Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

3D сфероидная модель для глиобластомы

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,5,6, 1,2, 1,2,4
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Summary

Здесь мы описываем простой в использовании нашествие, чтобы провести гиобластому. Этот ассси подходит для глиобластомы стволовых клеток. Также описывается макрос Фиджи для легкой количественной оценки вторжения, миграции и распространения.

Abstract

Двухмерные (2D) клеточные культуры не имитируют рост опухоли vivo удовлетворительно. Поэтому были разработаны трехмерные (3D) культуры сфероидных моделей. Эти модели могут быть особенно важны в области нейроонкологии. Действительно, опухоли головного мозга имеют тенденцию вторгаться в здоровую среду мозга. Мы описываем здесь идеальный 3D сфероид на основе глиобластомы, который мы разработали для изучения вторжения опухоли. Мы предоставляем все технические детали и аналитические инструменты для успешного выполнения этого ажиотажа.

Introduction

В большинстве исследований с использованием первичных или коммерчески доступных клеточных линий, анализы выполняются на клетках, выращенных на пластиковых поверхностях в качестве монослойных культур. Управление культурой клеток в 2D представляет недостатки, так как она не имитирует среду in vivo 3D-клеток. В 2D-культурах вся поверхность клеток находится непосредственно в контакте со средой, изменяя рост клеток и изменяя доступность лекарств. Кроме того, нефизиологическая пластиковая поверхность вызывает дифференциацию клеток1. Для преодоления этих трудностей были разработаны трехмерные модели культуры. Они имеют то преимущество, имитируя многоклеточной архитектуры и неоднородности опухолей2, и, таким образом, можно считать более актуальной моделью для твердых опухолей3. Сложная морфология сфероидов способствует лучшей оценке лекарственного пенетранса и резистентности4. Неоднородность опухоли в сфероиде влияет на диффузию кислорода и питательных веществ, а также на реакцию на фармакологические агенты(рисунок 1A). Диффузия кислорода изменяется, когда размер сфероида достигает 300 мкм, вызывая гипоксическую среду в центре сфероида(рисунок 1A,C). Метаболиты также менее проникают через клеточные слои и компенсирующие метаболические реакции происходят5. Когда диаметр сфероида увеличивается, некротические ядра могут наблюдаться, дальнейшее имитации характеристики, найденные во многих твердых раковых заболеваний, в том числе агрессивной глиобластомы рака мозга (GBM)6.

Несколько 2D или 3D-анализов на глиобластому были зарегистрированы в литературе7,,8. Двухмерные анализы в основном для изучения вторжения в горизонтальной плоскости на тонком матричном слое или в камере Бойдена анализ9. Трехмерные анализы были описаны с 3D сфероидных культур с использованием классических линий клеток глиобластомы10. Более сложные варианты представлены вторжением органов мозга опухолевыми сфероидами в конфронтационных культурах11. Тем не менее, по-прежнему важно разработать простой в использовании и воспроизводимый результат, доступный для любой лаборатории. Мы разработали протокол для генерации стволовых клеток, похожих на глиобластому, из образцов пациентов. Количественная оценка этих анализов легко управляемыи и требует только открытого доступа в Интернете программного обеспечения. Короче говоря, опухолевые кусочки разрезаются на мелкие кусочки и ферментативно усваиваются. Одиночные клетки выведенные от пищеварения культивируются в нейробазальной среде. Через 4-7 дней сфероидные структуры образуются спонтанно. При внутричерепной имплантации у моделей мышей, они образуют опухоли, демонстрирующие некротический ядро, окруженное псевдо-палисадингклетками12. Это очень напоминает характеристики, найденные у пациентов с ГБМ.

В этой статье мы описываем наш протокол для производства сфероидов из определенного количества клеток для обеспечения воспроизводимости. Для этой цели можно использовать две дополнительные матрицы: Matrigel и коллаген i тип. Matrigel обогащается факторами роста и имитирует базальную мембрану млекопитающих, необходимую для клеточной привязанности и миграции. С другой стороны, коллаген типа I, структурный элемент стромы, является наиболее распространенной фибриллярной внеклеточной матрицы и используется в анализы клеточного вторжения. В этом мы иллюстрируем нашу модель сфероидов GBM, выполняя анализы миграции и распространения. Анализ проводился не только в фиксированные временные моменты, но и путем мониторинга расширения сфероидов и движения клеток с помощью живой визуализации. Кроме того, была сделана электронная микроскопия для визуализации морфологических деталей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Информированное письменное согласие было получено от всех пациентов (из больницы Haukeland, Берген, Норвегия в соответствии с местными правилами комитета по этике). Наш протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике человеческих исследований нашего учреждения.

1. Поколение однородных размеров опухолевых сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Стволовые клетки культивируются в нейробазальной среде дополняется B27 дополнения, гепарин, FGF-2, пенициллин, и стрептомицин, как описано в предыдущих статьях12. Эти клетки спонтанно образуют сфероиды в культуре.

  1. Вымойте опухолевые клетки с 5 мл фосфат-буферного соления (PBS) и инкубировать клетки с 0,5-1 мл диссоциации фермента (см. Таблица материалов) в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию.
  2. Вымойте 4-4,5 мл PBS и добавьте 10 мл полной среды роста (полная нейробазальная среда, cNBM).
  3. Подсчитайте ячейки, используя автоматическую технику подсчета с помощью трипан-синего и слайда камеры подсчета клеток.
  4. Для генерации 100 сфероидов с 104 ячейками на сфероид (в соответствии с предпочтительным размером) смешайте 106 ячеек в 8 мл НБМ с 2 мл 2% метилцеллюлозы.
  5. Перенесите подвеску в стерильный системный контейнер и разлейте 100 л/хорошо с многоканальной пипеткой в круглую нижнюю пластину 96.
  6. Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 и 95% влажности. Равные размеры сфероидов сформируются и могут быть использованы через 3-4 дня.

2. Трехмерные эксперименты

  1. Распространения
    1. Подготовка
      1. Приостановить ингибиторы (например, ротенон, как на рисунке 4А) и химических веществ в 100 л средней и добавить в 100 л среды в каждой скважине (т.е., один сфероид на скважину).
      2. Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия, 5% CO2и 95% влажности.
    2. Приобретение и анализ изображений
      1. Сфотографируйте с видео микроскопом в Brightfield для создания ряда условий на T0 и в последующие времена ожидается.
      2. Используйте Фиджи для анализа фотографий вручную или в полуавтоматической манере. Чтобы сделать это вручную, нарисуйте круг вокруг сфероидного ядра с помощью инструмента выбора от руки и измерьте область каждого сфероида. Для анализа изображений полуавтоматизированным способом используйте макрос, показанный в дополнительном документе 1 с //Core Area только.
  2. Вторжения
    1. Подготовка
      1. Подготовка коллагеновой матрицы в трубке на льду с типом I коллагена на 1 мг /мл конечной концентрации, 1x PBS, 0.023xVколлагена, 1 M гидроксид натрия, и стерильные H2O. Инкубировать раствор на льду в течение 30 мин.
      2. Соберите сфероиды из круглой нижней скважины в 500 трубках и промойте 2x с 200 Л л 1x PBS.
      3. Пипетка сфероидов тщательно в 100 л коллагеновой матрицы и вставить в центр ею в нормальных 96 скважинных пластин.
      4. Инкубировать коллагеновый гель в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, а затем добавить cNBM поверх геля. На этом этапе к среде могут быть добавлены ингибиторы или активаторы (например, хлорид водорода, как показано на рисунке 4B, 4C).
    2. Приобретение и анализ изображений
      1. Сфотографируйте последовательно с видеомикроскопом в режиме brightfield 24 h после включения коллагена.
      2. Используйте Фиджи для анализа фотографий вручную или в полуавтоматической манере. Чтобы сделать это вручную, нарисуйте вокруг ядра и общей площади сфероида с помощью инструмента выбора от руки и измерьте инвазивную область каждого сфероида, вычитая общую площадь с основной областью. Для анализа изображений полуавтоматизированным способом используйте макрос, указанный в дополнительном документе 1, для определения инвазивной области.
  3. Миграции
    1. Подготовка
      1. Пальто 6 хорошо пластины с Matrigel (0,2 мг/мл) в NBM в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию, затем удалить Matrigel и добавить 2 мл cNBM.
      2. Перенесите сфероиды в 50 qL cNBM от круглой нижней плиты скважины к 6 хорошо пластины.
      3. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и ждать 30 минут для сфероидов придерживаться.
      4. После 24 ч инкубации, пятно с 10 нг /мл Hoechst и инкубировать 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
    2. Приобретение и анализ изображений
      1. Получение изображений с помощью видео микроскопа в brightfield. Лазер 405 нм используется для визуализации окрашивания Hoechst.
      2. Используйте программное обеспечение Фиджи для анализа фотографий и запуска макроса, как указано в дополнительном документе 1.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Прикосновение к нижней части колодца или полное удаление супернатанта повреждает сфероиды. Для обработки геля типа коллагена I, держите гель на льду для того чтобы во избежание полимеризация коллагена, не добавляете кислотный компонент потому что изменение в pH повлияет на компактность геля, и клетки пипетки быстро в коллаген для того чтобы предотвратить смерть клетки и ухудшение геля.

3. Фиджи Макро

ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи представляет собой программу анализа изображений, разработанную в общественном достоянии, которая позволяет разрабатывать макросы для ускорения анализа изображений. Ручной анализ также возможен, но это медленный процесс и может привести к смещениям. Изображения могут быть импортированы путем перетаскивания программного обеспечения и количественно с помощью плагина ROI Manager Tools. Процедура, используемая в данном исследовании, описана ниже:

  1. Откройте окно макроса: Плагины Макрос Интерактивный переводчик.
  2. Копировать и вставить следующие адаптированные фиолетовый цикл. Держите фиолетовые предложения и добавить зеленые предложения интересов(Дополнительный документ 1).
  3. Чтобы проанализировать всю серию, отрегулируйте параметры красным цветом для определенной количественной оценки и запустите макрос с помощью Macros Выполнить Макро или нажав Ctrl'R.
  4. Проверьте и, при необходимости, вручную адаптируйте интересующие регион (ROI).

4. Электронная микроскопия сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство из следующих шагов должно быть сделано в химическом капюшоне.

  1. Шаг фиксации
    1. Соберите сфероид с разрезанной наконечником пипетки, положите его в трубку 1,5 мл и промойте 1x с 0,1 М фосфатным буфером (PB).
    2. Исправить сфероид ночь при 4 градусах Цельсия в 2% глютаральдегида / 2% параформальдегида (PFA) в 0,1 МПБ.
    3. Замените решение фиксации раствором 1% PFA в 0,1 M PB с последующей подготовкой образца.
  2. Подготовка образцов
    1. Перенесите сфероиды в ситечко и поместите их в стеклянный стакан, чтобы избежать повреждения сфероидами.
    2. Тщательно промыть 3x с 0,1 М ПБ.
    3. Инкубировать с осмием на 2 ч в темноте. Разбавить осмий до 4% в 1% 0,1 M PB буфера.
    4. Тщательно промыть 3x с 0,1 М ПБ.
      1. Обезвоживание следующим образом: замочите в 50% этанола в течение 10 мин, 70% этанола в течение 10 мин, 2x 90% этанола в течение 15 мин, 2x 100% этанола в течение 20 мин, и 2x ацетона в течение 30 мин.
    5. Инкубировать образцы в смеси 50/50 ацетона/минина на 2 ч. Во время этого шага подготовьте ресину EPON (Embed-812: 11.25 г; DDSA: 9 г; НМА: 4,5 г).
    6. Откажитесь от смеси ацетона/мини, замените свежеприготовленной мизиной и инкубируйте на ночь.
    7. Замените на мизину новой и насигните между 2-6 ч.
    8. Добавить сфероиды в мисена в форму при 60 градусах по Цельсию в течение 48-72 ч.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сфероиды были подготовлены, как описано в разделе протоколов, и были сделаны наблюдения в отношении миграции, вторжения, распространения и микроскопии. Для измерения гипоксии в различных областях сферической структуры, карбоксковая ангидразовая IX окрашивание был использован для определения гипоксической активности(Рисунок 1A-C). Больше CAIX-положительных клеток наблюдались в сфероидном центре(Рисунок 1A-C). Гипоксические клетки, расположенные в сфероидном ядре, как правило, более гликолитические, чем окружающие. Митохондрии могут быть изображены для дальнейшего анализа, как показано на электронной микроскопии(Рисунок 1Ba-1Bb). Сфероиды, состоящие из 2,5 х 103, 5 х 103, 104, или 2 х 104 клетки обладают сфероид диаметром около 350, 400, 500, или 650 мкм соответственно (Рисунок 2А). Сфероиды могут быть использованы в течение 4 дней после начала эксперимента(Рисунок 2B). Количественная оценка каждого асссе (т.е. распространение, вторжение, миграция) показана на рисунке 3. Фиджи макросы были разработаны для количественной оценки распространения, вторжения или миграции(рисунок 3 и Дополнительный документ 1).

Увеличение сфероидного ядра отражает стимуляцию пролиферации клеток(рисунок 4А). При ингибировании ротеноном, установленным ингибитором комплекса I митохондриальной дыхательной цепи, подавляющее большинство производства АТФ в митохондриях было скомпрометировано. Как следствие, распространение сократилось на 20% после 72 ч(рисунок 4А). Вторжение коллагена типа I было рассчитано на основе вычитания общей площади из основной области. Кислотная обработка усиливает сявра над периодом 24 h(Рисунок 4B). Кроме того, мы обнаружили, что лечение хлоридом водорода уменьшило миграционную область сфероидов в 1,5 раза по сравнению с контролем(рисунок 4С). Сфероиддинамика была изучена путем монтажа для живой визуализации в UniverSlide13. Сфероиды имели высокую внутреннюю динамику и быстро двигались(фильм 1 и отслеживание анализа на рисунке 4D).

Figure 1
Рисунок 1: Сфероид является соответствующей моделью для имитации твердых опухолей. (A) Сфероид как круглая 3D структура с различными областями. (a) Яркое поле картина P3 сфероид показывает круглый вид с плотной центральной области. Шкала No 100 мкм.(б)Схематическое представление, адаптированное из Hirschhaeuser et al.6 показывает O2,CO2,метаболит и градиенты катаболита в сфероиде. (c)Левая панель: конфокальная картина сфероида, окрашенного DAPI (синий) и с антителами против карбоксовой ангидразы IX (зеленый). Правая панель: количественная оценка флуоресценции из пунктирной области. Масштабная шкала 100 мкм. (B) Электронная микроскопия изображения с очертаенные митохондрии (разбитые линии). Большие митохондрии видны в quiescentarea в то время как они меньше в области распространения. Масштабная шкала 250 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Общие шаги подготовки сфероида. (A) Поколение человека P3 сферои p3 глиобластомы. Репрезентативные изображения находятся на левой панели и соответствующий анализ распространения на правой панели. На 24 ч, P3 клетки образуют плотные сфероиды. Начальное количество клеток определило размер сфероидов. Шкала бар 250 мкм. (B) Схемаическая иллюстрация простых протоколов для изучения распространения, вторжения или миграции. Сфероиды при различных условиях: ( ) В сывороткесвободнойсреде для роста опухоли, (b) В коллагеновой матрицы для облегчения одноклеточного вторжения, и (с) На Матригель покрытие для миграции клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Количественная оценка in vitro анализов с программным обеспечением Фиджи. Представление интересов регионов (ROI), полученное с использованием Фиджи. Область ядра представлена красным цветом, а общая площадь, содержащая область ядра, желтым. Инвазивная область соответствует вычитанию общей площади из основной области. (A) Распространение асссе. (B) Вторжение асссе в коллагеновый гель в ярко-поля приобретения. (C)Миграция асссы на покрытие Matrigel путем приобретения флуоресценции. Ядра были окрашены DAPI, в синий цвет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Глиобластома P3 сфероида в распространении, вторжении или миграционных анализах. (A) Распространение асссе. Левая панель: Представитель фотографии с DMSO в качестве контроля или с 20 мкм ротенона (респираторный цепной комплекс i ингибитор) в то время 0 или 72 ч. Правая панель: количественная оценка области сферидов представлена в виде пунктирных линий на изображениях. Шкала No 250 мкм. (B) Вторжение в коллагеновой матрицы. Левая панель: Представитель фотографии с или без 20 мМ хлорида водорода, в то время 0 или 24 ч. Правая панель: Количественная оценка инвазивных областей. Масштабная шкала 100 мкм. (C) Миграция асссена на матригель покрытие. Левая панель: Репрезентативные изображения в режиме яркого поля в режиме 0 или 24 ч. Увеличенные области представлены в нижних панелях. Правая панель: Количественная оценка миграционных районов. Масштабная шкала 250 мкм. (D) - стек представление сфероида (40 мкм шаг) в(а ) сфероид динамических отслеживается более 18 ч (изображение с интервалом 3 ч) в (b). Клетки устоичиво выражали ядерный mCherry (оранжевый) и цитоплазмический GFP (синий). Масштаб наям 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Movie 1
Фильм 1: P3 сфероидной динамической записаны более 18 ч (изображение каждые 30 минут). Шкала бар 100 мкм. Фильм представляет собой слитое стек с течением времени с шагом в 5 мкм при приблизительном общем объеме 150 мкм. Клетки были заражены лентивирусом, чтобы выразить NLS:mCherry (ядра оранжевые) и цитоплазмическим GFP (синий цвет). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Дополнительный документ 1: Фиджи макрос для анализа вторжения, распространения и миграции 3D сфероидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Опухолевые сфероидные анализы хорошо приспособлены для изучения характеристик опухоли, включая пролиферацию, вторжение и миграцию, а также гибель клеток и ответные меры на наркотики. Раковые клетки вторгаются в 3D-матрицу, образуя инвазивную микроопухоль, как видно на рисунке 4B,C. Во время инвазивного процесса, матричные металлопротеины (MMP) переваривают матрицы, окружающие опухолевые клетки13,и ингибиторы MMP (например, GM6001 или Rebimastat) могут ухудшить вторжение клеток, но не миграцию14. Миграция и вторжение включают перекрывающиеся, но отдельные молекулярные события15, которые могут быть изучены в нашем сфероидном анализе. Для этого конкретные сигнальные пути могут быть направлены либо на генетическом уровне, либо через фармакологическое ингибирование.

Глиобластомы, как известно, широко вторгаются в окружающие ткани различными процессами (например, со-вариант, вторжение в урочище белого вещества, интерстициальное вторжение)16. Недавно мы описали два новых механизма вторжения глиобластомы9,12,17. В частности, мы изучили матриклеточный тромбопондин-1 (TSP1) и показали, что он участвует в вторжении опухолевых клеток через активацию CD47 в опухолевых клетках12. Кроме того, используя протеомный подход, мы обнаружили неожиданную роль PLP1 и DNM1 в вторжении GBM17. В этих исследованиях, 3D-анализы вторжения были успешно использованы с или без фармакологической обструкции TSP1, PLP1, или DNM1. Помимо фармакологической обструкции, мы также показали, что кислотная обработка хлоридом водорода влияет на вторжение в 3D-анализ. Известно, что опухолевый ацидоз активирует ряд сигнальных путей, в том числе метаболических путей (гликолиз), факторы роста, как TGF, и подавляет иммунный ответ5.

Трехмерные культуры обеспечивают более физиологическую среду, чем 2D культуры, и многие молекулярные и метаболические параметры могут быть по-разному регулируется. Таким образом, фармакологическая модуляция может иметь различное воздействие. Следовательно, помимо стандартной иммуногистологии, метаболические события также могут быть изучены в 3D-культуре с помощью зондов, таких как 2-DG-IR. Для подтверждения этих выводов в этом контексте может быть использован ингибитор цепи электронного транспорта I.

Кроме того, система 3D-культуры также хорошо подходит для изучения динамических процессов с использованием живой визуализации в базальных условиях или при наличии стимулов или фармакологических сигналов.

При проведении процедур, описанных в данной статье, следует учитывать следующие критические шаги: 1) диаметр сфероида не должен превышать 400 мкм во избежание некроза; 2) Количественная оценка вторжения с использованием программного обеспечения Фиджи должна быть тщательно откалибрована и выполнена в соответствии с подробным описанием процедуры.; 3) жесткость геля должна быть соответствующей для того чтобы держать сфероид в стабилизированной конфигурации; 4) Значение рН должно контролироваться, так как очень кислый рН будет препятствовать процессу вторжения.

Одним из ограничений сфероидной системы, описанной в этой статье, является отсутствие полной микросреды опухоли. Мы признаем, что используемая матрица не в полной мере представляет строму, найденную в глиобластоме. Тем не менее, коллагены являются частью матрицы мозга, и мы хотели разработать готовый и простой в использовании асссс, который может быть использован в любой лаборатории. Тем не менее, будущие эксперименты могут также включать дополнительные матричные компоненты, а также клеточные элементы, включая стромальные и иммунные клетки. Другим уровнем сложности является включение нейрональных компонентов, но эти эксперименты должны быть тщательно откалиброваны и разработаны.

В заключение, мы считаем, что наши сфероидные 3D системы и аналитические инструменты, которые мы предоставляем в этой статье может быть полезным для исследователей, особенно в изучении развития опухоли головного мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde et de la Charente-Maritime). Джорис Гайон является получателем стипендий из университетской больницы Тулузы (CHU Тулуза).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).

Tags

Исследования рака выпуск 158 глиобластома клетка сфероид вторжение миграция пролиферация модели in vitro
3D сфероидная модель для глиобластомы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,… More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter