Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,5,6, 1,2, 1,2,4
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Summary

כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג'י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.

Abstract

שתי ממדיות (2D) תרביות תאים לא לחקות את הגידול vivo בסדר משביע רצון. לכן, מודלים תלת ממדיים (3D) תרבות ספרואיד פותחו. מודלים אלה עשויים להיות חשובים במיוחד בתחום של נוירולוגיה-אונקולוגיה. אכן, גידולים במוח יש נטייה לפלוש לסביבת המוח הבריא. אנו מתארים זאת באופן אידיאלי 3d גליובלסטומה המבוססת על מבוססי שפיתחנו לחקור את הפלישה הגידול. אנו מספקים את כל הפרטים הטכניים והכלים האנליטיים כדי לבצע בהצלחה את השיטת העבודה.

Introduction

ברוב המחקרים באמצעות קווי תא ראשי או מסחרית, בחני מבוצעים על תאים שגדלו על משטחי פלסטיק כמו תרבויות דופלקס. ניהול תרבות התא ב-2D מייצג חסרונות, כפי שהוא אינו מחקה בסביבת תא vivo 3D. בתרבויות דו-ממדיות, כל משטח התא הוא ישירות במגע עם המדיום, שינוי צמיחת התאים ושינוי זמינות התרופה. יתר על כן, משטח פלסטיק לא פיזיולוגי מפעיל בידול תא1. מודלים תלת ממדיים של תרבות פותחו כדי להתגבר על הקשיים הללו. יש להם את היתרון של לחקות את האדריכלות הרב-תאיים ואת טרוגניות של גידולים2, ולכן יכול להיחשב למודל רלוונטי יותר עבור גידולים מוצק3. המבנה המורכב של הספרואידים תורם להערכה טובה יותר של חדירה לסמים והתנגדות4. הגידול טרוגניות ב ספרואיד משפיע על הדיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים, ואת התגובה של סוכני תרופתי (איור 1A). דיפוזיה של חמצן משתנה כאשר גודל ספרואיד מגיע 300 μm, גרימת סביבה ארוי במרכז הספרואיד (איור 1A, C). מטבוליטים הם גם פחות חודר דרך שכבות התא והתגובות מטבולית לפצות להתרחש5. כאשר קוטרו של מגדיל ספרואיד, ליבות נקרוטיות ניתן לצפות, עוד מאפיינים לחקות המצויים בסוגי סרטן מוצק רבים, כולל סרטן המוח האגרסיבי גליובלסטומה (GBM)6.

מספר הפלישה 2d או 3d שאומר עבור gliנובלסטומה דווחו בספרות7,8. מימד דו-מימדי הם בעיקר לחקר הפלישה במישור אופקי על שכבת מטריצה דקה או בתוך שיטת הקאמרית Boyden9. תלת מימדי בחני שתוארו עם תרבויות תלת-ממד ספרואיד באמצעות קווי התאים הקלאסיים גליובלסטומה10. גרסאות מורכבות יותר מיוצגים על ידי פלישה של אורגנואידים המוח על ידי spheroids הגידול בתרבויות העימות11. עם זאת, עדיין חשוב לפתח שיטת קל לשימוש ושימוש בלתי זמין לכל מעבדה. פיתחנו פרוטוקול לייצר תאים של גזע גלנובלסטומה מדגימות המטופל. הקוונפיקציה של מספר אלה ניתן לניהול בקלות ודורשת רק תוכנה מקוונת גישה לפתוח. בקצרה, חתיכות הגידול הם חותכים לחתיכות קטנות מתעכל באמצעות אנזימטי. תאים בודדים הנגזרים מהעיכול מעובדים במדיום נוירו-בסיס. לאחר 4-7 ימים, מבנים ספרואיד יוצרים באופן ספונטני. עם השרשה הגולגולתית בדגמי עכברים, הם יוצרים גידולים המציגות ליבה נקרוטיק מוקפת בתאי מדומה-פאליפורם12. זה דומה מאוד למאפיינים המצויים בחולים GBM.

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו כדי לייצר spheroids מתוך מספר נחוש של תאים כדי להבטיח התוכסות. ניתן להשתמש בשני מטריצות משלימות למטרה זו: מטריצות וסוג קולגן I. מטריצות מועשר בגורמי גדילה ומחקה את קרום המוח הבזתי הנדרש לתא המצורף והגירה. מצד שני, קולגן סוג אני, אלמנט מבנית של משתית, הוא הנפוץ ביותר fibrillary מטריקס מטריצה והוא משמש הפלישה התא assays. להלן, אנו ממחישים את המודל הספרואיד שלנו על-ידי ביצוע הגירה והפצת מוסר. ניתוח נעשה לא רק בנקודות בזמן קבוע אלא גם על ידי ניטור התרחבות ספרואיד ותנועת התאים על ידי הדמיה חיה. יתר על כן, המיקרוסקופיה אלקטרונית נעשתה כדי להמחיש פרטים מורפולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הסכמה בכתב מושכלת הושגה מכל המטופלים (מבית החולים האוקלאני, ברגן, נורבגיה על פי תקנות וועדת האתיקה המקומיות). הפרוטוקול שלנו עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המוסד האנושי.

1. הדור של הגידולים הסרטניים בגודל אחיד

הערה: תאים כמו גזע הם מתורבתים בינונית נוירובסיס משלימה עם תוספת B27, הפארין, FGF-2, פניצילין, ו סטרפטומיצין, כפי שמתואר בסעיפים הקודמים12. תאים אלה יוצרים באופן ספונטני את הספאידים בתרבות.

  1. לשטוף את התאים הסרטניים עם מלוחים 5 מ ל פוספט באגירה (PBS) ו הדגירה של תאים עם 0.5-1 mL האנזים הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות ב 37 ° c.
  2. לשטוף עם 4-4.5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ ל של הצמיחה המלאה בינונית (מדיום neurobasal סיס מלא, cNBM).
  3. ספור את התאים תוך שימוש בטכניקת ספירה אוטומטית עם טרי, כחול ושקופית תא ספירת תאים.
  4. כדי ליצור 100 spheroids עם 104 תאים לספרואיד (לפי גודל מועדף), לערבב 106 תאים ב 8 מ ל Nbm עם 2 מ ל של 2% מתילצלולוזה.
  5. להעביר את ההשעיה אל מיכל סטרילי מערכת ולוותר 100 μL/ובכן עם פיפטה רב-ערוצית לתוך הלוח 96 בסיבוב התחתון היטב.
  6. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2 ו 95% לחות. שוויון בגדלים שווים יהיה ליצור וניתן להשתמש בהם לאחר 3-4 ימים.

2. ניסויים תלת-ממדיים

  1. תפשטות
    1. כנה
      1. להשעות מעכבי (למשל, rotenone כמו באיור 4א) וכימיקלים ב 100 μl של בינוני ולהוסיף 100 μl של בינוני בכל טוב (כלומר, אחד ספרואיד לכל טוב).
      2. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2, ו 95% לחות.
    2. רכישת תמונה וניתוח
      1. צלם תמונות עם מיקרוסקופ וידאו ב ברייטפילד כדי ליצור סדרה של תנאים ב-T0 והמועדים הבאים צפויים.
      2. השתמש בפיג כדי לנתח תמונות באופן ידני או באופן חצי אוטומטי. כדי לעשות זאת באופן ידני, לצייר עיגול סביב הליבה ספרואיד עם הכלי בחירה ביד חופשית ולמדוד את האזור של כל ספרואיד. כדי לנתח את התמונות באופן חצי אוטומטי, השתמש במאקרו המוצג במסמך משלים 1 עם האזור המרכזי בלבד.
  2. פלישה
    1. כנה
      1. הכן את מטריצת קולגן בשפופרת על הקרח עם סוג אני קולגן ב 1 מ"ג/mL הריכוז הסופי, 1x PBS, 0.023 החמישה עשרקולגן, 1 M נתרן הידרוקסיד, ו-H סטרילי2O. הפתרון על הקרח עבור 30 דקות.
      2. לאסוף spheroids מן התחתון העגול צלחת הבאר ב 500 μL צינורות ולשטוף 2x עם 200 μL 1x PBS.
      3. פיפטה את הספרואידים בקפידה לתוך 100 μL של מטריצת קולגן ולהכניס במרכז באר בצלחות רגילות 96 טוב.
      4. דגירה ג'ל קולגן עבור 30 דקות ב 37 ° צ' ולאחר מכן להוסיף cNBM על גבי ג'ל. מעכבי או מפעילים (למשל, מימן כלוריד כפי שמוצג באיור 4ב, 4c) ניתן להוסיף למדיום בשלב זה.
    2. רכישת תמונה וניתוח
      1. צלם תמונות ברצף עם מיקרוסקופ וידאו במצב ברייטפילד 24 שעות לאחר הכללת קולגן.
      2. השתמש בפיג כדי לנתח תמונות באופן ידני או באופן חצי אוטומטי. כדי לעשות זאת באופן ידני, לצייר סביב הליבה ואת האזור הכולל של הספרואיד עם הכלי בחירה ביד חופשית ולמדוד את האזור פולשני של כל ספרואיד על ידי הפחתה באזור כולל עם אזור הליבה. כדי לנתח את התמונות באופן חצי אוטומטי, השתמש במאקרו כפי שמצוין במסמך המשלים 1 כדי לקבוע את האזור הפולשני.
  3. העברה
    1. כנה
      1. מעיל לוחית 6 היטב עם מטריצות (0.2 mg/mL) ב NBM עבור 30 דקות ב 37 ° c, לאחר מכן להסיר את מטריצות ולהוסיף 2 מ ל cNBM.
      2. העברת spheroids לתוך 50 μL של cNBM מצלחת התחתונה העגולה היטב עד 6 צלחת הבאר.
      3. מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' ולחכות 30 דקות כדי spheroids לדבוק.
      4. לאחר 24 שעות של דגירה, כתם עם 10 ng/mL של Hoechst ו הדגירה 30 דקות ב 37 ° c.
    2. רכישת תמונה וניתוח
      1. להשיג תמונות באמצעות מיקרוסקופ וידאו ברייטפילד. לייזר 405 ננומטר משמש להדמיה של כתמים מואכסט.
      2. השתמש בתוכנת פיג'י כדי לנתח תמונות ולהפעיל את המאקרו כפי שמצוין במסמך המשלים 1.
        הערה: נגיעה בתחתית הבאר או הסרת לחלוטין את נזקי הסופרנאנט. עבור סוג קולגן אני ג'ל טיפול, לשמור על הג על הקרח כדי למנוע הקולגן פולימור, לא להוסיף רכיב חומצי כי השינוי ב-pH ישפיע על הקומפקטיות של הג, ו פיפטה תאים במהירות לתוך הקולגן כדי למנוע את המוות התאים ואת ההשפלה של ג'ל.

3. מאקרו פיג'י

הערה: פיג'י היא תוכנית ניתוח תמונה שפותחה בתחום הציבורי המאפשר פיתוח של פקודות מאקרו כדי להאיץ את ניתוח התמונה. ניתוח ידני אפשרי גם, אבל זהו תהליך איטי והוא עשוי להציג הטיות. ניתן לייבא תמונות על-ידי גרירה ושחרור בתוכנה וכימות עם תוסף מנהל הכלים של ROI. הנוהל המשמש במחקר זה מתואר להלן:

  1. פתח את חלון המאקרו: תוספים | פקודות מאקרו | מתרגם אינטראקטיבי.
  2. העתק והדבק את הלולאה הסגולה הבאה שהותאמה. שמור על המשפטים הסגולים והוסף את משפטים הריבית הירוקים (מסמך משלים 1).
  3. כדי לנתח את הסידרה כולה, התאימו את הפרמטרים באדום לקוונפיקציה מסוימים והפעל את המאקרו באמצעות פקודות מאקרו | הפעל מאקרו או הקש Ctrl + R.
  4. בדוק ובמידת הצורך, התאם ידנית את אזור הריבית (ROI).

4. מיקרוסקופ אלקטרוני של מספרואידים

הערה: יש לבצע את רוב הצעדים הבאים במכסה כימי.

  1. שלב קיבוע
    1. לאסוף את הספרואיד עם טיפ חיתוך לחתוך, לשים אותו בצינור 1.5 mL, ולשטוף 1x עם 0.1 M פוספט מאגר (PB).
    2. תקן את הלילה הספרואיד ב -4 ° c ב-2% גלוטרלדהיד/2% פאראפורמלדהיד (בכיוון השני) ב-0.1 M PB.
    3. החליפו את פתרון הקיבעון בתמיסה של 1% בכיוון התנועה ב0.1 M PB ולאחריה הכנה לדוגמה.
  2. הכנה לדוגמא
    1. להעביר את הספרואידים לתוך מסננת ולשים אותם בתוך גביע זכוכית כדי למנוע נזק כלאיד.
    2. שטוף בזהירות 3x עם 0.1 M PB.
    3. , מיכל הלילה. דלל את אוסמיום ל 4% ב 1% 0.1 M PB מאגר.
    4. שטוף בזהירות 3x עם 0.1 M PB.
      1. הדמיים כדלקמן: להשרות ב-50% אתנול עבור 10 דקות, 70% אתנול עבור 10 דקות, 2x 90% אתנול עבור 15 דקות, 2x 100% אתנול עבור 20 דקות, ו-2x אצטון עבור 30 דקות.
    5. מודטה את הדגימות בתערובת 50/50 של אצטון/שרף עבור 2 h. במהלך שלב זה, להכין את שרף EPON (להטביע-812:11.25 g; DDSA: 9 גרם; NMA: 4.5 g).
    6. להיפטר אצטון/שרף תערובת, להחליף עם שרף שהוכן טרי, הדגירה הלילה.
    7. החלף את השרף על ידי אחד חדש ו-דגירה בין 2-6 h.
    8. מוסיפים את הספרואידים בשרף לתוך עובש ב 60 ° c עבור 48-72 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הספרואידים הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקולים ותצפיות נעשו לגבי הגירה, פלישה, התפשטות ומיקרוסקופ. כדי למדוד היפוקסיה באזורים שונים של המבנה כדורית, כתמים carboxic התשיעי המשמש לקביעת פעילות ארוי (איור 1א-ג). תאים CAIX-חיוביים נוספים נצפו במרכז ספרואיד (איור 1א-ג). תאים ארוי ממוקם בליבת ספרואיד נוטים להיות גליקוליטיק יותר מאשר אלה שמסביב. ניתן להציג את המיטוסקופיה לניתוח נוסף כפי שמוצג על ידי אלקטרון מיקרוסקופ (איור 1Ba-1bb). Spheroids המורכב 2.5 x 103, 5 x 103, 104, או 2 x 104 תאים התערוכה קוטר ספרואיד של כ 350, 400, 500, או 650 יקרומטר בהתאמה (איור 2א). ניתן להשתמש בספרואידים תוך 4 ימים לאחר תחילת הניסוי (איור 2ב'). הקוונפיקציה של כל שיטת (דהיינו, התפשטות, פלישה, הגירה) מוצגת באיור 3. פקודות מאקרו של פיג'י פותחו כדי לכמת התפשטות, פלישה או הגירה (איור 3 ומסמך משלים 1).

הגידול של הליבה הספרואיד שיקפה את גירוי התפשטות התאים (איור 4א). עם עיכוב על ידי rotenone, מעכב מבוסס של מורכבות אני של שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי, הרוב המכריע של הייצור ATP במיטוקומפלקס היה בסכנה. כתוצאה מכך, התפשטות הופחת 20% אחרי 72 h (איור 4א). הפלישה של סוג קולגן הייתי מחושב על ידי החיסור של האזור הכולל מהאזור המרכזי. טיפול חומצי הפלישה משופרת על פני תקופה של 24 שעות (איור 4ב). יתר על כן, מצאנו כי טיפול מימן כלוריד הפחיתה את אזור הנדידה של spheroids על ידי 1.5 קיפול לעומת שליטה (איור 4ג). דינמיקה ספרואיד נחקרה על ידי הרכבה עבור הדמיה חיה ב-UniverSlide13. לספרואידים הייתה דינמיקה פנימית גבוהה והועברה במהירות (סרט 1 וניתוח מעקב באיור 4ד).

Figure 1
איור 1: ספרואיד הוא מודל רלוונטי לחקות גידולים מוצקים. (א) ספרואיד כמבנה עגול תלת-ממדי עם אזורים שונים. (א) תמונה ברייטפילד של P3 ספרואיד מציגה מראה עגול עם אזור מרכזי צפוף. קנה מידה = 100 μm. (ב) ייצוג סכמטי המותאם מ-הירשהמשתמש ואח '6 מראה O2, CO2, מטבוליט, ו catabolite מעברי הצבע ב ספרואיד. (ג) הלוח השמאלי: תמונה מיקוד של מוכתם ספרואיד עם dapi (כחול) עם נוגדנים נגד carboxic anהידרדאז התשיעי (ירוק). פאנל ימני: כימות הקרינה מהאזור המקווקו. קנה מידה = 100 μm. (ב) מיקרוסקופ אלקטרוני תמונות עם התחום (קווים מקווקווים). המיטואנטים גדולים נראים באזור השבתה הדרגתית בזמן שהם קטנים יותר באזור ההתפשטות. קנה מידה = 250 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צעדים כוללים של הכנה ספרואיד. (א) דור של האדם P3 גלינובלאידים. תמונות מייצגות נמצאות בפנל השמאלי וניתוח התפשטות מתאים בלוח הימני. בשעה 24 ה, התאים הP3 יצרו מתרואידים צפופים. המספר ההתחלתי של תאים קבע את גודל הspheroids. סרגל בקנה מידה = 250 μm. (ב) תרשים סכמטי של הפרוטוקולים קל ללמוד התפשטות, פלישה, או הגירה. Spheroids בתנאים שונים: (א) בינונית ללא סרום לגידול, (ב) קולגן מטריצה להקלה על הפלישה התא בודד, ו (ג) על ציפוי מטריצות עבור הגירה התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: כימות בדיקת מבחנה עם תוכנת פיג'י. ייצוג אזורי הריבית (ROI) המתקבלים באמצעות פיג'י. אזור הליבה מיוצג באדום ובאזור הכולל, המכיל את אזור הליבה, בצהוב. האזור הפולשני מתייחס לחיסור האזור הכולל מאזור הליבה. (א) שיטתהתפשטות. (ב) שיטת הפלישה ב ג'ל קולגן ברכישות ברייטפילד. (ג) שיטת הגירה על ציפוי מטריצות על ידי רכישת קרינה פלואורסצנטית. גרעינים היו מוכתמים DAPI, בכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: גלנובלסטומה P3 ספרואיד בהפצה, פלישה, או assays הגירה. (א) שיטתהתפשטות. החלונית השמאלית: תמונות מייצגות עם DMSO כפקד או עם 20 μM של rotenone (מתחם שרשרת הנשימה אני מעכב) בזמן 0 או 72 h. לוח ימני: קוונפיקציה של אזור ספרואיד המיוצגת כקווים מקווקווים בתמונות. קנה מידה = 250 μm. (ב) הפלישה באמצעות מטריקס קולגן. פאנל שמאלי: תמונות מייצגות עם או בלי מימן כלוריד 20 מ"מ, בזמן 0 או 24 שעות. פאנל ימני: קוונפיקציה של אזורים פולשניים. קנה מידה = 100 μm. (C) הגירה היקף על ציפוי מטריצות. החלונית השמאלית: תמונות נציג במצב ברייטפילד בזמן 0 או 24 שעות ביממה. אזורים מוגדלים מיוצגים בלוחות התחתונות. פאנל ימני: קוונפיקציה של אזורי נדידה. קנה מידה = 250 יקרומטר. (ד) Z-ייצוג מחסנית של הספרואיד (40 יקרומטר צעד) ב (a) הדינמיקה ספרואיד מעקב מעל 18 h (תמונה עם מרווח 3 h) ב (ב). תאים הביעו באופן בלתי נשכח mCherry גרעיני (כתום) ו cytoplasmic GFP (כחול). קנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Movie 1
סרט 1: P3 ספרואיד דינמי נרשם מעל 18 h (התמונה כל 30 דקות). סרגל קנה מידה = 100 μm. הסרט מייצג z-מחסנית ממוזג לאורך זמן עם Z-צעד של 5 יקרומטר עבור נפח כולל משוער של 150 יקרומטר. תאים נדבקו בווירוס כדי לבטא את ה-NLS: mcherry (גרעינים הם כתום) עם cytoplasmic gfp (צבע כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

מסמך משלים 1: מאקרו פיג'י לניתוח פלישה, התפשטות והגירה של 3d ספרואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הגידול ספרואיד בחני מותאמים היטב כדי ללמוד מאפייני הגידול כולל התפשטות, פלישה, הגירה, כמו גם מוות תאים ותגובת סמים. תאים סרטניים לפלוש מטריקס 3D ויוצרים גידול פולשני מיקרו, כפי שנראה באיור 4B, C. במהלך התהליך פולשנית, מטריצה מטאלואוטיות (MMP) לעכל מטריצות מסביב תאים סרטניים13, ו mmp מעכבי (g., GM6001 או Rebimastat) עלול לפגוע בפלישה לתא אבל לא הגירה14. ההגירה והפלישה כרוכות באירועים מולקולריים אך נפרדים, הניתניםלמחקר בתוך הסדר הספרואיד שלנו. כדי לעשות זאת, מסלולים מסוימים איתות ניתן לפלח גם ברמה הגנטית או באמצעות עיכוב תרופתי.

Glioblastomas ידועים לפלוש בהרחבה הרקמות הסובבות על ידי תהליכים שונים (למשל, שיתוף אופציה, הפלישה במערכת החומר הלבן, הפלישה ביניים)16. לאחרונה תיארנו שני מנגנונים חדשניים של הפלישה הגלינובלסטומה9,12,17. בפרט, למדנו מטריצות סלולריים thrombospondin-1 (TSP1) והראו כי הוא מעורב בפלישה תא הגידול באמצעות ההפעלה של CD47 בתאי הגידול12. יתר על כן, באמצעות גישה פרוטאומית, גילינו את התפקיד בלתי צפוי של PLP1 ו DNM1 בפלישה GBM17. במחקרים אלה, הפלישה 3d בחני שימשו בהצלחה עם או בלי חסימה פרמקולוגית של TSP1, PLP1, או DNM1. מלבד חסימה תרופתי, הצגנו גם כי טיפול בחומצה עם מימן כלוריד משפיע על הפלישה בתוך שיטת 3D. ידוע כי הרעלת הגידול מפעילה מספר מסלולים איתות, כולל מסלולים מטבולית (גליקוליזיס), גורמי גדילה כמו TGFβ, ומעכב את התגובה החיסונית5.

תרבויות תלת ממדיות מספקות סביבה פיסיולוגית יותר מאשר תרבויות דו-ממדיות, ופרמטרים מולקולריים ומטבוליים רבים עשויים להיות מוסדרים באופן שונה. לכן, לאפנון תרופתי יכול להיות השפעה שונה. כתוצאה מכך, מלבד האימונוהיסטולוגיה הסטנדרטית, ניתן גם ללמוד אירועים מטבולית בתרבות תלת-ממדית באמצעות רגשים כגון 2-DG-IR. כדי לאמת את הממצאים הללו, מתחם שרשרת התחבורה האלקטרונים שאני מעכב יכול לשמש גם בהקשר זה.

בנוסף, מערכת התרבות התלת-ממדית מתאימה גם לחקר תהליכים דינמיים באמצעות הדמיה חיה בתנאים הבזליים או בנוכחות גירויים או רמזים פרמקולוגיים.

יש לשקול את הצעדים הקריטיים הבאים בעת ביצוע ההליכים המתוארים במאמר זה: 1. הקוטר הספרואיד לא יעלה על 400 יקרומטר כדי להימנע מנמק; 2) הקוונפיקציה של הפלישה באמצעות תוכנת פיג'י יש לכייל בקפידה ולבצע כפי שצוין בתיאור המפורט של ההליך.; 3) קשיות ג'ל חייב להיות מתאים להחזיק את הספרואיד בתצורה יציבה; 4) ערך ה-pH חייב להיות נשלט, כמו pH חומצי מאוד לעכב את תהליך הפלישה.

מגבלה אחת של מערכת ספרואיד המתואר במאמר זה הוא חוסר הסביבה המיקרו של הגידול המלא. אנו מכירים בעובדה שמטריקס המשמש לא מייצג במלואו את הסטרומה שנמצאה בגלינובלסטומה. עם זאת, collagens הם חלק מטריצת המוח ורצינו לפתח מוכן ונוח לשימוש באופן שניתן להשתמש בו בכל מעבדה. עם זאת, ניסויים עתידיים עשויים לכלול גם רכיבי מטריצה נוספים, כמו גם אלמנטים סלולאריים, כולל סטרומה ותאים חיסוניים. רמה נוספת של מורכבות היא הכללה של רכיבים עצביים, אבל ניסויים אלה חייבים להיות מכויל בקפידה ומעוצב.

לסיכום, אנו מאמינים כי מערכת 3D ספרואיד שלנו ואת הכלים האנליטיים שאנו מספקים במאמר זה עשוי להיות שימושי עבור החוקרים, במיוחד במחקר התפתחות הגידול במוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre הסרטן (הקומיא דה לה גירדה et דה לה Charente-ימית). Joris Guyon הוא מקבל התחברות מבית החולים באוניברסיטת טולוז (CHU טולוז).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).

Tags

מחקר הסרטן סוגיה 158 גלינובלסטומה החולה הנגזר התא ספרואיד פלישה הגירה התפשטות במודלים חוץ גופית
מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,… More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter