Summary
Cancer är en dödlig sjukdom på grund av dess förmåga att metastasera till olika organ. Att bestämma cancercellernas förmåga att migrera och invadera under olika behandlingsförhållanden är avgörande för att bedöma terapeutiska strategier. Detta protokoll presenterar en metod för att bedöma realtid ögonbevarande förmågor av en glioblastoma cancer cellinje.
Abstract
Cancer uppstår på grund av okontrollerad spridning av celler som initierats av genetisk instabilitet, mutationer och miljömässiga och andra stressfaktorer. Dessa förvärvade avvikelser i komplexa, flerskiktade molekylära signalering nätverk inducera avvikande cell spridning och överlevnad, extracellulära matris nedbrytning och metastasering till avlägsna organ. Cirka 90% av cancerrelaterade dödsfall beräknas orsakas av de direkta eller indirekta effekterna av metastaserande spridning. Därför är det viktigt att upprätta ett mycket tillförlitligt, omfattande system för att karakterisera cancercell beteenden på genetiska och miljömässiga manipulationer. Ett sådant system kan ge en tydlig förståelse för den molekylära regleringen av cancermetastaser och möjligheten till framgångsrik utveckling av stratifierade, exakta terapeutiska strategier. Därför, korrekt bestämning av cancer cell beteenden såsom migration och invasion med vinst eller förlust av funktion av gen (s) tillåter bedömning av den aggressiva karaktären av cancerceller. Realtidsmätningssystemet baserat på cellimpedans gör det möjligt för forskare att kontinuerligt inhämta data under ett helt experiment och omedelbart jämföra och kvantifiera resultaten under olika experimentella förhållanden. Till skillnad från konventionella metoder kräver den här metoden inte fixering, färgning och provbearbetning för att analysera celler som migrerar eller invaderar. Denna metod papper betonar detaljerade förfaranden för realtid bestämning av migration och invasion av glioblastoma cancerceller.
Introduction
Cancer är en dödlig sjukdom på grund av dess förmåga att metastasera till olika organ. Bestämma cancer genotyper och fenotyper är avgörande för att förstå och utforma effektiva terapeutiska strategier. Årtionden av cancerforskning har lett till utveckling och anpassning av olika metoder för att bestämma cancer genotyper och fenotyper. En av de senaste tekniska utvecklingen är realtidsmätning av cellmigration och invasion baserad på cellimpedans. Cellvidhäftning till substrat och cellcellkontakter spelar en viktig roll i cell-till-cell kommunikation och reglering, utveckling och underhåll av vävnader. Avvikelser i cellvidhäftning leder till förlust av cellcellkontakt, nedbrytning av extracellulär matris (ECM) och vinst av flyttande och invaderande förmåga av celler, som alla bidrar till metastasering av cancerceller till olika organ1,2. Olika metoder finns tillgängliga för att bestämma cellmigration (sårläkning och Boyden kammaranalyser) och invasion (Matrigel-Boyden kammare analys)3,4,5. Dessa konventionella metoder är semikvantitativa eftersom celler måste märkas med ett fluorescerande färgämne eller andra färgämnen antingen före eller efter experimentet för att mäta cellfenotyper. Dessutom behövs mekaniska störningar i vissa fall för att skapa ett sår för att mäta migrationen av celler till sårplatsen. Dessutom är dessa befintliga metoder tidskrävande, arbetsintensiva och mäter resultaten vid endast en tidpunkt. Dessutom är dessa metoder benägna att göra felaktiga mätningar på grund av inkonsekvent hantering under försöksproceduren6.
Till skillnad från konventionella metoder mäter cellanalyssystemet i realtid cellimpedans i realtid utan att kräva pre- eller poststaining och mekanisk skada av celler. Ännu viktigare är att varaktigheten av ett experiment kan förlängas så att biologiska effekter kan bestämmas på ett tidsberoende sätt. Att köra experimentet är tidseffektivt och inte arbetskrävande. Att analysera data är relativt enkelt och korrekt. Jämfört med andra metoder är denna metod en av de bästa realtidsmätningarna för att mäta cellmigrering och invasion6,,7,,8,9.
Giaever och Keese var de första att beskriva impedans-baserade mätning av en cellpopulation på ytan av elektroder10. Realtidscellanalyssystemet fungerar enligt samma princip. Området för varje mikroplåtsbrunn är cirka 80% täckt med en rad guldmikroelektroder. När elektrodens yta upptas av celler på grund av vidhäftning eller spridning av cellerna, ändras den elektriska impedansen. Denna impedans visas som cellindex, som är direkt proportionell mot de celler som täcker elektrodens yta efter att de trängt in i mikroporösa membranet (medianporstorleken på detta membran är 8 μm)11.
Crk och CrkL är adaptorproteiner som innehåller SH2- och SH3-domäner och spelar viktiga roller i olika cellulära funktioner, såsom cytoskeletonreglering, celltransformation, spridning, vidhäftning, epitel-mesenkymal övergång, migration, invasion och metastasering genom att medla protein-proteininteraktioner i många signalvägar1,,12,13, 14,14,15,16,17, 18.Den har inte till någon del av Därför är det viktigt att bestämma Crk/CrkL-beroende migrations- och invasiva förmåga att cancerceller. Realtid cell analys utfördes för att bestämma flyttande och invasiva förmågor glioblastoma celler på gen knockdown av Crk och CrkL.
Denna metod papper beskriver detaljerade mätningar av Crk- och CrkL-medierad migration och invasion av mänskliga glioblastoma celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla cellodlingsmaterial måste vara sterila och hela experimentet måste utföras i ett biosäkerhetsskåp under sterila förhållanden.
1. Odling och elektroporation av U-118MG Glioblastoma celllinje
- Odla U-118MG cellinje i 5% fetala nötkreatur serum (FBS) som innehåller Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (odlingsmedium) och upprätthålla vid 37 °C i en fuktig atmosfär som innehåller 5% CO2 inkubator (odlingsförhållanden).
- Använd 70– 80% konfluenta friska celler för elektroporation.
- För skörd av celler, tvätta cellerna växer i kulturrätter med 1x PBS och tillsätt 2 ml 0,05% trypsin-EDTA. Placera i inkubatorn i 30 s och ta bort trypsin-EDTA. Samla celler i odlingsmediet i ett 15 ml-rör.
- Räkna cellerna med hjälp av en handhållen automatiserad cellräknare, centrifugceller på 100 x g i 5 min och kassera supernatanten.
- Suspend cell pelleten i odlingsmediet och ta 600.000 celler för varje tillstånd i en microcentrifug röret. Justera cellnumret beroende på experimentell design och tillväxttakt.
- Överför cellupphängningen till ett mikrocentrifugrör och tillsätt 800 μL av Dulbeccos fosfatbuffertade koksaltlösning (DPBS). Snurra ner med en minicentrifug för 30 s och kasta supernatanten.
- Tillsätt 60 μl resuspensionsbuffert R till cellpelleten och tillsätt siRNAs (dvs. icke-inriktning siRNA, Crk siRNA, CrkL siRNA, eller både CrkL och CrkL siRNAs) vid en koncentration av 6 μM till respektive mikrocentrifugrör. Blanda dem försiktigt genom att knacka.
- Elektroporat 10 μL celler med ett elektroporationssystem vid 1 350 V för 10 ms med tre pulser och överför de elektroporerade cellerna till 5 ml av odlingsmediet. Upprepa elektroporationen för resten av cellerna som förberetts för varje tillstånd.
- Fyll i all respektive elektroporation. Överför elektroporerade celler till två 35 mm rätter per tillstånd och odla dem under odlingsförhållanden i 3 dagar.
- På den tredje dagen, behandla alla elektroporerade celler i 0,5% FBS som innehåller DMEM (lågt serum medium) för 6 h före den faktiska cellimpedans mätning.
2. Beredning av realtid cellanalys system, cell invasion och migration (CIM) plattor, och elektroporerade U-118MG celler för plätering
- Placera cellanalyssystemet i realtid i2 en CO 2-inkubator under odlingsförhållanden 5–6 timmar före experimentets början för att stabilisera systemet till kulturförhållandena.
- För invasionsanalysen, platta 50 μl DMEM (vanligt medium) som innehåller extracellulär matrisgel (ECM) vid 0,1 μg/μL i varje brunn i CIM-plattans övre kammare. Använd omvänd pipetteringsmetod för att undvika luftbubblor. Ta omedelbart bort 30 μl ECM gel och lämna 20 μL i brunnen.
- Efter ECM gel beläggning, hålla plattan i inkubatorn under odlingsförhållanden för 4 h med locket på. Under ECM gel beläggning och torkning, vidta förebyggande åtgärder för att undvika direkt kontakt med elektroderna i den övre kammaren av plattorna med händerna, ytorna på biosäkerhetskåpet, eller CO2 inkubator.
- Om du vill ställa in impedansmätningsprogrammet dubbelklickar du på den associerade programikonen (se Tabell över material)för att öppna systemprogramvaran (styrenheten). Varje vagga har ett enskilt fönster med olika flikar för att ställa in experimentella förhållanden, impedansensmättidsintervall och varaktighet samt dataanalys.
- Under fliken Layout anger du fyrdubbla brunnar för varje biologiskt tillstånd och anger tvåstegscellimpedansmätningar under fliken Schema. Det första steget är för en engångsbaslinjemätning (ett svep med ett intervall på 1 minuter), och det andra steget är att mäta cellimpedansen i respektive enskilda vaggor för ett faktiskt experiment. För migration, använd 145 svep med 10 minuters intervall, och för invasion, 577 svep med ett 10 min intervall, individuellt inställd) i respektive enskilda vaggor.
- En h före starten av cellimpedansmätningen, tillsätt 160 μl DMEM med 10% FBS som kemoattractant i brunnarna i plattans nedre kammare. Montera antingen den övre kammaren som innehåller ECM gel-belagda brunnar eller obelagda brunnar med den nedre kammaren för att mäta invasion och migration, respektive.
- Fyll brunnarna i den övre kammaren med 50 μL lågt serummedium och placera dem i systemets vagga. Kontrollera om alla brunnar känns igen av styrenheten genom att klicka på fliken Meddelande. Om meddelandet visas som OKär plattan i vaggan klar för experimentet.
- Förinkubera de helt förpackade plattorna i inkubatorn under odlingsförhållanden i 1 h före mätningar i realtids cellanalyssystem vagga, vilket är viktigt för acklimatisering av en packad platta till cellodlingsförhållandena.
- För skörd av celler som behandlats med lågt serummedium, trypsinize cellerna som i steg 1.3, samla dem i lågt serum medium, och räkna cellerna som i steg 1.4.
- Efter räkning, centrifugceller på 100 x g i 5 min och kasta supernatanten.
- Resuspend 800.000 celler i 800 μL av låg serum medium för migration och invasion analyser. Dessutom återsuspend 300.000 celler i 2 ml odling medium och utsäde i en 35 mm maträtt för västra blot analys för att bekräfta den reglerade knockdown av Crk och CrkL.
3. Baslinjeavläsning, sådd av cellerna och cellimpedansmätning och visualisering
- Mät baslinjeavläsningen genom att klicka på startknappen för vaggan. Baslinjen ska läsas efter att plattorna har förinkubteras i 1 h i cellanalyssystemets vagga under odlingsförhållanden i CO 2-inkubatorn och innan cellerna sås till respektive brunnar i den övre kammaren.
OBS: När startknappen för vaggan har klickats frågar styrenheten om du vill spara experimentfilen. När filen har sparats mäter vaggaanalysatorn baslinjecellimpedansen som anges i programmet från början och går in i ett pausläge tills startknappen för vaggan klickas igen för att mäta cellimpedans i det andra steget. - Ta ut båda plattorna för migration och invasion från vaggorna efter baslinjen mätning och hålla dem i biosäkerhet skåp.
- Utsäde 100 μl celler (100 000 celler) i fyrdubblingar för varje biologiskt tillstånd i CIM-plattans övre kammare i respektive brunnar och programmerat i vaggans styrenhet genom omvänd pipettering för att undvika luftbubblor.
- Efter sådd, hålla plattan under en biosäkerhet skåp i 30 min vid rumstemperatur så att cellerna att jämnt bosätta sig ner till botten. Överför tillbaka plattan till respektive vagga och klicka på vaggans startknapp för att börja mäta cellimpedansen enligt det andra steget på 2,5.
- Efter det senaste svepet är experimentet klart och resultaten sparas automatiskt.
- Under fliken Dataanalys visualiserar du ändringarna i cellimpedans som cellindex på ett tidsberoende sätt under eller efter avslutad experiment. Var och en av de respektive villkoren för fyrdubblar kan visualiseras antingen individuellt eller som medelvärden och/eller standardavvikelser genom att klicka på rutorna Alternativ för genomsnittlig och standardavvikelse.
- Om du vill exportera cellindexdata till en kalkylbladsfil öppnar du en tom kalkylbladsfil, placerar markören mitt i fönstret Dataanalys och högerklickar. I dialogrutan som visas väljer du alternativet Kopiera data till listformatoch klistrar in data i det öppna kalkylbladet.
- Justera tiden i rådata så att den representerar den faktiska starttiden för cellimpedansmätningen. Den andra stegstarttiden är inställd som noll.
OBS: Styrenheten har möjlighet att hämta cellindexet med eller utan normalisering (dvs. normaliserat cellindex) och visualisera resultaten som en grafisk presentation på ett tidsberoende sätt. I det här exemplet exporteras cellindexdata utan normalisering för bearbetning och grafisk presentation. - Släpp experimentet genom att klicka på knappen Släpp i varje vagga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det har föreslagits att Crk och CrkL är viktiga för cellmigration och invasion i olika cancer cellinjer13,17. Även Crk och CrkL proteiner är strukturellt och funktionellt liknar varandra och spela väsentliga överlappande funktioner16,19,20,21, många gen knockdown studier för Crk och CrkL har inte tydligt tagit upp om knockdown är specifik för antingen Crk, CrkL, eller båda. Därför är det oklart vilket av de två proteinerna som bidrar till cellmigration och invasion. Som en proof-of-princip studie, vi använde siRNAs specifika för Crk eller CrkL och studerade deras effekter på migration och invasion av U-118MG GBM cellinje. Knockdown av Crk minskade CrkII och CrkI proteinnivåer med 85% och 86%, respektive, utan att minska CrkL proteinnivån. Nedslaget av CrkL minskade CrkL-proteinnivån med 85 % (figur 1). CrkL knockdown minskade också CrkL-nedslagen något. Kombinerad användning av siRNAs för Crk och CrkL minskade CrkII, CrkI och CrkL nivåer med mer än 80%(Figur 1B). Å andra sidan påverkade knockdown av Crk och CrkL inte vinculin- och α-tubulinnivåerna (figur 1).
U-118MG-cellerna migrerade till hög serum (10% FBS), når maximal migrationsnivå vid 13 timmar, vilket fungerade som experimentet intern kontroll (figur 2A). Med Crk knockdown försenades cellmigrering och cellerna fortsatte att migrera till 23 h. CrkL knockdown hämmade avsevärt cellmigrering. U-118MG celler förlorade sin migrationsförmåga vid knockdown av både Crk och CrkL (Figur 2A), vilket tyder på att Crk och CrkL spela viktiga överlappande roller i cancer cell migration. Denna slutsats är dock inte tydligt om cellmigrationen undersöks vid en bestämd tidpunkt. När cellmigreringar vid 6 eller 13 timmar jämfördes var hämningar av Crk och CrkL-knockdowns uppenbara (figur 2B,C). Däremot hade Crk knockdown inte någon hämmande effekt på cellmigration vid 18 timmar (figur 2D), vilket ledde till motstridiga resultat beroende på vilken tidpunkt som valts för jämförelse. De hämmande effekterna av CrkL knockdown och Crk/CrkL dubbel knockdown var tydligt synliga vid alla tre tidpunkter. Dessa resultat visar tydligt att cellmigration måste bedömas under hela perioden av cellmigration för att noggrant analysera effekter genom genetiska manipulationer eller läkemedel.
U-118MG-cellerna invaderade hög serum och nådde den maximala invasionsnivån vid 52 timmar, vilket fungerade som experimentets interna kontroll (figur 3A). Med Crk knockdown, cell invasion försenades, men det nådde en liknande högsta nivå på 60 h. Med CrkL knockdown, U-118MG celler visade fördröjd och minskad invasion jämfört med kontrollceller. Kombinerad knockdown av Crk och CrkL ytterligare hämmade cellinvasion (Figur 3A). Jämförelse av cellinvasion vid 36 h, när kontrollcellerna aktivt genomgick invasion, tydligt visat hämning av enskilda knockdown av Crk och CrkL och en synergistisk hämning av Crk /CrkL dubbel knockdown (Figur 3B). En jämförelse av cellinvasion vid 52 eller 60 timmar uppvisade dock en liten eller ingen hämmande effekt av Crk knockdown (figur 3C,D). Dessa resultat stöder tydligt förslaget att cellinvasion bör analyseras under hela perioden av experimentet.
Dessa resultat visar att både Crk och CrkL medlar cellmigration och invasion, och att realtidscellanalyssystemet har en klar fördel jämfört med de traditionella metoderna för att förstå de olika kinetikerna av cellmigration och invasion och specifika effekter på cellfenotyper på ett tidsberoende sätt.
Figur 1: siRNA-medierad knockdown av CrkI, CrkII och CrkL i U-118MG celler. (A)Totala cell lysates var beredd 4 dagar efter U-118MG celler elektroporerades med icke-inriktning kontroll siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, eller både Crk och CrkL siRNAs, och proteinnivåer fastställdes av västerländska blot analyser som beskrivits tidigare1. (B)Signalnivåerna för respektive band kvantifierades med hjälp av bildsystemet och beräknades som procentsatser av NT. Deras medelvärde ± SD-värden visas i diagrammet. Vinculin och a-tubulin fungerade som interna kontroller. Statistiska analyser av data utfördes med hjälp av opartade tvåsidiga Students t-test för jämförelse mellan de två experimentella grupperna. * p < 0,05 och ** p < 0,01, jämfört med NT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekterna av Crk/CrkL knockdown på U-118MG cellmigrering: (A) Tre dagar efter U-118MG celler var elektroporerade med icke-inriktning kontroll siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, eller både CrkL och CrkL siRNAs, celler skördades och cellmigration undersöktes med hjälp av realtid analyssystem. Migration av U-118MG celler hämmades med en enda knockdown av Crk eller CrkL på ett tidsberoende sätt. Knockdown av både Crk och CrkL helt blockerade cellmigrering. Cellindexvärden vid 6 (B), 13 (C) och 18 h(D)visas för att jämföra cellmigrering vid olika tidpunkter (pilar). Vid 13 h nådde kontrollcellerna (NT) maximal migration. Vid 18 h både kontroll och Crk knockdown celler visade liknande nivåer av cellmigrering. Statistiska analyser av data utfördes med hjälp av opartade tvåsidiga Students t-test för jämförelse mellan de två experimentella grupperna. ** p < 0,01, jämfört med NT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekterna av Crk/CrkL knockdown på U-118MG cell invasion: (A) Tre dagar efter U-118MG celler elektroporerades med icke-inriktning kontroll siRNA (NT), Crk siRNA, CrkL siRNA, eller både CrkL och CrkL siRNAs, celler skördades och cell invasion undersöktes i 4 dagar med hjälp av realtid analyssystem. Invasionen av U-118MG celler hämmades med en enda knockdown av Crk eller CrkL på ett tidsberoende sätt. Knockdown av både Crk och CrkL i U-118MG cellinjen minskade sin invasiva kapacitet upp till 48 h jämfört med NT. Cell indexvärden vid 36 (B), 52(C),och 60 h(D)presenteras för att jämföra cell invasion vid olika tidpunkter (pilar). Vid 52 h nådde kontrollcellerna (NT) den första invasionstoppen. Vid 60 h nådde Crk knockdown celler den första toppen av invasionen. Statistiska analyser av data utfördes med hjälp av opartade tvåsidiga Students t-test för jämförelse mellan de två experimentella grupperna. * p < 0,05 och ** p < 0,01, jämfört med NT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Realtidsmätningen av cellmigration och invasion med hjälp av cellanalyssystemet i realtid är en enkel, snabb och kontinuerlig övervakningsprocess med flera, betydande fördelar jämfört med de traditionella metoderna som tillhandahåller data vid en enda tidpunkt. Som med de traditionella metoderna måste experimentella förhållanden optimeras för varje cellinje för cellanalyssystemet i realtid, eftersom varje cellinje kan vara olika när det gäller dess vidhäftning till substratet, tillväxt, cell-till-cell-kontakter och migrations- och invasiva förmågor. På grund av dessa skillnader kan varje cellinje visa olika cellulära kinetik och cellimpedanser. Impedansen påverkas i hög grad av antalet celler som sås i en brunn, tiden för cellvidhäftning, fördröjningen innan cellerna börjar migrera eller invadera och koncentrationen av ECM gel på CIM-plattor. För det första gör cellanalysen i realtid optimeringen enklare eftersom den ger resultat i realtid under en viss tidsperiod, vilket gör det möjligt för forskare att identifiera den tidpunkt då kontrollcellerna visar aktiv cellmigration och invasion och när kontrollen celler når de maximala nivåerna av migration och invasion. För det andra, ectopic gen överuttryck eller gen knockdown studier kan behöva ytterligare optimeringar, eftersom cellerna måste anta fenotyper från modifierade genotypiska förändringar. Dessutom kan effektiva läkemedelskoncentrationer och effekten av läkemedel bestämmas i kombination med normala eller modifierade genetiska tillstånd med hjälp av cellanalyssystemet i realtid.
Traditionella metoder såsom sårläkning, mjuk agar, Boyden kammare migration, eller invasion analyser har använts för att avgöra att knockdown av antingen Crk eller CrkL leder till minskad migration och invasion i olika cancer cellinjer13,17. I denna studie, vi inducerade enkel eller dubbel knockdown av Crk och CrkL i U-118MG cellinjen och undersökt cell migration och invasion. Realtidsmätning av cellimpedanser över hela experimentet gav djupgående information om kinetiken i cellmigration och invasion, vilket gör det möjligt för oss att identifiera två olika former av hämning. Medan Crk knockdown försenade migration och invasion, CrkL knockdown hämmade migration och invasion under hela tidsperioden. Dessutom blockerade den dubbla knockdown av både Crk och CrkL helt cellmigration och hämmade kraftigt cellinvasionen.
Denna studie ger ett proof-of-concept som kombinerar systematisk knockdown strategi för att inducera enkel och dubbel knockdown av Crk och CrkL med realtid analyser av cellmigration och invasion under hela perioden av experimenten är nödvändigt för omfattande analyser av Crk- och CrkL-medierade funktioner i cancerceller. De data som presenteras i denna studie tyder på att denna metod också kan användas för att testa kandidatläkemedel för deras hämmande effekter på Crk och CrkL. Totalt sett är cellanalyssystemet i realtid användbart för att inrätta experiment för cellmigration eller cellinvasion och gör djupgående och omfattande analyser som möjligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Olivia Funk för hennes tekniska hjälp med realtidsdata för cellanalyssystem. Vi tackar också Medical Writing Center på Children's Mercy Kansas City för att redigera detta manuskript. Detta arbete stöddes av Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (till TP) och av Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board finansiering (till TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
