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Cancer Research

ग्लियोब्लास्टोमा के लिए एक 3 डी स्फेरॉइड मॉडल

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,5,6, 1,2, 1,2,4
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Summary

यहां, हम ग्लियोब्लास्टोमा के लिए एक आसान-से-उपयोग आक्रमण परख का वर्णन करते हैं। यह परख ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है। आक्रमण, प्रवास और प्रसार के आसान मात्राकरण के लिए एक फिजी मैक्रो भी वर्णित है।

Abstract

दो आयामी (2डी) सेल संस्कृतियां वीवो ट्यूमर विकास में संतोषजनक रूप से नकल नहीं करती हैं। इसलिए, त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति स्फेरॉइड मॉडल विकसित किए गए थे। ये मॉडल न्यूरो ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकते हैं। दरअसल, ब्रेन ट्यूमर स्वस्थ मस्तिष्क के वातावरण पर आक्रमण करने की प्रवृत्ति है। हम यहां एक आदर्श 3 डी ग्लियोब्लास्टोमा स्फेरॉइड आधारित परख का वर्णन करते हैं जिसे हमने ट्यूमर आक्रमण का अध्ययन करने के लिए विकसित किया है। हम इस परख को सफलतापूर्वक करने के लिए सभी तकनीकी विवरण और विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करते हैं।

Introduction

प्राथमिक या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइनों का उपयोग करके अधिकांश अध्ययनों में, प्लास्टिक की सतहों पर मोनोलेयर संस्कृतियों के रूप में उगाई जाने वाली कोशिकाओं पर परख किया जाता है। 2डी में सेल संस्कृति का प्रबंधन नुकसान का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि यह वीवो 3 डी सेल वातावरण में नकल नहीं करता है। 2डी संस्कृतियों में, पूरी कोशिका सतह सीधे माध्यम के संपर्क में है, सेल विकास में फेरबदल और दवा की उपलब्धता को संशोधित करती है। इसके अलावा, गैर-शारीरिक प्लास्टिक की सतह सेल भेदभाव1को ट्रिगर करती है। इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए त्रिआयामी संस्कृति मॉडल विकसित किए गए हैं। उन्हें बहुकोशिकीय वास्तुकला और ट्यूमर2की विषमता की नकल करने का लाभ मिलता है और इस प्रकार ठोस ट्यूमर3के लिए एक अधिक प्रासंगिक मॉडल माना जा सकता है । स्फेरॉइड की जटिल आकृति विज्ञान दवा तपस्या और प्रतिरोध4का बेहतर मूल्यांकन करने में योगदान देता है । स्फेरॉइड में ट्यूमर विषमता ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के प्रसार को प्रभावित करती है, और औषधीय एजेंटों(चित्रा 1ए)की प्रतिक्रिया। जब स्फेरॉइड आकार 300 माइक्रोन तक पहुंचता है, तो ऑक्सीजन का प्रसार बदल जाता है, जो स्फेरॉइड(चित्रा 1A, C)के केंद्र में एक हाइपोक्सिक वातावरण को प्रेरित करता है। मेटाबोलाइट्स भी कोशिका परतों के माध्यम से कम मर्मज्ञ होते हैं और मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं की भरपाई करते हैं5. जब स्फेरॉइड का व्यास बढ़ता है, तो परिगलित कोर देखे जा सकते हैं, और कई ठोस कैंसर में पाई जाने वाली विशेषताओं की नकल करते हैं, जिसमें आक्रामक मस्तिष्क कैंसर ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम)6शामिल हैं।

ग्लियोब्लास्टोमा के लिए 2डी या 3डी आक्रमण के कई परख साहित्य7,8में सूचित किए गए हैं । द्वि-आयामी परख मुख्य रूप से एक पतली मैट्रिक्स परत पर या एक Boyden चैंबर परख9में एक क्षैतिज विमान में आक्रमण का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं । शास्त्रीय ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों10का उपयोग कर3 डी स्फेरॉइड संस्कृतियों के साथ त्रि-आयामी परखों का वर्णन किया गया है। टकराव संस्कृतियों11में ट्यूमर स्फेरॉइड द्वारा मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड के आक्रमण द्वारा अधिक जटिल वेरिएंट का प्रतिनिधित्व किया जाता है । हालांकि, किसी भी प्रयोगशाला के लिए उपलब्ध एक आसान-से-उपयोग और प्रजनन परख विकसित करना अभी भी महत्वपूर्ण है। हमने रोगी के नमूनों से ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। इन परखों का परिमाणीकरण आसानी से प्रबंधनीय है और केवल खुली पहुंच ऑनलाइन सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है । संक्षेप में, ट्यूमर के टुकड़ों को छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है और एंजाइमैटिक रूप से पचाया जाता है। पाचन से प्राप्त एकल कोशिकाओं की खेती न्यूरोबेसल माध्यम में की जाती है। 4-7 दिनों के बाद, स्फेरॉइड संरचनाएं अनायास रूप में बनती हैं। चूहों के मॉडल में इंट्राक्रैनियल प्रत्यारोपण पर, वे छद्म-पालिसडिंग कोशिकाओं12से घिरे एक परिगलित कोर का प्रदर्शन करने वाले ट्यूमर बनाते हैं। यह बारीकी से जीबीएम रोगियों में पाया विशेषताओं जैसा दिखता है।

इस लेख में, हम प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की एक निर्धारित संख्या से स्फेरॉइड का उत्पादन करने के लिए अपने प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस उद्देश्य के लिए दो पूरक मैट्रिस का उपयोग किया जा सकता है: मैट्रीगेल और कोलेजन प्रकार I. मैट्रीगेल विकास कारकों में समृद्ध है और सेल लगाव और प्रवास के लिए आवश्यक स्तनधारी बेसल झिल्ली की नकल करता है। दूसरी ओर, कोलेजन प्रकार I, स्ट्रोमा का एक संरचनात्मक तत्व, सबसे आम फाइब्रिलेरी एक्स्सेल्युलर मैट्रिक्स है और इसका उपयोग सेल आक्रमण परखों में किया जाता है। इसके साथ ही, हम माइग्रेशन और प्रसार परख ों का प्रदर्शन करके अपने जीबीएम स्फेरॉइड मॉडल को दर्शाते हैं। विश्लेषण न केवल निश्चित समय बिंदुओं पर बल्कि लाइव इमेजिंग द्वारा स्फेरॉइड विस्तार और सेल आंदोलन की निगरानी करके भी किया गया था। इसके अलावा, रूपात्मक विवरणों की कल्पना करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की गई थी।

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Protocol

सूचित लिखित सहमति सभी रोगियों से प्राप्त की गई थी (हौकेलैंड अस्पताल, बेरगेन, नॉर्वे से स्थानीय आचार समिति के नियमों के अनुसार)। हमारा प्रोटोकॉल हमारी संस्था की मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशा-निर्देशों का पालन करता है ।

1. एक समान आकार ट्यूमर स्फेरॉइड की पीढ़ी

नोट: स्टेम की तरह कोशिकाओं को न्यूरोबेसल माध्यम में B27 पूरक, हेपरिन, FGF-2, पेनिसिलिन, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरित किया जाता है, जैसा कि पिछले लेख12में वर्णित है। ये कोशिकाएं अनायास संस्कृति में स्फेरॉइड बनाती हैं।

  1. ट्यूमर कोशिकाओं को 5 मिलीस फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) से धोएं और कोशिकाओं को 0.5-1 मिलीएल विच्छेदन एंजाइम (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. 4-4.5 mL PBS के साथ धोएं और पूर्ण विकास माध्यम (पूर्ण न्यूरोबेसल मध्यम, सीएनबीएम) के 10 एमएल जोड़ें।
  3. ट्राइपैन ब्लू और सेल काउंटिंग चैंबर स्लाइड के साथ स्वचालित गिनती तकनीक का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  4. प्रति स्फेरॉइड (पसंदीदा आकार के अनुसार)104 कोशिकाओं के साथ 100 स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए, एनबीएम के 8 मिलील में 106 कोशिकाओं को 2% मिथाइलसेल्यूलोज के 2 मिलील के साथ मिलाएं।
  5. निलंबन को बाँझ प्रणाली कंटेनर में स्थानांतरित करें और एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ 100 माइक्रोन/वेल को 96 अच्छी तरह गोल नीचे की प्लेट में वितरित करें।
  6. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करते हैं। बराबर आकार के स्फेरॉइड बनेंगे और 3-4 दिनों के बाद उपयोग किए जा सकते हैं।

2. त्रि-आयामी प्रयोग

  1. प्रसार
    1. तैयारी
      1. अवरोधकों को निलंबित करें (उदाहरण के लिए, चित्र4एमें रोटेनोन) और मध्यम के 100 माइक्रोन में रसायन और प्रत्येक कुएं में मध्यम के 100 माइक्रोन में जोड़ें (यानी, प्रति अच्छी तरह से एक स्फेरॉइड)।
      2. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2और 95% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करते हैं।
    2. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण
      1. टी0 में स्थितियों की एक श्रृंखला बनाने के लिए ब्राइटफील्ड में एक वीडियो माइक्रोस्कोप के साथ तस्वीरें ले लो और निम्नलिखित समय की उम्मीद है।
      2. चित्रों का विश्लेषण करने के लिए फिजी का उपयोग करें या तो मैन्युअल रूप से या अर्धस्वचालित तरीके से। मैन्युअल रूप से ऐसा करने के लिए, फ्रीहैंड चयन उपकरण के साथ स्फेरॉइड कोर के चारों ओर एक चक्र बनाएं और प्रत्येक स्फेरॉइड के क्षेत्र को मापें। अर्धस्वचालित तरीके से छवियों का विश्लेषण करने के लिए, पूरक दस्तावेज़ 1 में दिखाए गए मैक्रो का उपयोग केवल/कोर क्षेत्र के साथ करें ।
  2. आक्रमण
    1. तैयारी
      1. 1 मिलीग्राम/mL अंतिम एकाग्रता, 1x PBS, 0.023xVकोलेजन,1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड, और बाँझ एच2ओ इनक्यूबेट 30 मिन के लिए बर्फ पर समाधान के साथ बर्फ पर एक ट्यूब में कोलेजन मैट्रिक्स तैयार करें ।
      2. 500 माइक्रोन ट्यूब में राउंड बॉटम वेल प्लेट से स्फेरॉइड एकत्र करें और 200 माइक्रोन 1x पीबीएस के साथ 2x धोएं।
      3. स्फेरॉइड को कोलेजन मैट्रिक्स के 100 माइक्रोन में ध्यान से पिपेट करें और सामान्य 96 अच्छी प्लेटों में एक कुएं के केंद्र में डालें।
      4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए कोलेजन जेल को इनक्यूबेट करें और फिर जेल के शीर्ष पर सीएनबीएम जोड़ें। इस चरण में अवरोधकया एक्टिवेटर (जैसे, चित्र4बी, 4 सीमें दिखाए गए हाइड्रोजन क्लोराइड) को माध्यम में जोड़ा जा सकता है।
    2. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण
      1. कोलेजन समावेशन के बाद ब्राइटफील्ड मोड 24 एच में एक वीडियो माइक्रोस्कोप के साथ क्रमिक रूप से तस्वीरें लें।
      2. चित्रों का विश्लेषण करने के लिए फिजी का उपयोग करें या तो मैन्युअल रूप से या अर्धस्वचालित तरीके से। मैन्युअल रूप से ऐसा करने के लिए, फ्रीहैंड चयन उपकरण के साथ कोर और स्फेरॉइड के कुल क्षेत्र को चारों ओर आकर्षित करें और कोर क्षेत्र के साथ कुल क्षेत्र को घटाकर प्रत्येक स्फेरॉइड के आक्रामक क्षेत्र को मापें। अर्धस्वचालित तरीके से छवियों का विश्लेषण करने के लिए, आक्रामक क्षेत्र निर्धारित करने के लिए पूरक दस्तावेज़ 1 में इंगित मैक्रो का उपयोग करें।
  3. माइग्रेशन
    1. तैयारी
      1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए एनबीएम में मैट्रीगेल (0.2 मिलीग्राम/एमएल) के साथ 6 अच्छी प्लेट को कोट करें, फिर मैट्रीगेल को हटा दें और सीएनबीएम का 2 मिलील जोड़ें।
      2. राउंड बॉटम वेल प्लेट से 6 वेल प्लेट में सीएनबीएम के 50 माइक्रोन में स्फेरॉइड ट्रांसफर करें।
      3. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और स्फेरॉइड का पालन करने के लिए 30 मिन इंतजार करें।
      4. 24 एच के ऊष्मायन के बाद होचस्ट के 10 एनजी/एमएल और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 30 मिन के साथ दाग।
    2. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण
      1. ब्राइटफील्ड में वीडियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियां प्राप्त करें। एक 405 एनएम लेजर Hoechst धुंधला के दृश्य के लिए प्रयोग किया जाता है।
      2. चित्रों का विश्लेषण करने के लिए फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और पूरक दस्तावेज़ 1में इंगित मैक्रो को चलाएं।
        नोट: कुएं के नीचे को छूना या सुपरनेटेंट को पूरी तरह से हटाने से स्फेरॉइड नुकसान होता है। कोलेजन प्रकार के लिए मैं जेल हैंडलिंग, कोलेजन बहुलकीकरण से बचने के लिए बर्फ पर जेल रखें, एक अम्लीय घटक न जोड़ें क्योंकि पीएच में परिवर्तन जेल की कॉम्पैक्टनेस को प्रभावित करेगा, और कोशिका मृत्यु और जेल के क्षरण को रोकने के लिए कोलेजन में तेजी से पाइपेट कोशिकाओं को प्रभावित करेगा।

3. फिजी मैक्रो

नोट: फिजी एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम है जो सार्वजनिक डोमेन में विकसित किया गया है जो मैक्रो के विकास को छवि विश्लेषण को गति देने की अनुमति देता है। मैनुअल विश्लेषण भी संभव है, लेकिन यह एक धीमी प्रक्रिया है और पूर्वाग्रहों को पेश कर सकती है। छवियों को सॉफ्टवेयर में ड्रैग-एंड-ड्रॉप द्वारा आयात किया जा सकता है और आरओआई प्रबंधक टूल प्लगइन के साथ निर्धारित किया जा सकता है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया को नीचे वर्णित किया गया है:

  1. मैक्रो विंडो खोलें: प्लगइन्स । मैक्रोन । इंटरएक्टिव इंटरप्रेटर।
  2. निम्नलिखित अनुकूलित बैंगनी लूप को कॉपी और पेस्ट करें। बैंगनी वाक्य रखें और ब्याज के हरे वाक्य(अनुपूरक दस्तावेज़ 1)जोड़ें ।
  3. पूरी श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए, एक विशिष्ट मात्राकरण के लिए लाल रंग में मापदंडों को समायोजित करें और मैक्रो का उपयोग करके मैक्रो चलाएं। मैक्रो चलाएं या Ctrl + Rदबाएं ।
  4. जांच करें और, यदि आवश्यक हो, तो मैन्युअल रूप से ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को अनुकूलित करें।

4. स्फेरॉइड की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

नोट: निम्नलिखित चरणों में से अधिकांश रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए।

  1. निर्धारण चरण
    1. एक कट पिपेट टिप के साथ स्फेरॉइड को इकट्ठा करें, इसे 1.5 एमएल ट्यूब में रखें, और 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) के साथ 1x धोएं।
    2. 0.1 एम पीबी में 2% ग्लूटाराल्डिहाइड/2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में रात भर स्फेरॉइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
    3. 0.1 एम पीबी में 1% पीएफए के समाधान के साथ निर्धारण समाधान को बदलें और इसके बाद नमूना तैयार किया गया।
  2. नमूना तैयारकरना
    1. स्फेरॉइड को छलनी में स्थानांतरित करें और स्फेरॉइड क्षति से बचने के लिए उन्हें एक ग्लास बीकर में डाल दें।
    2. ध्यान से 0.1 एम पीबी के साथ 3x धोलें।
    3. अंधेरे में 2 घंटे के लिए ओस्मियम के साथ इनक्यूबेट। 1% 0.1 एम पीबी बफर में 4% तक पतला ओस्मियम।
    4. ध्यान से 0.1 एम पीबी के साथ 3x धोलें।
      1. निर्जलीकरण इस प्रकार है: 10 मिन के लिए 50% इथेनॉल में भिगोएं, 10 मिन के लिए 70% इथेनॉल, 15 मिन के लिए 2x 90% इथेनॉल, 20 मिन के लिए 2x 100% इथेनॉल, और 30 मिन के लिए 2x एसीटोन।
    5. नमूनों को 2 घंटे के लिए एसीटोन/रेसिन के 50/50 मिश्रण में इनक्यूबेट करें । इस चरण के दौरान, EPON रेसिन (एम्बेड-812: 11.25 ग्राम) तैयार करें; डीडीएसए: 9 ग्राम; एनएमए: 4.5 ग्राम)।
    6. एसीटोन/रेसिन मिश्रण को त्यागें, ताजा तैयार रेसिन के साथ बदलें और रातोंरात इनक्यूबेट करें।
    7. एक नया एक द्वारा रेसिन की जगह और 2-6 घंटे के बीच इनक्यूबेट ।
    8. 48-72 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक मोल्ड में स्फेरॉइड में स्फेरॉइड जोड़ें।

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Representative Results

स्फेरॉइड को प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था और प्रवासन, आक्रमण, प्रसार और माइक्रोस्कोपी के बारे में टिप्पणियां की गई थीं। गोलाकार संरचना के विशिष्ट क्षेत्रों में हाइपोक्सिया को मापने के लिए, हाइपोक्सिक गतिविधि(चित्रा 1ए-सी)निर्धारित करने के लिए कार्बोटिक एंहाइड्रेज IX धुंधला का उपयोग किया गया था। स्फेरॉइड सेंटर(चित्रा 1ए-सी)में अधिक कैक्स-पॉजिटिव कोशिकाएं देखी गईं। स्फेरॉइड कोर में स्थित हाइपोक्सिक कोशिकाएं आसपास के लोगों की तुलना में अधिक ग्लाइकोलिटिक होती हैं। माइटोकॉन्ड्रिया को आगे के विश्लेषणों के लिए चित्रित किया जा सकता है जैसा कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1बीए-1बीबी)द्वारा दिखाया गया है। 2.5 x 103,5 x 103,104,या 2 x 104 कोशिकाओं से बना स्फेरॉइड क्रमशः लगभग 350, 400, 500, या 650 माइक्रोन का गोलाकार व्यास प्रदर्शित करता है(चित्रा 2ए)। प्रयोग शुरू करने के बाद 4 दिनों के भीतर स्फेरॉइड का उपयोग किया जा सकता है(चित्रा 2बी)। प्रत्येक परख (यानी प्रसार, आक्रमण, प्रवास) का परिमाणीकरण चित्र 3में दिखाया गया है। फिजी मैक्रोप्रसार, आक्रमण, या प्रवास की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित किए गए थे(चित्र 3 और अनुपूरक दस्तावेज़ 1)।

स्फेरॉइड कोर की वृद्धि सेल प्रसार(चित्र 4ए)की उत्तेजना को दर्शाती है। रोटेनोन द्वारा अवरोध पर, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला के जटिल I के एक स्थापित अवरोधक, माइटोकॉन्ड्रिया में एटीपी उत्पादन के विशाल बहुमत से समझौता किया गया था। नतीजतन, 72 घंटे(चित्रा 4ए)के बाद प्रसार में 20% की कमी आई। कोलेजन प्रकार के आक्रमण की गणना कोर क्षेत्र से कुल क्षेत्र के घटाव द्वारा की गई थी। अम्लीय उपचार 24 घंटे(चित्रा 4बी)की अवधि में आक्रमण बढ़ाया । इसके अलावा, हमने पाया कि हाइड्रोजन क्लोराइड उपचार ने नियंत्रण(चित्रा 4सी)की तुलना में स्फेरॉइड के प्रवासी क्षेत्र को 1.5 गुना कम कर दिया। यूनीवरस्लाइड13में लाइव इमेजिंग के लिए बढ़ते हुए स्फेरॉइड डायनेमिक्स का अध्ययन किया गया । स्फेरॉइड में उच्च आंतरिक गतिशीलता थी और वे जल्दी चले गए(मूवी 1 और फिगर 4डीमें ट्रैकिंग विश्लेषण)।

Figure 1
चित्रा 1: स्फेरॉइड ठोस ट्यूमर की नकल करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल है। (A)विभिन्न क्षेत्रों के साथ एक दौर 3 डी संरचना के रूप में स्फेरॉइड। (क)पी 3 स्फेरॉइड की एक ब्राइटफील्ड तस्वीर घने केंद्रीय क्षेत्र के साथ एक गोल उपस्थिति दिखाती है। स्केल = 100 माइक्रोन.(ख)हिर्शाचेयूजर एट अल से अनुकूलित योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व6 स्फेरॉइड में ओ2,सीओ2,मेटाबोलाइट और कैटाबोलाइट ग्रेडिएंट दिखाता है। (ग)लेफ्ट पैनल: डैपीआई (ब्लू) के साथ दागित एक स्फेरॉइड की कॉन्फोकल तस्वीर और कार्बोस्टिक एंहाइड्रेज IX (ग्रीन) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ । सही पैनल: धराशायी क्षेत्र से फ्लोरेसेंस की मात्रा। स्केल = 100 माइक्रोन.(बी)इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ चित्रित माइटोकॉन्ड्रिया (धराशायी लाइनें)। बड़े माइटोकॉन्ड्रिया को शांत क्षेत्र में देखा जाता है जबकि वे प्रसार क्षेत्र में छोटे होते हैं। स्केल = 250 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: समग्र स्फेरॉइड तैयारी कदम। (A)मानव पी 3 ग्लियोब्लास्टोमा स्फेरॉइड की पीढ़ी। प्रतिनिधि छवियां बाएं पैनल और सही पैनल पर इसी प्रसार विश्लेषण पर हैं। 24 घंटे की दर से पी 3 कोशिकाओं ने घने स्फेरॉइड बनाए। कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या में स्फेरॉइड के आकार का निर्धारण किया। स्केल बार = 250 माइक्रोन.(बी)प्रसार, आक्रमण या प्रवास का अध्ययन करने के लिए आसान प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण। विभिन्न परिस्थितियों में स्फेरॉइड:(क)ट्यूमर के विकास के लिए सीरम-मुक्त माध्यम में,(ख)एकल कोशिका आक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए कोलेजन मैट्रिक्स में, और(ग)सेल माइग्रेशन के लिए मैट्रिगेल कोटिंग पर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फिजी सॉफ्टवेयर के साथ इन विट्रो परखों का परिमाणीकरण। फिजी का उपयोग करके प्राप्त ब्याज क्षेत्रों (आरओआई) का प्रतिनिधित्व। कोर क्षेत्र लाल और कुल क्षेत्र में प्रतिनिधित्व किया जाता है, जिसमें मुख्य क्षेत्र होता है, पीले रंग में। आक्रामक क्षेत्र कोर क्षेत्र से कुल क्षेत्र के घटाव से मेल खाती है। (क)प्रसार परख। (ख)ब्राइटफील्ड अधिग्रहण में कोलेजन जेल में आक्रमण परख। (ग)फ्लोरेसेंस अधिग्रहण द्वारा मैट्रीगेल कोटिंग पर प्रवासन परख। न्यूक्लिकको नीले रंग में डीपीआई के साथ दाग दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रसार, आक्रमण, या प्रवास परख में ग्लियोब्लास्टोमा P3 स्फेरॉइड। (क)प्रसार परख। बाएं पैनल: नियंत्रण के रूप में DMSO के साथ प्रतिनिधि चित्र या रोटेनोन के 20 माइक्रोन (श्वसन श्रृंखला परिसर मैं अवरोधक) के साथ समय 0 या 72 घंटे। सही पैनल: स्फेरॉइड क्षेत्र क्वांटिफिकेशन छवियों में धराशायी लाइनों के रूप में दर्शाया गया है। स्केल = 250 माइक्रोन.(बी)कोलेजन मैट्रिक्स में आक्रमण परख। बाएं पैनल: समय 0 या 24 घंटे में 20 mM हाइड्रोजन क्लोराइड के साथ या उसके बिना प्रतिनिधि चित्र। सही पैनल: आक्रामक क्षेत्रों की मात्रा। स्केल = 100 माइक्रोन.(सी)मातृगेल कोटिंग पर माइग्रेशन परख। बाएं पैनल: समय 0 या 24 घंटे में ब्राइटफील्ड मोड में प्रतिनिधि छवियों को नीचे पैनलों में प्रतिनिधित्व किया जाता है। सही पैनल: प्रवासी क्षेत्रों का परिमाणीकरण। स्केल = 250 माइक्रोन(डी)जेड-स्टैक प्रतिनिधित्व स्फेरॉइड (40 माइक्रोन स्टेप) में(ए)स्फेरॉइड डायनेमिक ट्रैक 18 घंटे (3 घंटे के अंतराल के साथ छवि) में(बी)में ट्रैक किया गया है। कोशिकाओं ने परमाणु mCherry (नारंगी) और साइटोप्लाज्मिक GFP (नीला) व्यक्त किया । स्केल = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Movie 1
मूवी 1: P3 स्फेरॉइड डायनेमिक 18 घंटे से अधिक दर्ज (हर 30 न्यूनतम छवि) । स्केल बार = 100 माइक्रोन। फिल्म 150 माइक्रोन की अनुमानित कुल मात्रा के लिए 5 माइक्रोन के जेड-स्टेप के साथ समय के साथ एक विलय जेड-स्टैक का प्रतिनिधित्व करती है। कोशिकाएं एनएलएस को व्यक्त करने के लिए लेंटिवायरस से संक्रमित थीं: एमचेरी (नाभिक नारंगी हैं) और साइटोप्लाज्मिक जीएफपी (ब्लू कलर) के साथ। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

अनुपूरक दस्तावेज 1: 3डी स्फेरॉइड के आक्रमण, प्रसार और प्रवास का विश्लेषण करने के लिए फिजी मैक्रो। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

ट्यूमर स्फेरॉइड परख अच्छी तरह से प्रसार, आक्रमण, और प्रवास, साथ ही सेल मौत और दवा प्रतिक्रिया सहित ट्यूमर विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । कैंसर कोशिकाओं को एक आक्रामक माइक्रोट्यूमर बनाने 3 डी मैट्रिक्स पर आक्रमण, के रूप में चित्रा 4बी, सीमें देखा । आक्रामक प्रक्रिया के दौरान, मैट्रिक्स धातुप्रोटीन (एमएमपी) ट्यूमर कोशिकाओं13के आसपास के मैट्रिस को पचाते हैं, और एमएमपी अवरोधक (जैसे, GM6001 या Rebimastat) सेल आक्रमण को ख़राब कर सकते हैं लेकिन माइग्रेशन14नहीं। प्रवासन और आक्रमण में ओवरलैपिंग लेकिन अलग आणविक घटनाएंशामिल हैं,जिनका हमारे स्फेरॉइड परख में अध्ययन किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, विशिष्ट सिग्नलिंग रास्तों को या तो आनुवंशिक स्तर पर या औषधीय अवरोध के माध्यम से लक्षित किया जा सकता है।

ग्लियोब्लास्टोमा को विभिन्न प्रक्रियाओं (जैसे, सह-विकल्प, सफेद पदार्थ पथ आक्रमण, इंटरस्टिशियल आक्रमण)16द्वारा आसपास के ऊतकों पर बड़े पैमाने पर आक्रमण करने के लिए जाना जाता है। हमने हाल ही में ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण9,12,17के दो उपन्यास तंत्रों का वर्णन किया है .17 विशेष रूप से, हमने मैट्रिक्सथ्रोबोपॉन्डिन-1 (TSP1) का अध्ययन किया और दिखाया कि यह ट्यूमर कोशिकाओं12में सीडी 47 की सक्रियता के माध्यम से ट्यूमर सेल आक्रमण में शामिल है। इसके अलावा, एक प्रोटेओमिक दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने जीबीएम आक्रमण17में पीएलपी 1 और डीएनएम 1 की अप्रत्याशित भूमिका की खोज की। इन अध्ययनों में, 3 डी आक्रमण परखों का सफलतापूर्वक उपयोग टीएसपी 1, पीएलपी 1 या डीएनएम 1 की औषधीय बाधा के साथ या बिना किया गया था। औषधीय बाधा के अलावा, हमने यह भी दिखाया कि हाइड्रोजन क्लोराइड के साथ एसिड उपचार 3 डी परख में आक्रमण को प्रभावित करता है। यह ज्ञात है कि ट्यूमर एसिडोसिस मेटाबोलिक रास्ते (ग्लाइकोलाइसिस), टीजीएफके के रूप में विकास कारकों सहित कई सिग्नलिंग रास्तों को सक्रिय करता है, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया5को रोकता है।

त्रि-आयामी संस्कृतियां 2डी संस्कृतियों की तुलना में अधिक शारीरिक प्रासंगिक वातावरण प्रदान करती हैं, और कई आणविक और मेटाबोलिक पैरामीटर अलग-अलग विनियमित किए जा सकते हैं। इस प्रकार, औषधीय मॉड्यूलेशन का एक अलग प्रभाव हो सकता है। नतीजतन, मानक इम्यूनोहिस्टिमेटोलॉजी के अलावा, मेटाबोलिक घटनाओं को 2-डीजी-आईआर जैसी जांच का उपयोग करके 3 डी संस्कृति में भी अध्ययन किया जा सकता है। इन निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसर मैं अवरोधक भी इस संदर्भ में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इसके अतिरिक्त, 3 डी संस्कृति प्रणाली बेसल परिस्थितियों में या उत्तेजनाओं या औषधीय संकेतों की उपस्थिति में लाइव इमेजिंग का उपयोग करके गतिशील प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए भी अच्छी तरह से अनुकूल है।

इस लेख में वर्णित प्रक्रियाओं को पूरा करते समय निम्नलिखित महत्वपूर्ण चरणों पर विचार किया जाना चाहिए: 1) परिगलन से बचने के लिए स्फेरॉइड व्यास 400 माइक्रोन से अधिक नहीं होना चाहिए; 2) फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करआक्रमण की मात्रा को सावधानीपूर्वक अंशांकित किया जाना चाहिए और प्रक्रिया के विस्तृत विवरण में इंगित किया गया है। 3) जेल कठोरता एक स्थिर विन्यास में स्फेरॉइड को पकड़ने के लिए उपयुक्त होना चाहिए; 4) पीएच मूल्य को नियंत्रित किया जाना चाहिए, क्योंकि एक बहुत ही अम्लीय पीएच आक्रमण प्रक्रिया में बाधा डालेगा।

इस लेख में वर्णित स्फेरॉइड सिस्टम की एक सीमा पूर्ण ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की कमी है। हम स्वीकार करते हैं कि उपयोग किए जाने वाले मैट्रिक्स ग्लियोब्लास्टोमा में पाए जाने वाले स्ट्रोमा का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। हालांकि, कोलेजन मस्तिष्क मैट्रिक्स का हिस्सा हैं और हम एक तैयार और आसान ी से उपयोग परख है कि किसी भी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित करना चाहता था । फिर भी, भविष्य के प्रयोगों में अतिरिक्त मैट्रिक्स घटकों के साथ-साथ सेलुलर तत्व भी शामिल हो सकते हैं, जिनमें स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं। जटिलता का एक और स्तर न्यूरोनल घटकों को शामिल करना है, लेकिन इन प्रयोगों को सावधानीपूर्वक कैलिब्रेट और डिज़ाइन किया जाना चाहिए।

अंत में, हमारा मानना है कि हमारा स्फेरॉइड 3 डी सिस्टम और विश्लेषणात्मक उपकरण जो हम इस लेख में प्रदान करते हैं, वे जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकते हैं, विशेष रूप से ब्रेन ट्यूमर विकास का अध्ययन करने में।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को ट्रांसकन 2017, एआरसी 2017, लिग कॉन्ट्रे ले कैंसर (कॉमिटे डे ला गिरोंडे एट डे ला चैरेंटे-मैरीटाइम) द्वारा समर्थित किया गया था। जोरिस गुयॉन टूलूज़ विश्वविद्यालय अस्पताल (चू टूलूज़) से फैलोशिप का प्राप्तकर्ता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 158 ग्लियोब्लास्टोमा रोगी-व्युत्पन्न कोशिका स्फेरॉइड आक्रमण प्रवास प्रसार इन विट्रो मॉडल
ग्लियोब्लास्टोमा के लिए एक 3 डी स्फेरॉइड मॉडल
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Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,… More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

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