Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,5,6, 1,2, 1,2,4
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Summary

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Abstract

Zweidimensionale (2D) Zellkulturen imitieren das In-vivo-Tumorwachstum nicht zufriedenstellend. Daher wurden dreidimensionale (3D) Kultursphäroidmodelle entwickelt. Diese Modelle können im Bereich der Neuroonkologie besonders wichtig sein. Tatsächlich haben Hirntumoren die Tendenz, in die gesunde Gehirnumgebung einzudringen. Wir beschreiben hierin einen idealen 3D-Glioblastom-Sphäroid-basierten Assay, den wir entwickelt haben, um Tumorinvasionen zu untersuchen. Wir stellen ihnen alle technischen Details und Analysewerkzeuge zur Verfügung, um diesen Test erfolgreich durchzuführen.

Introduction

In den meisten Studien mit primären oder kommerziell erhältlichen Zelllinien werden Assays an Zellen durchgeführt, die auf Kunststoffoberflächen als Monolayer-Kulturen angebaut werden. Das Verwalten der Zellkultur in 2D stellt Nachteile dar, da sie keine in vivo 3D-Zellenumgebung imitiert. In 2D-Kulturen ist die gesamte Zelloberfläche direkt mit dem Medium in Kontakt, verändert das Zellwachstum und verändert die Verfügbarkeit von Medikamenten. Darüber hinaus löst die nichtphysiologische Kunststoffoberfläche die Zelldifferenzierung1aus. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurden dreidimensionale Kulturmodelle entwickelt. Sie haben den Vorteil, die multizelluläre Architektur und Heterogenität von Tumoren2nachzuahmen, und könnten daher als relevanteres Modell für solide Tumoren betrachtet werden3. Die komplexe Morphologie von Sphäroiden trägt zur besseren Beurteilung von Medikamentendurchschlagskraft und Resistenzbei 4. Die Tumorheterogenität im Sphäroid wirkt sich auf die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen und die Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe aus (Abbildung 1A). Die Diffusion von Sauerstoff wird verändert, wenn die Sphäroidgröße 300 m erreicht, was eine hypoxische Umgebung in der Mitte des Sphäroids induzieren diniert (Abbildung 1A,C). Metaboliten sind auch weniger durch die Zellschichten eindringen und kompensierenmetabolische Reaktionen stattfinden5. Wenn der Durchmesser des Sphäroids zunimmt, können nekrotische Kerne beobachtet werden, die weitere Imitieren von Eigenschaften bei vielen festen Krebsarten, einschließlich des aggressiven Hirntumorglioblastoms (GBM)6.

Mehrere 2D- oder 3D-Invasions-Assays für Glioblastom wurden in der Literatur7,8berichtet. Zweidimensionale Assays sind hauptsächlich für die Untersuchung der Invasion in einer horizontalen Ebene auf einer dünnen Matrixschicht oder in einem Boyden-Kammer-Assay9. Dreidimensionale Assays wurden mit 3D-Sphäroidkulturen mit klassischen Glioblastom-Zelllinien10beschrieben. Komplexere Varianten werden durch die Invasion von Hirnorganoiden durch Tumorsphäride in Konfrontationskulturendargestellt 11. Dennoch ist es wichtig, einen benutzerfreundlichen und reproduzierbaren Assay zu entwickeln, der jedem Labor zur Verfügung steht. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um glioblastom-Stammzellen aus Patientenproben zu erzeugen. Die Quantifizierung dieser Assays ist leicht zu handhaben und erfordert nur Open-Access-Online-Software. Kurz gesagt, Tumorstücke werden in kleine Stücke geschnitten und enzymatisch verdaut. Einzelne Zellen, die aus der Verdauung gewonnen werden, werden in neurobasalen Medien kultiviert. Nach 4-7 Tagen bilden sich spontan Sphäroidstrukturen. Bei der intrakraniellen Implantation in Mäusemodellen bilden sie Tumore, die einen nekrotischen Kern aufweisen, der von Pseudo-Palisading-Zellen umgeben ist12. Dies ähnelt den Merkmalen von GBM-Patienten.

In diesem Artikel beschreiben wir unser Protokoll zur Herstellung von Sphäroiden aus einer bestimmten Anzahl von Zellen, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Dazu können zwei komplementäre Matrizen verwendet werden: Matrigel und Kollagen Typ I. Matrigel ist mit Wachstumsfaktoren angereichert und imitiert die für die Zellanhaftung und Migration erforderliche Säugetierbasalmembran. Auf der anderen Seite ist Kollagen Typ I, ein strukturelles Element von Stroma, die häufigste fibrilläre extrazelluläre Matrix und wird in Zellinvasions-Assays verwendet. Hierin veranschaulichen wir unser GBM Sphäroid-Modell, indem wir Migrations- und Proliferationstests durchführen. Die Analyse erfolgte nicht nur zu festen Zeitpunkten, sondern auch durch die Überwachung der Sphäroidexpansion und Zellbewegung durch Live-Bildgebung. Darüber hinaus wurde die Elektronenmikroskopie durchgeführt, um morphologische Details zu visualisieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Von allen Patienten (vom Haukeland Hospital, Bergen, Norwegen gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethikkommission) wurde eine schriftliche Schriftliche Zustimmung eingeholt. Unser Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution.

1. Erzeugung von tumorsphäroiden in einheitlicher Größe

HINWEIS: Stem-ähnliche Zellen werden in neurobasalen Medium speziert, ergänzt durch B27-Ergänzung, Heparin, FGF-2, Penicillin und Streptomycin, wie in früheren Artikeln12beschrieben. Diese Zellen bilden spontan Sphäroide in der Kultur.

  1. Waschen Sie die Tumorzellen mit 5 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5-1 ml Dissoziationsenzym (siehe Materialtabelle) 5 Minuten bei 37 °C.
  2. Mit 4-4,5 ml PBS waschen und 10 ml des gesamten Wachstumsmediums (komplettes neurobasales Medium, cNBM) hinzufügen.
  3. Zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zähltechnik mit Trypanblau und einer Zellzählkammerrutsche.
  4. Um 100 Sphäroide mit 104 Zellen pro Sphäroid (je nach bevorzugter Größe) zu erzeugen, mischen Sie 106 Zellen in 8 ml NBM mit 2 ml 2% Methylcellulose.
  5. Übertragen Sie die Suspension in einen sterilen Systembehälter und geben Sie 100 l/well mit einer Mehrkanalpipette in eine gut runde Bodenplatte 96.
  6. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit. Gleich große Sphäroide bilden sich und können nach 3-4 Tagen verwendet werden.

2. Dreidimensionale Experimente

  1. Verbreitung
    1. Vorbereitung
      1. Suspend-Inhibitoren (z. B. Roton wie in Abbildung 4A) und Chemikalien in 100 l Medium und addieren zu den 100 l Medium in jedem Brunnen (d. h. ein Sphäroid pro Brunnen).
      2. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5%CO2und 95% Luftfeuchtigkeit.
    2. Bildaufnahme und -analyse
      1. Nehmen Sie Bilder mit einem Videomikroskop im hellen Feld auf, um eine Reihe von Bedingungen bei T0 und die folgenden erwarteten Zeiten zu erstellen.
      2. Verwenden Sie Fidschi, um Bilder entweder manuell oder halbautomatisch zu analysieren. Zeichnen Sie dazu manuell einen Kreis um den Sphäroidkern mit dem Freihandauswahlwerkzeug und messen Sie die Fläche jedes Sphäroids. Um die Bilder halbautomatisch zu analysieren, verwenden Sie das Makro, das in Ergänzendem Dokument 1 nur mit dem /Kernbereich dargestellt ist.
  2. Invasion
    1. Vorbereitung
      1. Bereiten Sie die Kollagenmatrix in einer Röhre auf Eis mit Typ I Kollagen bei 1 mg/ml Endkonzentration, 1x PBS, 0,023xVKollagen,1 M Natriumhydroxid und sterilerH2O vor. Inkubieren Sie die Lösung 30 min auf Eis.
      2. Sphäroide von der runden Bodengutplatte in 500 L-Röhren sammeln und 2x mit 200 l 1x PBS waschen.
      3. Pipette die Sphäroide sorgfältig in 100 l der Kollagenmatrix und in der Mitte eines Brunnens in normalen 96 Brunnenplatten einfügen.
      4. Das Kollagengel 30 min bei 37 °C inkubieren und dann cNBM auf das Gel geben. Inhibitoren oder Aktivatoren (z. B. Chlorwasserstoff wie in Abbildung 4B, 4Cdargestellt) können in diesem Schritt dem Medium zugesetzt werden.
    2. Bildaufnahme und -analyse
      1. Nehmen Sie Bilder sequenziell mit einem Videomikroskop im Hellfeldmodus 24 h nach Kollagenaufnahme auf.
      2. Verwenden Sie Fidschi, um Bilder entweder manuell oder halbautomatisch zu analysieren. Zeichnen Sie dazu manuell den Kern und die Gesamtfläche des Sphäroids mit dem Freihandauswahlwerkzeug um und messen Sie die invasive Fläche jedes Sphäroids, indem Sie die Gesamtfläche mit der Kernfläche subtrahieren. Um die Bilder halbautomatisch zu analysieren, verwenden Sie das Makro, wie in Ergänzendem Dokument 1 angegeben, um den invasiven Bereich zu bestimmen.
  3. Migration
    1. Vorbereitung
      1. 6 Well-Platte mit Matrigel (0,2 mg/ml) in NBM für 30 min bei 37 °C beschichten, dann das Matrigel entfernen und 2 ml cNBM hinzufügen.
      2. Sphäroide in 50 l cNBM von der runden Bodengutplatte auf die 6 Wellplatte übertragen.
      3. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und warten Sie 30 min, bis die Sphäroide haften.
      4. Nach 24 h Inkubation mit 10 ng/ml von Hoechst färben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
    2. Bildaufnahme und -analyse
      1. Erhalten Sie Bilder mit einem Videomikroskop im hellen Feld. Zur Visualisierung der Hoechst-Färbung wird ein 405 nm Laser verwendet.
      2. Verwenden Sie die Fidschi-Software, um Bilder zu analysieren und das Makro auszuführen, wie in Ergänzendem Dokument 1angegeben.
        HINWEIS: Das Berühren der Unterseite des Brunnens oder das vollständige Entfernen des Überstandes beschädigt die Sphäroide. Für Kollagen Typ I Gel Handhabung, halten Sie das Gel auf Eis, um Kollagen-Polymerisation zu vermeiden, fügen Sie keine saure Komponente, weil die Änderung des pH-Werts die Kompaktheit des Gels beeinflussen, und Pipettenzellen schnell in das Kollagen, um Zelltod und den Abbau des Gels zu verhindern.

3. Fidschi-Makro

HINWEIS: Fidschi ist ein Bildanalyseprogramm, das in der öffentlichkeitspolitischen Domäne entwickelt wurde und die Entwicklung von Makros ermöglicht, um die Bildanalyse zu beschleunigen. Manuelle Analysen sind ebenfalls möglich, aber dies ist ein langsamer Prozess und kann Zuverzerrungen mit sich bringen. Bilder können per Drag-and-Drop in der Software importiert und mit dem ROI Manager Tools Plugin quantifiziert werden. Das in dieser Studie verwendete Verfahren wird im Folgenden beschrieben:

  1. Öffnen Sie das Makrofenster: Plugins | Makros | Interaktiver Dolmetscher.
  2. Kopieren und fügen Sie die folgende angepasste violette Schleife ein. Bewahren Sie die violetten Sätze auf und fügen Sie die grünen Sätze von Interesse hinzu (ergänzendes Dokument 1).
  3. Um die gesamte Serie zu analysieren, passen Sie die Parameter rot für eine bestimmte Quantifizierung an, und führen Sie das Makro mit Makros | Führen Sie Makro aus oder drücken Sie Strg+R.
  4. Überprüfen und passen Sie ggf. den Interessenbereich (ROI) manuell an.

4. Elektronenmikroskopie von Sphäroiden

HINWEIS: Die meisten der folgenden Schritte müssen in einer chemischen Haube durchgeführt werden.

  1. Fixierungsschritt
    1. Das Sphäroid mit einer geschnittenen Pipettenspitze sammeln, in ein 1,5 ml-Rohr geben und 1x mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB) waschen.
    2. Fixieren Sie das Sphäroid über Nacht bei 4 °C in 2% Glutaraldehyd/2% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M PB.
    3. Ersetzen Sie die Fixierungslösung durch eine Lösung von 1% PFA in 0,1 M PB gefolgt von der Probenvorbereitung.
  2. Probenvorbereitung
    1. Übertragen Sie die Sphäroide in ein Sieb und legen Sie sie in ein Glasbecher, um Sphäroidschäden zu vermeiden.
    2. 3x mit 0,1 M PB vorsichtig waschen.
    3. Mit Osmium für 2 h im Dunkeln brüten. Osmium auf 4% in 1% 0,1 M PB Puffer verdünnen.
    4. 3x mit 0,1 M PB vorsichtig waschen.
      1. Dehydrieren Sie wie folgt: Einweichen in 50% Ethanol für 10 min, 70% Ethanol für 10 min, 2x 90% Ethanol für 15 min, 2x 100% Ethanol für 20 min und 2x Aceton für 30 min.
    5. Inkubieren Sie die Proben in einer 50/50 Mischung aus Aceton/Harz für 2 h. Bereiten Sie in diesem Schritt das EPON-Harz vor (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
    6. Die Aceton/Harzmischung entsorgen, durch frisch zubereitetes Harz ersetzen und über Nacht brüten.
    7. Ersetzen Sie das Harz durch ein neues und brüten Zwischen 2-6 h.
    8. Die Sphäroide in Harz bei 60 °C für 48-72 h in eine Form geben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sphäroide wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet und Beobachtungen in Bezug auf Migration, Invasion, Proliferation und Mikroskopie gemacht. Zur Messung der Hypoxie in verschiedenen Bereichen der sphärischen Struktur wurde zur Bestimmung der hypoxischen Aktivität die karboxische Anhydrase IX-Färbung verwendet (Abbildung 1A-C). Weitere CAIX-positive Zellen wurden im Sphäroidzentrum beobachtet (Abbildung 1A-C). Hypoxische Zellen im Sphäroidkern neigen dazu, glykolytischer zu sein als die umgebenden. Mitochondrien können für weitere Analysen abgebildet werden, wie die Elektronenmikroskopie zeigt (Abbildung 1Ba-1Bb). Sphäroide bestehend aus 2,5 x 103,5 x 103,104oder 2 x 104 Zellen weisen einen Sphäroiddurchmesser von etwa 350, 400, 500 bzw. 650 m auf (Abbildung 2A). Sphäroide können innerhalb von 4 Tagen nach Beginn des Experiments verwendet werden (Abbildung 2B). Die Quantifizierung jedes Assays (d. h. Proliferation, Invasion, Migration) ist in Abbildung 3dargestellt. Fidschi-Makros wurden entwickelt, um die Verbreitung, Invasion oder Migration zu quantifizieren (Abbildung 3 und Ergänzendes Dokument 1).

Die Zunahme des Sphäroidkerns spiegelte die Stimulation der Zellproliferation wider (Abbildung 4A). Nach der Hemmung durch Rotonon, einem etablierten Inhibitor des Komplexes I der mitochondrialen Atemkette, wurde die überwiegende Mehrheit der ATP-Produktion in den Mitochondrien beeinträchtigt. Infolgedessen wurde die Proliferation nach 72 h um 20 % verringert (Abbildung 4A). Die Invasion des Kollagentyps I wurde durch die Subtraktion der Gesamtfläche aus dem Kernbereich berechnet. Saure Behandlung verstärkte Invasion über einen Zeitraum von 24 h (Abbildung 4B). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Chlorwasserstoffbehandlung die Migrationsfläche der Sphäroide im Vergleich zur Kontrolle um das 1,5-fache reduzierte (Abbildung 4C). Sphäroid-Dynamik wurde durch Montage für Live-Bildgebung in der UniverSlide13untersucht. Sphäroide hatten eine hohe interne Dynamik und bewegten sich schnell(Film 1 und Tracking-Analyse in Abbildung 4D).

Figure 1
Abbildung 1: Das Sphäroid ist ein relevantes Modell, um solide Tumore nachzuahmen. (A) Spheroid als runde 3D-Struktur mit verschiedenen Bereichen. (a) Ein Hellfeldbild eines P3-Sphäroids zeigt ein rundes Erscheinungsbild mit einem dichten zentralen Bereich. Skala = 100 m (b) Schematische Darstellung angepasst von Hirschhaeuser et al.6 zeigt dieO2,CO2, Metaboliten und Katabolitgradienten im Sphäroid. (c) Linkes Panel: konfokales Bild eines sphäroiden Sphäroids, das mit DAPI (blau) und mit Antikörpern gegen carboxische Anhydrase IX (grün) gefärbt ist. Rechtes Panel: Quantifizierung der Fluoreszenz aus dem gestrichelten Bereich. Skala = 100 m (B) Elektronenmikroskopiebilder mit abgegrenzten Mitochondrien (gestrichelte Linien). Große Mitochondrien sind im Ruhebereich zu sehen, während sie im Verbreitungsgebiet kleiner sind. Skala = 250 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Allgemeine Sphäroid-Vorbereitungsschritte. (A) Erzeugung menschlicher P3-Glioblastom-Sphäroide. Repräsentative Bilder befinden sich auf dem linken Panel und entsprechende Proliferationsanalysen auf dem rechten Panel. Bei 24 h bildeten die P3-Zellen dichte Sphäroide. Die anfängliche Anzahl der Zellen bestimmt die Größe der Sphäroide. Maßstabsleiste = 250 m (B) Schematische Darstellung der einfachen Protokolle zum Studium von Proliferation, Invasion oder Migration. Sphäroide unter verschiedenen Bedingungen: (a) In serumfreiem Medium für Tumorwachstum, (b) In Kollagenmatrix zur Erleichterung der einzelzelligen Invasion und (c) Auf Matrigel-Beschichtung für die Zellmigration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Quantifizierung von In-vitro-Assays mit Fidschi-Software. Darstellung der Regionen von Interesse (ROI), die mit Fidschi erzielt wurden. Der Kernbereich ist rot dargestellt und die Gesamtfläche, die den Kernbereich enthält, in Gelb. Der invasive Bereich entspricht der Subtraktion der Gesamtfläche aus dem Kernbereich. (A) Proliferationstest. (B) Invasions-Assay im Kollagengel bei Hellfeldkäufen. (C) Migrationstest auf Matrigel-Beschichtung durch Fluoreszenzerwerb. Nuclei waren mit DAPI befleckt, in blau. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Glioblastom P3 Sphäroid in Proliferations-, Invasions- oder Migrationstests. (A) Proliferationstest. Linkes Panel: Repräsentative Bilder mit DMSO als Kontrolle oder mit 20 M Roton (Atemkettenkomplex I-Hemmer) zum Zeitpunkt 0 oder 72 h. Rechtes Bedienfeld: Sphäroid-Bereichsquantifizierung wird als gestrichelte Linien in den Bildern dargestellt. Skala = 250 m . (B) Invasions-Assay in der Kollagenmatrix. Linkes Panel: Repräsentative Bilder mit oder ohne 20 mM Chlorwasserstoff, zur Zeit 0 oder 24 h. Rechtes Panel: Quantifizierung invasiver Bereiche. Skala = 100 m . (C) Migrationstest auf Matrigel-Beschichtung. Linkes Bedienfeld: Repräsentative Bilder im Hellfeldmodus zum Zeitpunkt 0 oder 24 h. Vergrößerte Bereiche werden in den unteren Panels dargestellt. Rechtes Panel: Quantifizierung von Migrationsgebieten. Skala = 250 m. (D) Z-Stack-Darstellung des Sphäroids (40 m Schritt) in (a) Sphäroid-Dynamik über 18 h (Bild mit 3 h Intervall) in (b). Zellen stabil ausgedrückt Kern mCherry (orange) und zytoplasmatische GFP (blau). Skala = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Movie 1
Film 1: P3 Sphäroid-Dynamik über 18 h aufgezeichnet (alle 30 min abgebildet). Skalenbalken = 100 m. Der Film stellt einen zusammengeführten Z-Stack im Laufe der Zeit mit einem Z-Schritt von 5 m für ein ungefähres Gesamtvolumen von 150 m dar. Zellen wurden mit Lentivirus infiziert, um NLS:mCherry (Kerne sind orange) und mit zytoplasmatischem GFP (blaue Farbe) auszudrücken. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Ergänzendes Dokument 1: Fidschi-Makro zur Analyse von Invasion, Proliferation und Migration von 3D-Sphäroid. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tumor-Sphäroid-Assays sind gut geeignet, um Tumoreigenschaften wie Proliferation, Invasion und Migration sowie Zelltod und Medikamentenreaktion zu untersuchen. Krebszellen dringen in die 3D-Matrix ein und bilden einen invasiven Mikrotumor, wie in Abbildung 4B,Czu sehen ist. Während des invasiven Prozesses können Matrix-Metalloproteinasen (MMP) Matrizen, die Tumorzellen13umgeben, und MMP-Inhibitoren (z. B. GM6001 oder Rebimastat) die Zellinvasion beeinträchtigen, aber nicht die Migration14. Migration und Invasion beinhalten überlappende, aber getrennte molekulare Ereignisse15, die in unserem Sphäroid-Assay untersucht werden können. Dazu können spezifische Signalwege entweder auf genetischer Ebene oder durch pharmakologische Hemmung gezielt werden.

Glioblastome sind dafür bekannt, durch verschiedene Prozesse (z.B. Co-Option, Invasion des weißen Materietrakts, interstitielle Invasion) ausgiebig in das umgebende Gewebe einzudringen.16. Wir haben vor kurzem zwei neue Mechanismen der Glioblastom-Invasion9,12,17beschrieben. Insbesondere untersuchten wir matrizelluläre Thrombospondin-1 (TSP1) und zeigten, dass es an der Tumorzellinvasion durch die Aktivierung von CD47 in Tumorzellen12beteiligt ist. Darüber hinaus entdeckten wir mit einem proteomischen Ansatz die unerwartete Rolle von PLP1 und DNM1 in der GBM-Invasion17. In diesen Studien wurden 3D-Invasions-Assays erfolgreich mit oder ohne pharmakologische Obstruktion von TSP1, PLP1 oder DNM1 verwendet. Neben der pharmakologischen Obstruktion haben wir auch gezeigt, dass die Säurebehandlung mit Chlorwasserstoff die Invasion im 3D-Test beeinflusst. Es ist bekannt, dass Tumorazidose aktiviert eine Reihe von Signalwegen, einschließlich Stoffwechselwege (Glykolyse), Wachstumsfaktoren wie TGF, und hemmt die Immunantwort5.

Dreidimensionale Kulturen bieten eine physiologisch relevantere Umgebung als 2D-Kulturen, und viele molekulare und metabolische Parameter können unterschiedlich reguliert werden. Daher kann die pharmakologische Modulation eine andere Wirkung haben. Folglich können neben der Standardimmunhistologie auch metabolische Ereignisse in der 3D-Kultur mit Sonden wie 2-DG-IR untersucht werden. Um diese Befunde zu bestätigen, kann in diesem Zusammenhang auch der Elektronentransportketten-I-Hemmer verwendet werden.

Darüber hinaus eignet sich das 3D-Kultursystem auch gut für die Untersuchung dynamischer Prozesse unter Verwendung von Live-Bildgebung unter basalen Bedingungen oder in Gegenwart von Reizen oder pharmakologischen Hinweisen.

Bei der Durchführung der in diesem Artikel beschriebenen Verfahren sind folgende kritische Schritte zu berücksichtigen: 1) Der Sphäroiddurchmesser sollte 400 m nicht überschreiten, um Nekrose zu vermeiden; 2) Die Quantifizierung der Invasion mit Fidschi-Software muss sorgfältig kalibriert und durchgeführt werden, wie in der detaillierten Beschreibung des Verfahrens angegeben.; 3) Die Gelsteifigkeit muss geeignet sein, um das Sphäroid in einer stabilen Konfiguration zu halten; 4) Der pH-Wert muss kontrolliert werden, da ein sehr saurer pH-Wert den Invasionsprozess behindert.

Eine Einschränkung des in diesem Artikel beschriebenen Sphäroidsystems ist das Fehlen der gesamten Tumormikroumgebung. Wir erkennen an, dass die verwendete Matrix nicht vollständig die stroma darstellt, die im Glioblastom gefunden wird. Kollagene sind jedoch Teil der Gehirnmatrix und wir wollten einen gebrauchsfertigen Assay entwickeln, der in jedem Labor verwendet werden kann. Dennoch können zukünftige Experimente auch zusätzliche Matrixkomponenten sowie zelluläre Elemente, einschließlich stromaler und Immunzellen, umfassen. Eine weitere Komplexitätsstufe ist die Einbeziehung neuronaler Komponenten, aber diese Experimente müssen sorgfältig kalibriert und entworfen werden.

Abschließend glauben wir, dass unser Sphäroid-3D-System und die Analysewerkzeuge, die wir in diesem Artikel zur Verfügung stellen, für Forscher nützlich sein können, insbesondere bei der Untersuchung der Entwicklung von Hirntumoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon ist Stipendiat des Universitätsklinikums Toulouse (CHU Toulouse).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).

Tags

Krebsforschung Ausgabe 158 Glioblastom patientenabgeleitete Zelle Sphäroid Invasion Migration Proliferation In-vitro-Modelle
Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,… More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter