухступенчатые измерения импеданса клеток под вкладкой «Расписание». Первый шаг предназначен для одноразового базового измерения (один развертки с интервалом 1 мин), а второй шаг заключается в измерении клеточного импеданса в соответствующих отдельных колыбели для фактического эксперимента. Для миграции используйте 145 зачисток с интервалом 10 мин, а для вторжения 577 зачисток с интервалом 10 мин, индивидуально установленных) в соответствующих отдельных колыбели.
- Один ч до начала измерения клеточного импедеданса добавьте 160 л DMEM с 10% FBS в качестве химиоаттрактора в колодцах нижней камеры пластины. Соберите либо верхнюю камеру, содержащую eCM гель покрытием скважин или без покрытия скважин с нижней камерой для измерения вторжения и миграции, соответственно.
- Заполните колодцы в верхней камере 50 зл и сыворотки средней и поместите их в колыбель системы. Проверьте, распознаются ли все скважины блоком управления, нажав на вкладку Сообщение. Если сообщение отображается как ОК,пластина в колыбели готова к эксперименту.
- Preincubate полностью упакованы пластин в инкубаторе в условиях культуры в течение 1 ч до измерений в режиме реального времени системы анализа клеток колыбели, которая имеет важное значение для акклиматизации упакованной пластины в условиях клеточной культуры.
- Для сбора клеток, обработанных низкой средой сыворотки, протрите клетки как в шаге 1.3, соберите их в среде низкой сыворотки и подсчитайте клетки как в шаге 1.4.
- После подсчета, центрифуги клетки на 100 х г в течение 5 минут и отбросить супернатант.
- Resuspend 800,000 клеток в 800 л низкой среде сыворотки для миграции и вторжения анализов. Кроме того, resuspend 300000 клеток в 2 мл культуры среды и семян в 35 мм блюдо для западного анализа помок, чтобы подтвердить регулируемый нокдаун Crk и CrkL.
3. Базовое чтение, посев клеток, и клеточной импеданс измерения и визуализации
- Измерьте базовое чтение, Start нажав кнопку "Запуск колыбели". Базовый удлинитель следует прочитать после предварительного инкубации пластин на 1 ч в колыбели системы анализа клеток в реальном времени в условиях культуры в инкубаторе CO2 и перед посевом клеток в соответствующих скважинах в верхней камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: После нажатия кнопки «Запуск колыбели» блок управления спросит, следует ли сохранить экспериментальный файл. После сохранения файла анализатор колыбели измеряет импеданд исходной ячейки, установленный в программе изначально, и вводит режим паузы до тех пор, пока кнопка «Запуск колыбели» не нажата снова для измерения импеданса ячейки на втором этапе. - Выняйте обе пластины для миграции и вторжения из колыбелей после базового измерения и держать их в кабинете биобезопасности.
- Семя 100 л клеток (100 000 клеток) в четырехместных для каждого биологического состояния в верхней камере пластины CIM в соответствующих скважинах, как запрограммировано в блоке управления колыбели обратным пайпеттингом, чтобы избежать пузырьков воздуха.
- После посева, держать пластину под биобезопасности шкаф в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы клетки равномерно оседать на дно. Перенесите пластину обратно в соответствующую колыбели и нажмите кнопку запуска колыбели, чтобы начать измерение импеданса ячейки, как запрограммировано на втором этапе 2,5.
- После последнего развертки эксперимент завершается, и результаты сохраняются автоматически.
- Под вкладкой «Анализ данных» визуализируйте изменения в клеточной импедале и индексе клеток в зависимости от времени во время или после завершения эксперимента. Каждое из соответствующих условий четырехкомнатных может быть визуализировано либо индивидуально, либо в виде средних и/или стандартных отклонений, нажав на коробки Опциона для среднего и стандартного отклонения.
- Для экспорта данных индекса ячейки в файл электронной таблицы откройте пустой файл электронной таблицы, поместите курсор в середину окна анализа данных и нажмите правой кнопкой мыши. В поле диалога, которое появляется, выберите опцию Копирование данных в формат спискаи вставьте данные в открытую таблицу.
- Отрегулируйте время в исходных данных, чтобы представить фактическое время начала измерения клеточного импеданса. Время начала второго шага устанавливается как ноль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блок управления имеет возможность получить индекс ячейки с или без нормализации (т.е. нормализованный индекс ячейки) и визуализировать результаты в качестве графического представления в зависимости от времени образом. В этом примере данные сотового индекса экспортируются без нормализации для обработки и графической презентации. - Отпустите эксперимент, нажав кнопку Release в каждой колыбели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Было высказано предположение, что Crk и CrkL имеют важное значение для миграции клеток и вторжения в различных линиях раковых клеток13,17. Хотя белки Crk и CrkL структурно и функционально похожи друг на друга и играют важные перекрывающиеся функции16,,19,,20,,21, многие исследования гена нокдауна для Crk и CrkL четко не рассматриваются ли нокдаун специфичен либо для Crk, CrkL, или оба. Таким образом, неясно, какой из двух белков способствует миграции клеток и вторжению. В качестве доказательства принципа исследования, мы использовали siRNAs, специфичные для Crk или CrkL и изучали их влияние на миграцию и вторжение в u-118MG GBM клеточной линии. Нокдаун Crk снизил уровень белка CrkII и CrkI на 85% и 86%, соответственно, без снижения уровня белка CrkL. Нокдаун CrkL снизил уровень белка CrkL на 85%(рисунок 1). CrkL нокдаун немного снизил уровень CrkII и CrkI, тоже. Комбинированное использование siRNA для Crk и CrkL снизило уровни CrkII, CrkI и CrkL более чем на 80%(рисунок 1B). С другой стороны, нокдаун Crk и CrkL не повлиял на уровни винкулина и з-тубулина(рисунок 1).
Клетки U-118MG мигрировали в высокую сыворотку (10% FBS), достигнув максимального уровня миграции на уровне 13 ч, что послужило экспериментом внутреннего контроля(рисунок 2A). С crk нокдаун, миграция клеток была отложена, и клетки продолжали мигрировать до 23 h. CrkL нокдаун существенно ингибирует миграцию клеток. U-118MG клетки потеряли свою миграционную способность при нокдауне как Crk и CrkL(Рисунок 2A), предполагая, что Crk и CrkL играют важную роль перекрывающихся клеток в миграции раковых клеток. Однако этот вывод не является очевидным, если миграция клеток рассматривается в фиксированный момент времени. Когда миграции клеток на 6 или 13 ч были сравнена, запреты Crk и CrkL нокдауны были очевидны(рисунок 2B,C). В отличие от этого, Crk нокдаун не оказывает ингибирующего влияния на миграцию клеток на 18 ч(рисунок 2D),что приводит к противоречивым результатам в зависимости от времени, выбранного для сравнения. Тормозные эффекты crkL нокдаун и Crk / CrkL двойной нокдаун были хорошо видны на всех трех точках времени. Эти результаты ясно показывают, что миграция клеток должна быть оценена в течение всего периода миграции клеток для точного анализа последствий генетических манипуляций или наркотиков.
Клетки U-118MG вторглись в высокую сыворотку, достигнув максимального уровня вторжения в 52 ч, что послужило экспериментом внутреннего контроля(рисунок 3A). С Crk нокдаун, вторжение клеток было отложено, но он достиг аналогичного максимального уровня на 60 ч. С crkL нокдаун, U-118MG клетки показали задержки и снижение вторжения по сравнению с контрольных ячеек. Комбинированный нокдаун Crk и CrkL еще больше ингибирует вторжение клеток(рисунок 3A). Сравнение нашествия клеток на 36 ч, когда контрольные клетки активно претерпевали вторжение, четко продемонстрировано ингибирование отдельным нокдауном Crk и CrkL и синергетический ингибирование Crk/CrkL двойной нокдаун(Рисунок 3B). Тем не менее, сравнение клеточного вторжения на 52 или 60 ч продемонстрировали небольшое или отсутствие тормозного эффекта Crk нокдаун(Рисунок 3C,D). Эти результаты четко подтверждают предположение о том, что вторжение клеток должно быть проанализировано в течение всего периода эксперимента.
Эти результаты свидетельствуют о том, что crk и CrkL посредника в миграции и вторжении клеток, и что система анализа клеток в реальном времени имеет явное преимущество перед традиционными методами в понимании различных кинетики миграции и вторжения клеток и специфические эффекты на фенотипы клеток в зависимости от времени образом.
Рисунок 1: siRNA-опосредованный нокдаун CrkI, CrkII, и CrkL в U-118MG клетках. (A) Всего лизаты клеток были подготовлены через 4 дня после U-118MG клетки были электропораза с не-таргетинга контроля siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, или как Crk и CrkL siRNAs, и уровни белка были определены западные анализы поблютка, как уже описано ранее1. (B) Интенсивность сигнала соответствующих полос была количественно с помощью системы визуализации и рассчитывается как процентNT. Их средние значения SD отображаются на графике. Винкулин и тубулин служили внутренним контролем. Статистический анализ данных проводился с использованием непарного двуххвостого студенчества для сравнения между двумя экспериментальными группами. Злт; 0,05 и злитро; 0,01, по сравнению с NT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Эффекты Crk/ CrkL нокдаун на U-118MG миграции клеток: (A) Через три дня после U-118MG клетки были электропоратизированы с нетаргетацией управления siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, или как Crk и CrkL siRNAs, клетки были собраны и миграция клеток была обследована с помощью системы анализа реального времени. Миграция u-118MG клеток была ингибирована с одним нокдауном Crk или CrkL в зависимой от времени манере. Нокдаун crk и CrkL полностью заблокировал миграцию ячеек. Значения индекса ячейки на 6 (B), 13 (C, и 18 h(D) представлены для сравнения миграции ячейки в разных точках времени (стрелки). В 13 ч контрольные ячейки (NT) достигли максимальной миграции. На 18 ч как контроль и Crk нокдаун клетки показали аналогичные уровни миграции клеток. Статистический анализ данных проводился с использованием непарного двуххвостого студенчества для сравнения между двумя экспериментальными группами. Кв/д злт; 0,01, по сравнению с NT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Эффекты Crk / CrkL нокдаун на U-118MG ячейки вторжения: ()) Через три дня после U-118MG клетки были электропогатаны с нетаргетацией управления siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, или как Crk и CrkL siRNAs, клетки были собраны и клеточного вторжения были рассмотрены в течение 4 дней анализа с помощью реального времени. Вторжение U-118MG клетки был ингибирован с одного нокдауна Crk или CrkL в зависимости от времени образом. Нокдаун crk и CrkL в клеточной линии U-118MG снизил свою инвазивную емкость до 48 ч по сравнению с значениями индекса NT. Cell на 36 (B, 52 (C, и 60 ч (D) представлены для сравнения вторжения клеток в разных точках времени (стрелках). На 52 ч, контрольные элементы (NT) достигли начального пика вторжения. На 60 ч, Клетки крк нокдаун достиг первоначального пика вторжения. Статистический анализ данных проводился с использованием непарного двуххвостого студенчества для сравнения между двумя экспериментальными группами. Злт; 0,05 и злитро; 0,01, по сравнению с NT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измерение миграции и вторжения в реальном времени с использованием системы анализа ячеек в реальном времени представляет собой простой, быстрый и непрерывный процесс мониторинга с многочисленными значительными преимуществами по сравнению с традиционными методами, предоставляя данные в один момент времени. Как и в случае с традиционными методами, экспериментальные условия должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии для системы анализа клеток в реальном времени, потому что каждая клеточная линия может быть разной с точки зрения ее прибавки к субстрату, росту, контактам от клетки к клетке и миграции и инвазивных способностей. Из-за этих различий, каждая клеточная линия может показать различные клеточные кинетики и клеточные импедансы. Импедас в значительной степени зависит от количества клеток, посеянных в колодце, время для клеточной сливк, время задержки до того, как клетки начнут мигрировать или вторгаться, и концентрация eCM геля на пластинах CIM. Во-первых, анализ клеток в реальном времени упрощает оптимизацию, поскольку она дает результаты в режиме реального времени в течение определенного периода времени, позволяя исследователям определить время, когда контрольные клетки показывают активную миграцию и вторжение клеток и когда контроль клетки достигают максимальных уровней миграции и вторжения. Во-вторых, эктопические исследования экспрессии генов или исследования нокдауна генов могут потребовать дополнительной оптимизации, поскольку клетки должны принять фенотипы из модифицированных генотипических изменений. Кроме того, эффективные концентрации лекарственных средств и эффективность препаратов могут быть определены в сочетании с нормальными или модифицированными генетическими условиями с использованием системы анализа клеток в реальном времени.
Традиционные методы, такие как заживление ран, мягкий агар, Бойден камеры миграции, или вторжения анализы были использованы для определения того, что нокдаун либо Crk или CrkL приводит к сокращению миграции и вторжения в различных линиях раковых клеток13,17. В этом исследовании мы индуцировали одиночный или двойной нокдаун Crk и CrkL в линии клеток U-118MG и исследовали миграцию и вторжение клеток. Измерение клеточных импеданса в реальном времени на протяжении всего эксперимента позволило обеспечить углубленную информацию о кинетике миграции и вторжения клеток, что позволило определить два различных способа ингибирования. В то время как Crk нокдаун задержки миграции и вторжения, CrkL нокдаун препятствует миграции и вторжения в течение всего периода времени. Кроме того, двойной нокдаун crk и CrkL полностью заблокировал миграцию клеток и существенно воспрепятствовал вторжению клеток.
Это исследование обеспечивает доказательство концепции, что сочетание систематического нокдаун подход, чтобы вызвать одного и двойного нокдауна Crk и CrkL с анализом в режиме реального времени миграции клеток и вторжения в течение всего периода экспериментов необходимо для комплексный анализ функций Crk- и CrkL в раковых клетках. Данные, представленные в этом исследовании, показывают, что этот метод также может быть использован для тестирования кандидатов наркотиков для их ингибирующего воздействия на Crk и CrkL. В целом, в режиме реального времени система анализа клеток полезна в создании экспериментов для миграции клеток или вторжения клеток и делает возможно провести углубленный и всеобъемлющий анализ в режиме реального времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Оливию Фанк за техническую помощь в подготовке данных системы анализа ячеек в режиме реального времени. Мы также благодарим Медицинский центр письма в Детском Милосердии Канзас-Сити за редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Томом Keaveny Наделенный Фонд детских исследований рака (TP) и Детские милосердия больницы Midwest рака Альянс Партнерский консультативный совет финансирования (TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
