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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,5,6, 1,2, 1,2,4
1University Bordeaux, LAMC, 2INSERM U1029, University Bordeaux, 3Department of Biomedicine, University of Bergen, 4CNRS, IBGC UMR5095, 5LP2N, CNRS UMR 5298, IOA, 6Institut d'Optique Graduate School, IOA

Summary

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Abstract

Los cultivos celulares bidimensionales (2D) no imitan satisfactoriamente el crecimiento tumoral in vivo. Por lo tanto, se desarrollaron modelos de esferoides de cultivo tridimensionales (3D). Estos modelos pueden ser particularmente importantes en el campo de la neurooncología. De hecho, los tumores cerebrales tienen la tendencia a invadir el ambiente cerebral sano. Aquí describimos un ensayo ideal basado en esferoides de glioblastoma 3D que desarrollamos para estudiar la invasión tumoral. Proporcionamos todos los detalles técnicos y herramientas analíticas para realizar con éxito este ensayo.

Introduction

En la mayoría de los estudios que utilizan líneas celulares primarias o disponibles comercialmente, los ensayos se realizan en células cultivadas en superficies plásticas como cultivos monocapa. La gestión del cultivo celular en 2D representa desventajas, ya que no imita un entorno de células 3D in vivo. En los cultivos 2D, toda la superficie celular está directamente en contacto con el medio, alterando el crecimiento celular y modificando la disponibilidad de medicamentos. Además, la superficie de plástico no fisiológico desencadena la diferenciación celular1. Se han desarrollado modelos de cultivo tridimensionalparados para superar estas dificultades. Tienen la ventaja de imitar la arquitectura multicelular y la heterogeneidad de los tumores2,por lo que podrían considerarse un modelo más relevante para los tumores sólidos3. La compleja morfología de los esferoides contribuye a evaluar mejor la penetración y resistencia a los fármacos4. La heterogeneidad tumoral en el esferoide afecta a la difusión de oxígeno y nutrientes, y la respuesta a los agentes farmacológicos(Figura 1A). La difusión del oxígeno se altera cuando el tamaño de los esferoides alcanza los 300 m, induciendo un ambiente hipoxico en el centro del esferoide(Figura 1A,C). Los metabolitos también son menos penetrantes a través de las capas celulares y las reacciones metabólicas compensatorias tienen lugar5. Cuando aumenta el diámetro de la esferoide, se pueden observar núcleos necróticos, imitando aún más las características encontradas en muchos cánceres sólidos, incluyendo el glioblastoma agresivo del cáncer cerebral (GBM)6.

Varios ensayos de invasión 2D o 3D para el glioblastoma se han divulgado en la literatura7,8. Los ensayos bidimensionales son principalmente para estudiar la invasión en un plano horizontal en una capa de matriz delgada o en un ensayo de cámara Boyden9. Los ensayos tridimensionales se han descrito con cultivos de esferoides 3D utilizando líneas celulares clásicas de glioblastoma10. Variantes más complejas están representadas por la invasión de organoides cerebrales por esferoides tumorales en las culturas de confrontación11. Sin embargo, sigue siendo importante desarrollar un ensayo fácil de usar y reproducible disponible para cualquier laboratorio. Hemos desarrollado un protocolo para generar células similares a glioblastoma a partir de muestras de pacientes. La cuantificación de estos ensayos es fácilmente manejable y sólo requiere software en línea de acceso abierto. Brevemente, las piezas tumorales se cortan en trozos pequeños y se digieren enzimáticamente. Las células individuales derivadas de la digestión se cultivan en medio neurobasal. Después de 4-7 días, las estructuras esferoides se forman espontáneamente. Tras la implantación intracraneal en modelos de ratones, forman tumores que exhiben un núcleo necrótico rodeado de células pseudo-palisading12. Esto se asemeja mucho a las características encontradas en los pacientes con GBM.

En este artículo, describimos nuestro protocolo para producir esferoides a partir de un número determinado de celdas para garantizar la reproducibilidad. Para ello se pueden utilizar dos matrices complementarias: Matrigel y colágeno tipo I. Matrigel se enriquece en factores de crecimiento e imita la membrana basal de mamíferos necesaria para la unión celular y la migración. Por otro lado, el colágeno tipo I, un elemento estructural del estroma, es la matriz extracelular fibrilar más común y se utiliza en ensayos de invasión celular. Aquí, ilustramos nuestro modelo de esferoides GBM mediante la realización de ensayos de migración y proliferación. El análisis se realizó no sólo en puntos de tiempo fijos, sino también mediante el monitoreo de la expansión del esferoide y el movimiento celular mediante imágenes en vivo. Además, la microscopía electrónica se realizó para visualizar detalles morfológicos.

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Protocol

Se obtuvo el consentimiento por escrito informado de todos los pacientes (del Hospital Haukeland, Bergen, Noruega de acuerdo con las regulaciones del comité de ética local). Nuestro protocolo sigue las pautas del comité de ética de investigación humana de nuestra institución.

1. Generación de esferoides tumorales de tamaño uniforme

NOTA: Las células similares al tallo se cultivan en medio neurobasal complementado con suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilina y estreptomicina, como se describe en los artículosanteriores 12. Estas células forman espontáneamente esferoides en el cultivo.

  1. Lavar las células tumorales con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubar las células con una enzima disociación de 0,5-1 ml (ver Tabla de materiales)durante 5 minutos a 37 oC.
  2. Lavar con 4-4,5 ml de PBS y añadir 10 ml del medio de crecimiento completo (medio neurobasal completo, cNBM).
  3. Cuente las celdas usando una técnica de conteo automático con trippan azul y una diapositiva de cámara de conteo celular.
  4. Para generar 100 esferoides con 104 células por esferoide (según el tamaño preferido), mezcle 106 células en 8 ml de NBM con 2 ml de 2% de metilcelulosa al 2%.
  5. Transfiera la suspensión a un recipiente estéril del sistema y dispensar 100 l/bien con una pipeta multicanal en una placa inferior redonda de 96 pocillos.
  6. Incubar la placa a 37oC, 5% CO2 y 95% de humedad. Se formarán esferoides de igual tamaño y se pueden utilizar después de 3-4 días.

2. Experimentos tridimensionales

  1. Proliferación
    1. Preparación
      1. Suspender los inhibidores (p. ej., rotenona como en la Figura 4A)y productos químicos en 100 s de medio y añadir a los 100 s de medio en cada pocal (es decir, un esferoide por pocido).
      2. Incubar la placa a 37oC, 5% CO2y 95% de humedad.
    2. Adquisición y análisis de imágenes
      1. Tome fotografías con un microscopio de vídeo en brightfield para crear una serie de condiciones en T0 y los siguientes tiempos esperados.
      2. Utilice Fiji para analizar imágenes de forma manual o semiautomática. Para hacerlo manualmente, dibuje un círculo alrededor del núcleo del esferoide con la herramienta de selección a mano alzada y mida el área de cada esferoide. Para analizar las imágenes de forma semiautomática, utilice la macro que se muestra en Documento suplementario 1 solo con //Core Area.
  2. Invasión
    1. Preparación
      1. Preparar la matriz de colágeno en un tubo sobre hielo con colágeno tipo I a 1 mg/ml de concentración final, 1x PBS, colágeno 0.023xV, hidróxido de sodio de 1 M, e estéril H2O. Incubar la solución en hielo durante 30 min.collagen
      2. Recoger esferoides de la placa de pozo de fondo redondo en tubos de 500 l y lavar 2x con 200 s 1x PBS.
      3. Pipetear los esferoides cuidadosamente en 100 l de la matriz de colágeno e insertar en el centro de un pozo en las placas normales de 96 pocillos.
      4. Incubar el gel de colágeno durante 30 min a 37 oC y luego añadir cNBM encima del gel. Los inhibidores o activadores (por ejemplo, cloruro de hidrógeno como se muestra en la Figura 4B, 4C)se pueden añadir al medio en este paso.
    2. Adquisición y análisis de imágenes
      1. Tome fotografías secuencialmente con un microscopio de vídeo en modo campo brillante 24 h después de la inclusión de colágeno.
      2. Utilice Fiji para analizar imágenes de forma manual o semiautomática. Para hacerlo manualmente, dibuje alrededor del núcleo y el área total del esferoide con la herramienta de selección a mano alzada y mida el área invasiva de cada esferoide restando el área total con el área del núcleo. Para analizar las imágenes de forma semiautomática, utilice la macro como se indica en el Documento Suplementario 1 para determinar el área invasiva.
  3. Migración
    1. Preparación
      1. Recubrir una placa de 6 pocillos con Matrigel (0,2 mg/ml) en NBM durante 30 min a 37 oC, luego retirar el Matrigel y añadir 2 ml de cNBM.
      2. Transfiera los esferoides a 50 ml de cNBM desde la placa de pozo de fondo redondo a la placa de 6 pocillos.
      3. Incubar la placa a 37 oC y esperar 30 minutos a que se adhieran los esferoides.
      4. Después de 24 h de incubación, mancha con 10 ng/ml de Hoechst e incubar 30 min a 37oC.
    2. Adquisición y análisis de imágenes
      1. Obtenga imágenes utilizando un microscopio de vídeo en Brightfield. Un láser de 405 nm se utiliza para la visualización de la tinción Hoechst.
      2. Utilice el software Fiji para analizar imágenes y ejecutar la macro como se indica en el Documento Complementario 1.
        NOTA: Al tocar la parte inferior del pozo o eliminar completamente el sobrenadante, se dañan los esferoides. Para el manejo del gel de colágeno tipo I, mantener el gel sobre hielo para evitar la polimerización de colágeno, no añadir un componente ácido porque el cambio en el pH afectará a la compacidad del gel, y pipetear las células rápidamente en el colágeno para evitar la muerte celular y la degradación del gel.

3. Fiji Macro

NOTA: Fiji es un programa de análisis de imágenes desarrollado en el dominio público que permite el desarrollo de macros para acelerar el análisis de imágenes. El análisis manual también es posible, pero este es un proceso lento y puede introducir sesgos. Las imágenes se pueden importar arrastrando y soltar en el software y cuantificadas con el plugin ROI Manager Tools. El procedimiento utilizado en este estudio se describe a continuación:

  1. Abra la ventana macro: Plugins Macros de la página de macros de la Intérprete interactivo.
  2. Copie y pegue el siguiente bucle púrpura adaptado. Conservar las oraciones púrpuras y añadir las oraciones verdes de interés(Documento Suplementario 1).
  3. Para analizar toda la serie, ajuste los parámetros en rojo para una cuantificación específica y ejecute la macro utilizando Macros . Ejecute Macro o pulse Ctrl+R.
  4. Compruebe y, si es necesario, adapte manualmente la región de interés (ROI).

4. Microscopía electrónica de esferoides

NOTA: La mayoría de los siguientes pasos deben realizarse en una campana química.

  1. Paso de fijación
    1. Recoger el esferoide con una punta de pipeta cortada, ponerlo en un tubo de 1,5 ml, y lavar 1x con tampón de fosfato de 0,1 M (PB).
    2. Fijar el esferoide durante la noche a 4 oC en 2% glutaraldehído/2% paraformaldehído (PFA) en 0.1 M PB.
    3. Reemplace la solución de fijación por una solución de 1% de PFA en 0,1 M PB seguida de preparación de muestras.
  2. Preparación de muestras
    1. Transfiera los esferoides a un colador y colóquelos en un vaso de precipitados para evitar daños por esferoides.
    2. Lavar con cuidado 3x con 0.1 M PB.
    3. Incubar con osmio durante 2 h en la oscuridad. Diluir el osmio al 4% en 1% 0,1 M PB tampón.
    4. Lavar con cuidado 3x con 0.1 M PB.
      1. Deshidratar de la siguiente manera: remojar en 50% etanol durante 10 min, 70% etanol para 10 min, 2x 90% etanol para 15 min, 2x 100% etanol para 20 min, y 2x acetona durante 30 min.
    5. Incubar las muestras en una mezcla 50/50 de acetona/resina durante 2 h. Durante este paso, prepare la resina EPON (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
    6. Deseche la mezcla de acetona/resina, sustitúyala con resina recién preparada e incuba durante la noche.
    7. Sustituya la resina por una nueva e incubar entre 2-6 h.
    8. Añadir los esferoides en resina en un molde a 60oC durante 48-72 h.

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Representative Results

Los esferoides se prepararon como se describe en la sección de protocolos y se hicieron observaciones con respecto a la migración, invasión, proliferación y microscopía. Para medir la hipoxia en áreas distintas de la estructura esférica, se utilizó la tinción de anhidrasa IX carboxínica para determinar la actividad hipoxica(Figura 1A-C). Se observaron más células CAIX positivas en el centro esferoide(Figura 1A-C). Las células hipoxicas ubicadas en el núcleo esferoide tienden a ser más glucolíticas que las circundantes. Las mitocondrias se pueden tomar imágenes para análisis posteriores, como se muestra mediante microscopía electrónica(Figura 1Ba-1Bb). Los esferoides compuestos por 2,5 x 103, 5 x 103, 104o 2 x 104 células presentan un diámetro esferoide de aproximadamente 350, 400, 500 o 650 m respectivamente(Figura 2A). Los esferoides se pueden utilizar dentro de los 4 días después de iniciar el experimento(Figura 2B). La cuantificación de cada ensayo (es decir, proliferación, invasión, migración) se muestra en la Figura 3. Se elaboraron macros de Fiji para cuantificar la proliferación, invasión o migración(Figura 3 y Documento Complementario 1).

El aumento del núcleo esferoide reflejó la estimulación de la proliferación celular(Figura 4A). Tras la inhibición por rotenona, un inhibidor establecido del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial, la gran mayoría de la producción de ATP en las mitocondrias se vio comprometida. Como consecuencia, la proliferación se redujo en un 20% después de 72 h(Figura 4A). La invasión del colágeno tipo I se calculó por la resta del área total del área central. Tratamiento ácido mayor invasión durante un período de 24 h (Figura 4B). Además, encontramos que el tratamiento con cloruro de hidrógeno redujo la zona migratoria de los esferoides en 1,5 veces en comparación con el control(Figura 4C). La dinámica esferoide se estudió montando imágenes en vivo en el UniverSlide13. Los esferoides tenían una dinámica interna alta y se movían rápidamente(Película 1 y análisis de seguimiento en la Figura 4D).

Figure 1
Figura 1: El esferoide es un modelo relevante para imitar tumores sólidos. (A) Esferoide como una estructura 3D redonda con diferentes áreas. (a) Una imagen de campo brillante de un esferoide P3 muestra una apariencia redonda con un área central densa. La representación esquemáticabadaptada de Hirschhaeuser et al.6 muestra los gradientes O2,CO2,metabolito y catabolizado en el esferoide. (c) Panel izquierdo: imagen confocal de un esferoide manchado con DAPI (azul) y con anticuerpos contra la anhidrasa carboxínica IX (verde). Panel derecho: cuantificación de la fluorescencia desde el área discontinua. Escala 100 m.(B) Imágenes de microscopía electrónica con mitocondrias delineadas (líneas discontinuas). Las grandes mitocondrias se ven en el área de reposo, mientras que son más pequeñas en el área de proliferación. Escala 250 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Pasos generales de preparación de esferoides. (A) Generación de esferoides de glioblastoma P3 humanos. Las imágenes representativas están en el panel izquierdo y el análisis de proliferación correspondiente en el panel derecho. A las 24 h, las células P3 formaron esferoides densos. El número inicial de celdas determinó el tamaño de los esferoides. Barra de escala a 250 m. (B) Ilustración esquemática de los protocolos fáciles para estudiar la proliferación, invasión o migración. Esferoides bajo diversas condiciones:(a ) En medio libre de suero para el crecimiento tumoral, (b) En la matriz de colágeno para facilitar la invasión de una sola célula, y (c) En el recubrimiento Matrigel para la migración celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Cuantificación de ensayos in vitro con software de Fiji. Representación de las regiones de interés (ROI) obtenidas utilizando Fiji. El área central está representada en rojo y el área total, que contiene el área del núcleo, en amarillo. El área invasora corresponde a la resta del área total del área central. (A) Ensayo de proliferación. (B) Ensayo de invasión en gel de colágeno en adquisiciones de campo brillante. (C) Ensayo de migración sobre el recubrimiento Matrigel mediante adquisición de fluorescencia. Los núcleos estaban manchados con DAPI, en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Glioblastoma P3 esferoides en ensayos de proliferación, invasión o migración. (A) Ensayo de proliferación. Panel izquierdo: Imágenes representativas con DMSO como control o con 20 m de rotenona (inhibidor del complejo de cadena respiratoria I) en el momento 0 o 72 h. Panel derecho: cuantificación del área esferoide representada como líneas discontinuas en las imágenes. Escala 250 m. (B) Ensayo de invasión en matriz de colágeno. Panel izquierdo: Imágenes representativas con o sin cloruro de hidrógeno de 20 mM, en el momento 0 o 24 h. Panel derecho: Cuantificación de zonas invasoras. Escala 100 m. (C) Ensayo de migración sobre el recubrimiento Matrigel. Panel izquierdo: Imágenes representativas en modo campo brillante en el momento 0 o 24 h. Las áreas ampliadas se representan en los paneles inferiores. Panel derecho: Cuantificación de áreas migratorias. Escala 250 m. (D) Representación de la pila Z del esferoide (paso de 40 m) en (a) esferoide dinámico rastreado a lo largo de 18 h (imagen con intervalo de 3 h) en (b). Células expresadas establemente mCherry nuclear (naranja) y GFP citoflásimo (azul). Escala: 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Movie 1
Película 1: Dinámica esferoide P3 grabada a lo largo de 18 h (imagen cada 30 min). Barra de escala a 100 m. La película representa una pila Z fusionada a lo largo del tiempo con un paso En Z de 5 m para un volumen total aproximado de 150 m. Las células se infectaron con lentivirus para expresar NLS:mCherry (los núcleos son naranjas) y con GFP citoplasm (color azul). Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).

Documento Suplementario 1: Macro de Fiji para analizar la invasión, proliferación y migración de esferoides 3D. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).

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Discussion

Los ensayos con esferoides tumorales están bien adaptados para estudiar las características tumorales, incluida la proliferación, la invasión y la migración, así como la muerte celular y la respuesta a las drogas. Las células cancerosas invaden la matriz 3D formando un microtumor invasivo, como se ve en la Figura 4B,C. Durante el proceso invasivo, las matrices de digestión de la matriz de metaloproteinasas (MMP) que rodean las células tumorales13e inhibidores de MMP (por ejemplo, GM6001 o Rebimastat) pueden afectar la invasión celular, pero no la migración14. La migración y la invasión implican eventos moleculares superpuestos pero separados15,que se pueden estudiar en nuestro ensayo esferoide. Para ello, las vías de señalización específicas pueden apuntar a nivel genético o a través de la inhibición farmacológica.

Se sabe que los glioblastomas invaden ampliamente los tejidos circundantes por diferentes procesos (por ejemplo, cooptación, invasión del tracto de materia blanca, invasión intersticial)16. Recientemente describimos dos nuevos mecanismos de invasión de glioblastoma9,12,17. En particular, estudiamos trombospondina-1 matricelular (TSP1) y mostramos que está implicada en la invasión de células tumorales a través de la activación de CD47 en células tumorales12. Además, utilizando un enfoque proteómico, descubrimos el papel inesperado de PLP1 y DNM1 en la invasión GBM17. En estos estudios, los ensayos de invasión 3D se utilizaron con éxito con o sin obstrucción farmacológica de TSP1, PLP1 o DNM1. Además de la obstrucción farmacológica, también mostramos que el tratamiento ácido con cloruro de hidrógeno afecta la invasión en el ensayo 3D. Se sabe que la acidosis tumoral activa una serie de vías de señalización, incluyendo vías metabólicas (glucólisis), factores de crecimiento como TGF, e inhibe la respuesta inmune5.

Los cultivos tridimensionales proporcionan un entorno más fisiológico relevante que los cultivos 2D, y muchos parámetros moleculares y metabólicos pueden estar regulados de manera diferente. Por lo tanto, la modulación farmacológica puede tener un impacto diferente. En consecuencia, además de la inmunohistología estándar, los eventos metabólicos también se pueden estudiar en el cultivo 3D utilizando sondas como 2-DG-IR. Para corroborar estos hallazgos, el inhibidor del complejo de la cadena de transporte de electrones I también se puede utilizar en este contexto.

Además, el sistema de cultivo 3D también es adecuado para el estudio de procesos dinámicos utilizando imágenes en vivo en condiciones basales o en presencia de estímulos o señales farmacológicas.

Se deben tener en cuenta los siguientes pasos críticos al llevar a cabo los procedimientos descritos en este artículo: 1) El diámetro de los esferoides no debe superar los 400 m para evitar la necrosis; 2) La cuantificación de la invasión utilizando el software de Fiji debe calibrarse cuidadosamente y realizarse como se indica en la descripción detallada del procedimiento.; 3) La rigidez del gel debe ser adecuada para sostener el esferoide en una configuración estable; 4) El valor del pH debe ser controlado, ya que un pH muy ácido impedirá el proceso de invasión.

Una limitación del sistema esferoide descrito en este artículo es la falta del microambiente tumoral completo. Reconocemos que la matriz utilizada no representa completamente el estroma encontrado en el glioblastoma. Sin embargo, los colágenos son parte de la matriz cerebral y queríamos desarrollar un ensayo listo y fácil de usar que se pueda utilizar en cualquier laboratorio. Sin embargo, futuros experimentos también pueden incluir componentes de matriz adicionales, así como elementos celulares, incluyendo células estromales e inmunitarias. Otro nivel de complejidad es la inclusión de componentes neuronales, pero estos experimentos deben ser cuidadosamente calibrados y diseñados.

En conclusión, creemos que nuestro sistema 3D esferoide y las herramientas analíticas que proporcionamos en este artículo pueden ser útiles para los investigadores, especialmente en el estudio del desarrollo de tumores cerebrales.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon es becario del Hospital Universitario de Toulouse (CHU Toulouse).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

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References

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Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma
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Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,… More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

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