Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Published: April 9, 2020 doi: 10.3791/60998

Summary

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Abstract

İki boyutlu (2D) hücre kültürleri in vivo tümör büyümesini tatmin edici bir şekilde taklit etmez. Bu nedenle üç boyutlu (3D) kültür spheroid modelleri geliştirilmiştir. Bu modeller nöro-onkoloji alanında özellikle önemli olabilir. Gerçekten de, beyin tümörleri sağlıklı beyin ortamı işgal eğilimi var. Burada tümör invazyonunu incelemek için geliştirdiğimiz ideal 3Boyutlu glioblastoma spheroid tabanlı bir test tanımlıyoruz. Bu analizi başarıyla gerçekleştirmek için tüm teknik ayrıntıları ve analitik araçları salıyoruz.

Introduction

Birincil veya ticari olarak mevcut hücre hatları kullanılarak yapılan çalışmaların çoğunda, tahliller tek katmanlı kültürler olarak plastik yüzeylerde yetiştirilen hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Hücre kültürünü n in vivo 3D hücre ortamını taklit etmediği için, hücre kültürünü 2B olarak yönetmek dezavantajları temsil eder. 2B kültürlerde, tüm hücre yüzeyi ortamla doğrudan temas halindedir, hücre büyümesini değiştirir ve ilaç bulunabilirliğini değiştirir. Ayrıca, fizyolojik olmayan plastik yüzey hücre farklılaşmasını tetikler1. Bu zorlukların üstesinden gelmek için üç boyutlu kültür modelleri geliştirilmiştir. Onlar tümörlerin çok hücreli mimarisi ve heterojenite taklit avantajı var2, ve böylece katı tümörler için daha uygun bir model olarak kabul edilebilir3. Küresel lerin karmaşık morfolojisi ilaç penetrans ve direnç4daha iyi değerlendirilmesine katkıda bulunur. Küresel tümör heterojenitesi oksijen ve besin lerin difüzyonunu ve farmakolojik ajanlara yanıtı etkiler (Şekil 1A). Küresel boyut 300 μm'ye ulaştığında oksijen difüzyonu değişir ve küreseloidin merkezinde hipoksik bir ortam ortaya çıkarır(Şekil 1A,C). Metabolitler de hücre tabakaları ile daha az nüfuz ve metabolik reaksiyonlar telafi5yer alır. Küresel çapı arttığında, nekrotik çekirdekler görülebilir, daha fazla taklit özellikleri birçok katı kanserlerde bulunan, agresif beyin kanseri glioblastoma dahil (GBM)6.

Glioblastom için birkaç 2D veya 3D invazyon tahlilleri literatürde bildirilmiştir7,8. İki boyutlu tahliller esas olarak ince bir matris tabakası üzerinde yatay bir düzlemde veya Boyden odası tahlil9işgali incelemek içindir. Klasik glioblastoma hücre hatları10kullanılarak 3Boyutlu spheroid kültürleri ile üç boyutlu tahliller tanımlanmıştır. Daha karmaşık varyantlar çatışma kültürleri11tümör spheroids tarafından beyin organoidlerin invazyonu ile temsil edilmektedir. Ancak, herhangi bir laboratuvar için kolay kullanımlı ve tekrarlanabilir bir test geliştirmek hala önemlidir. Hasta örneklerinden glioblastoma kök benzeri hücreler üretmek için bir protokol geliştirdik. Bu tahlillerin sayısallaştırılması kolayca yönetilebilir ve sadece açık erişimli çevrimiçi yazılım gerektirir. Kısaca, tümör parçaları küçük parçalar halinde kesilir ve enzimatik olarak sindirilir. Sindirimden elde edilen tek hücreler nörobazal ortamda yetiştirilir. 4-7 gün sonra küresel yapılar kendiliğinden oluşur. Fare modellerinde intrakranial implantasyon üzerine, psödo-palisading hücreleri ile çevrili bir nekrotik çekirdek sergileyen tümörler oluştururlar12. Bu, GBM hastalarında bulunan özelliklere çok benzer.

Bu makalede, tekrarlanabilirliği sağlamak için belirlenen sayıda hücreden küresel üreme protokolümüzü açıklıyoruz. Bu amaçla iki tamamlayıcı matris kullanılabilir: Matrigel ve kollajen tip I. Matrigel büyüme faktörleri ile zenginleştirilmiştir ve hücre bağlanması ve göçü için gerekli olan memeli bazal zarını taklit eder. Öte yandan, kollajen tip I, stroma yapısal bir unsur, en sık görülen fibrillary ekstrasellüler matriks ve hücre invazyon tahlillerinde kullanılır. Burada, göç ve proliferasyon tahlilleri yaparak GBM küresel modelimizi gösteriyoruz. Analiz sadece sabit zaman noktalarında değil, aynı zamanda canlı görüntüleme ile küresel genişleme ve hücre hareketi izleyerek yapıldı. Ayrıca morfolojik detayları görselleştirmek için elektron mikroskobu yapıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hastalardan (Yerel etik komitesi yönetmeliklerine göre Haukeland Hastanesi, Bergen, Norveç'ten) yazılı onay alındı. Protokolümüz kurumumuzun insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.

1. Tek tip boyutta tümör küresellerinin üretimi

NOT: Kök benzeri hücreler b27 takviyesi ile tamamlanan nörobazal ortamda kültürlü, heparin, FGF-2, penisilin, ve streptomisin, önceki makalelerde açıklandığı gibi12. Bu hücreler kültürde kendiliğinden küresel oluştururlar.

  1. Tümör hücrelerini 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücreleri 0,5-1 mL ayrışma enzimi ile kuluçkaya yatırın (Bkz. Malzeme Tablosu)37 °C'de 5 dakika süreyle.
  2. 4-4,5 mL PBS ile yıkayın ve tam büyüme ortamının 10 mL'sini ekleyin (komple nörobazal ortam, cNBM).
  3. Trypan mavisi ve hücre sayma odası slaytı ile otomatik sayma tekniği kullanarak hücreleri say.
  4. Sferoid başına 104 hücreli 100 küresel sferoid üretmek için (tercih edilen boyuta göre) 106 hücreyi 8 mL NBM'de 2 mL ile %2 ml'lik metilselüloz ile karıştırın.
  5. Süspansiyonu steril bir sistem kabına aktarın ve çok kanallı pipetle 100 μL/iyi yi 96 iyi yuvarlak alt plakaya dağıtın.
  6. Plakayı 37 °C, %5 CO2 ve %95 nem de kuluçkaya yatırın. Eşit büyüklükte küresel ler oluşacak ve 3-4 gün sonra kullanılabilir.

2. Üç boyutlu deneyler

  1. Çoğalması
    1. Hazırlık
      1. Inhibitörleri (örneğin, Şekil 4A'dakigibi rotenon) ve 100°L ortadaki kimyasalları askıya alın ve her kuyuda 100°L orta (yani kuyu başına bir küresel oid) ekleyin.
      2. Plakayı 37 °C, %5 CO2ve %95 nem de kuluçkaya yatırın.
    2. Görüntü edinimi ve analizi
      1. T0'da bir dizi koşul oluşturmak için brightfield'da bir video mikroskobuyla fotoğraf çekin ve aşağıdaki saatlerde beklenen.
      2. Resimleri el ile veya yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için Fiji'yi kullanın. Bunu el ile yapmak için, serbest seçim aracı ile küresel çekirdek etrafında bir daire çizin ve her küresel alanın ölçün. Görüntüleri yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için, Ek Belge 1'de yalnızca //Core Area ile gösterilen makroyu kullanın.
  2. Işgali
    1. Hazırlık
      1. 1 mg/mL son konsantrasyonda tip I kollajen, 1x PBS, 0.023xVkollajen,1 M sodyum hidroksit ve steril H2O. 30 dakika buz üzerinde çözelti inkübün tip I kollajen ile buz üzerinde bir tüp kollajen matris hazırlayın.
      2. 500 μL tüplerde yuvarlak alt kuyu plakasından küresel leri toplayın ve 200 μL 1x PBS ile 2x yıkayın.
      3. Pipet küresel leri kollajen matrisin 100 μL'lik kısmına dikkatlice yerleştirin ve normal 96 kuyu plakalı bir kuyunun ortasına yerleştirin.
      4. 37 °C'de 30 dakika kollajen jel inkübün ve sonra jel üstüne cNBM ekleyin. Inhibitörler veya aktivatörler (örneğin, Şekil 4B, 4C'degösterildiği gibi hidrojen klorür) bu adımda ortama eklenebilir.
    2. Görüntü edinimi ve analizi
      1. Kollajen eklenmesinden sonra brightfield modunda 24 saat video mikroskobu ile sırayla fotoğraf çekin.
      2. Resimleri el ile veya yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için Fiji'yi kullanın. Bunu el ile yapmak için, serbest seçim aracı ile çekirdek ve küresel toplam alanı etrafında çizmek ve çekirdek alanı ile toplam alanı çıkararak her küresel invaziv alanı ölçmek. Görüntüleri yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için, invaziv alanı belirlemek için Ek Belge 1'de belirtildiği gibi makroyu kullanın.
  3. Geçiş
    1. Hazırlık
      1. 37 °C'de 30 dakika boyunca NBM'de Matrigel (0.2 mg/mL) ile 6 kuyulu bir plaka katın, sonra Matrigel'i çıkarın ve 2 mL cNBM ekleyin.
      2. Spheroidleri yuvarlak alt kuyu plakasından 6 kuyu plakasına 50 μL cNBM'ye aktarın.
      3. Plakayı 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve küresel lerin yapışmasını bekleyin.
      4. 24 saat kuluçkadan sonra, 10 ng/mL Hoechst ile leke ve 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
    2. Görüntü edinimi ve analizi
      1. Brightfield'da bir video mikroskobu kullanarak görüntü elde edin. 405 nm lazer Hoechst boyama görselleştirme için kullanılır.
      2. Resimleri analiz etmek ve Makroyu Ek Belge 1'debelirtildiği gibi çalıştırmak için Fiji yazılımını kullanın.
        NOT: Kuyunun dibine dokunmak veya süpernatantı tamamen çıkarmak küresel lere zarar verir. Kollajen tip I jel işleme için, kollajen polimerizasyon önlemek için buz üzerinde jel tutmak, pH değişikliği jel kompaktlık etkileyecek, çünkü asidik bir bileşen eklemeyin, ve pipet hücreleri hızla hücre ölümü ve jel bozulmasını önlemek için kollajen içine.

3. Fiji Makro

NOT: Fiji, kamu malı olarak geliştirilen ve makroların geliştirilmesinin görüntü analizini hızlandırmasına olanak tanıyan bir görüntü analizi programıdır. Manuel analiz de mümkündür, ancak bu yavaş bir süreçtir ve önyargılar getirebilir. Görüntüler, yazılımdaki sürükle ve bırak ile içe aktarılabilir ve YG Manager Tools eklentisi ile ölçülebilir. Bu çalışmada kullanılan prosedür aşağıda açıklanmıştır:

  1. Makro penceresini açın: Eklentiler | Makrolar | İnteraktif Tercüman.
  2. Aşağıdaki uyarlanmış mor döngüyü kopyalayın ve yapıştırın. Mor cümlelertutun ve ilgi yeşil cümleler ekleyin(Ek Belge 1).
  3. Tüm serileri analiz etmek için, belirli bir nicelik için parametreleri kırmızı ya da Makrolar'ı kullanarak çalıştırın | Makro'yu çalıştırın veya Ctrl+Rtuşuna basın.
  4. İlgi alanı (YG) tarafından kontrol edin ve gerekirse el ile uyarla.

4. Küresellerin elektron mikroskobu

NOT: Aşağıdaki adımların çoğu kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.

  1. Fiksasyon adımı
    1. Kesilmiş pipet ucu ile küresel toplamak, bir 1.5 mL tüp koymak ve 0.1 M fosfat tampon (PB) ile 1x yıkayın.
    2. Küresel oidi bir gecede 4 °C'de %2 glutaraldehit/%2 paraformaldehit (PFA) 0,1 M PB olarak düzeltin.
    3. Fiksasyon çözeltisini 0,1 M PB'de %1 PFA çözeltisi ve ardından numune hazırlama ile değiştirin.
  2. Numune hazırlama
    1. Bir süzgeç içine spheroids aktarın ve küresel hasarı önlemek için bir cam kabına koyun.
    2. 3x'i 0,1 M PB ile dikkatlice yıkayın.
    3. Karanlıkta 2 saat osmiyum ile kuluçka. Osmiyum%4'ü %1 0,1 M PB tamponunda seyreltin.
    4. 3x'i 0,1 M PB ile dikkatlice yıkayın.
      1. Aşağıdaki gibi dehydrate: 10 dakika için% 50 etanol, 10 dakika için% 70 etanol, 15 dakika için 2x 90% etanol, 2x 100% etanol 20 dakika ve 30 dakika için 2x aseton.
    5. Örnekleri 50/50 aseton/rekarn karışımında 2 saat kuluçkaya yatırın. Bu adımda EPON reşinini hazırlayın (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4.5 g).
    6. Aseton/rekarn karışımını atın, taze hazırlanmış rezorile değiştirin ve bir gecede kuluçkaya yatırın.
    7. Resenini yenisi ile değiştirin ve 2-6 saat arasında kuluçkaya yatırın.
    8. Reşattaki küresel leri 60 °C'de 48-72 saat kalıba ekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokoller bölümünde açıklandığı gibi spheroidler hazırlandı ve göç, invazyon, proliferasyon ve mikroskopi ile ilgili gözlemler yapıldı. Küresel yapının farklı alanlarında ki hipoksiyi ölçmek için hipoksik aktiviteyi belirlemek için karboksik anhidraz IX boyama kullanılmıştır(Şekil 1A-C). Küresel merkezde daha fazla CAIX-pozitif hücre gözlendi (Şekil 1A-C). Küresel çekirdekte bulunan hipoksik hücreler çevredekilere göre daha glikolitik olma eğilimindedir. Mitokondri elektron mikroskobu ile gösterildiği gibi daha fazla analiz için görüntülenebilir (Şekil 1Ba-1Bb). 2.5 x 103,5 x 103,104veya 2 x 104 hücreden oluşan küresel çapta sırasıyla 350, 400, 500 veya 650 μm'den oluşan küresel çaplar sergilenmektedir (Şekil 2A). Skadaroidler deneybaşladıktan sonra 4 gün içinde kullanılabilir(Şekil 2B). Her bir tayın niceliği (yani, çoğalma, istila, göç) Şekil 3'tegösterilmiştir. Fiji makroları çoğalma, istila veya göçü ölçmek için geliştirilmiştir(Şekil 3 ve Ek Belge 1).

Küresel çekirdeğin artması hücre çoğalmasının uyarılmasını yansıtmaktadır (Şekil 4A). Mitokondriyal solunum zincirinin kompleks I'inin yerleşik bir inhibitörü olan rotenon tarafından inhibisyonu üzerine, mitokondrideki ATP üretiminin büyük çoğunluğu tehlikeye girdi. Sonuç olarak, 72 saat sonra proliferasyon %20 oranında azalmıştır (Şekil 4A). Kollajen tip I'in invazyonu, toplam alanın çekirdek alandan çekilmesi ile hesaplanmıştır. Asidik tedavi 24 saat(Şekil 4B)bir süre boyunca gelişmiş invazyon . Ayrıca hidrojen klorür tedavisinin küresel lerin göç alanını kontrole göre 1,5 kat azalttığını tespit ettik (Şekil 4C). Küresel dinamikler UniverSlide13canlı görüntüleme için montaj tarafından çalışılmıştır. Spheroidler yüksek iç dinamiklere sahipti ve hızlı hareket etti(Film 1 ve Şekil 4D'deizleme analizi).

Figure 1
Şekil 1: Küresel tümörleri taklit etmek için uygun bir modeldir. (A) Farklı alanlara sahip yuvarlak 3Boyutlu yapı olarak sferoid. (a) Bir P3 küresel bir parlak alan resmi yoğun bir merkezi alana sahip yuvarlak bir görünüm gösterir. Ölçek = 100 μm. (b) Hirschhaeuser ve ark.6'dan uyarlanan şematik gösterim, küresel oidde O2, CO2, metabolit ve katabolit gradyanlarını gösterir. (c) Sol panel: DAPI (mavi) ile boyanmış ve karboksi anhidraz IX (yeşil) karşı antikorlar ile boyanmış bir küresel konfokal resim. Sağ panel: kesikli bölgeden floresan nicelik. Ölçek = 100 μm. (B) Elektron mikroskopi görüntüleri ile delineated mitokondri (kesik çizgiler). Büyük mitokondri ler proliferasyon alanında daha küçük ken quiescentarea görülür. Ölçek = 250 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Genel küresel hazırlık adımları. (A) İnsan P3 glioblastoma küresel oidlerin üretimi. Temsili görüntüler sol panelde ve buna karşılık gelen proliferasyon analizi sağ panelde dir. Saat 24'te P3 hücreleri yoğun küresel oidler oluşturdular. İlk hücre sayısı küresellerin büyüklüğünü belirledi. Ölçek çubuğu = 250 μm. (B) Proliferasyon, istila veya göç için kolay protokollerin şematik çizimi. Çeşitli koşullar altında spheroids: (a) Tümör büyümesi için serumsuz ortamda, (b) Tek hücre invazyonu kolaylaştırmak için kollajen matris, ve (c) Hücre göçü için Matrigel kaplama açık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Fiji yazılımı ile in vitro tahlillerin sayısallaştırılması. Fiji kullanılarak elde edilen ilgi alanlarının (ROI) temsili. Çekirdek alanı kırmızı ve çekirdek alanı içeren toplam alan, sarı temsil edilir. İnvaziv alan çekirdek alandan toplam alanın çekilmesi karşılık gelir. (A) Çoğalma titreşme. (B) Brightfield kazanımlarında kollajen jelde invazyon tolası. (C) Floresan edinimi ile Matrigel kaplama üzerinde göç titreti. Çekirdekler DAPI ile boyanmış, mavi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Glioblastoma P3 spheroid proliferasyon, invazyon veya göç tahlilleri. (A) Çoğalma titreşme. Sol panel: Kontrol olarak DMSO ile veya 20 μM rotenone (solunum zinciri kompleksi I inhibitörü) ile 0 veya 72 saat zaman temsilci resimleri. Sağ panel: Spheroid alan niceliği görüntülerde kesik çizgiler olarak temsil edilir. Ölçek = 250 μm. (B) Kollajen matrisinde invazyon istâsı. Sol panel: 20 mM hidrojen klorürlü veya olmayan temsilci resimleri, saat 0 veya 24 saat. Sağ panel: İnvaziv alanların sayısallaştırılması. Ölçek = 100 μm. (C) Matrigel kaplama üzerinde geçiş titreci. Sol panel: Brightfield modunda ki temsili görüntüler saat 0 veya 24 h. Büyütülmüş alanlar alt panellerde temsil edilir. Sağ panel: Göçmen bölgelerinin sayısallaştırılması. Ölçek = 250 μm. (D) Sferoidin Z-yığın gösterimi (40 μm adım) içinde (a) küresel dinamik 18 saat (3 saat aralıklı görüntü) içinde izlenir (b). Hücreler stably nükleer mCherry (turuncu) ve sitoplazmik GFP (mavi) ifade. Ölçek = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Movie 1
Film 1: P3 küresel dinamik 18 saat (her 30 dakikada bir görüntü) üzerinde kaydedildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Film, yaklaşık 150 μm'lik bir hacim için 5 μm'lik bir Z-adımı ile zaman içinde birleştirilmiş bir Z yığınını temsil eder. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Ek Belge 1: 3D küresel istila, proliferasyon ve göç analiz etmek için Fiji makro. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tümör spheroid tahlilleri, proliferasyon, invazyon ve göçün yanı sıra hücre ölümü ve ilaç yanıtı gibi tümör özelliklerini incelemek için iyi adapte edilmiştir. Kanser hücreleri, Şekil 4B,C'degörüldüğü gibi invaziv bir mikrotümör oluşturan 3D matrisi istila eder. İnvaziv süreç sırasında, matriks metalloproteinazlar (MMP) tümör hücrelerini çevreleyen matrisleri sindirir13, ve MMP inhibitörleri (örneğin, GM6001 veya Rebimastat) hücre invazyonunu bozabilir, ancak göç14. Göç ve istila örtüşen ama ayrı moleküler olaylariçerir 15, bizim spheroid analizi incelenebilir. Bunu yapmak için, spesifik sinyal yolları genetik düzeyde ya da farmakolojik inhibisyon yoluyla hedeflenebilir.

Glioblastomların çevre dokuları farklı süreçlerle yoğun bir şekilde istila ettiği bilinmektedir (örn. ortak seçenek, beyaz madde yolu istilası, interstisyel invazyon)16. Yakın zamanda glioblastoma invazyonu9,12,17iki yeni mekanizmalar açıklanmıştır. Özellikle, biz matrisellüler trombopondin-1 okudu (TSP1) ve tümör hücrelerinde CD47 aktivasyonu ile tümör hücre invazyonu dahil olduğunu gösterdi12. Ayrıca, proteomik bir yaklaşım kullanarak, BIZ GBM işgali17PLP1 ve DNM1 beklenmedik rolü keşfetti. Bu çalışmalarda, 3D invazyon testleri tsp1, PLP1 veya DNM1 farmakolojik obstrüksiyonu olan veya olmayan başarıyla kullanılmıştır. Farmakolojik tıkanıklığın yanı sıra, hidrojen klorür ile asit tedavisinin 3Boyutlu tetkiklerde invazyonu etkilediğini de gösterdik. Tümör asidozunun metabolik yollar (glikolizi), TGFβ olarak büyüme faktörleri de dahil olmak üzere bir dizi sinyal yollarını aktive ettiği ve immün yanıtı inhibe ettiği bilinmektedir5.

Üç boyutlu kültürler 2B kültürlere göre daha fizyolojik olarak ilgili bir ortam sağlar ve birçok moleküler ve metabolik parametreler farklı şekilde düzenlenebilir. Bu nedenle farmakolojik modülasyonun farklı bir etkisi olabilir. Sonuç olarak, standart immünohistolojinin yanı sıra, metabolik olaylar 2-DG-IR gibi problar kullanılarak 3Boyutlu kültürde de incelenebilir. Bu bulguları doğrulamak için, elektron taşıma zinciri kompleksi I inhibitörü de bu bağlamda kullanılabilir.

Ayrıca, 3D kültür sistemi de bazal koşullar altında canlı görüntüleme kullanarak dinamik süreçlerin çalışma için ya da uyarıcı veya farmakolojik ipuçları varlığında uygundur.

Bu maddede açıklanan işlemler yapılırken aşağıdaki kritik adımlar göz önünde bulundurulmalıdır: 1) Nekrozdan kaçınmak için küresel çap 400 μm'yi geçmemelidir; 2) Fiji yazılımı kullanılarak işgalin nicelleştirilmesi dikkatle kalibre edilmeli ve prosedürün ayrıntılı açıklamasında belirtildiği gibi gerçekleştirilmelidir.; 3) Jel sertliği istikrarlı bir yapılandırmada küresel tutmak için uygun olmalıdır; 4) Çok asidik bir pH istila sürecini engelleyecek tir.

Bu makalede açıklanan küresel sistemin bir sınırlama tam tümör mikroenvironment eksikliğidir. Kullanılan matrisin glioblastomada bulunan stromayı tam olarak temsil etmediğini kabul ediyoruz. Ancak, kollajenler beyin matrisinin bir parçasıdır ve biz herhangi bir laboratuvarda kullanılabilir bir hazır ve kullanımı kolay bir test geliştirmek istedim. Bununla birlikte, gelecekteki deneyler de ek matris bileşenleri yanı sıra stromal ve bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere hücresel elemanları içerebilir. Karmaşıklığı başka bir düzeyde nöronal bileşenlerin dahil, ancak bu deneyler dikkatle kalibre ve tasarlanmış olmalıdır.

Sonuç olarak, bizim sheroid 3D sistemi ve bu makalede sağladığıanalitik araçlar araştırmacılar için yararlı olabilir inanıyoruz, özellikle beyin tümörü gelişimi çalışmalarında.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Bu çalışma Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime) tarafından desteklenmiştir. Joris Guyon, Toulouse Üniversitesi Hastanesi'nden (CHU Toulouse) burs sahibidir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well round-bottom plate Falcon 08-772-212
Accutase Gibco A11105-01 Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283
DPBS 10X Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm2 Falcon 10497302
Matrigel Corning 354230 Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Neurobasal medium Gibco 21103049 Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used to cell counting
Type I Collagen Corning 354236 Stored at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelissier, F. A., et al. Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors. Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).
  2. Ishiguro, T., et al. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108, 283-289 (2017).
  3. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  4. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance? Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).
  5. Corbet, C., Feron, O. Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat. Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. (105), e53409 (2015).
  8. Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e60122 (2019).
  9. Boye, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  10. Dejeans, N., et al. Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA. Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).
  11. Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro. International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).
  12. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  13. Friedl, P., Wolf, K. Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion. Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).
  14. Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins. Scientific Reports. 7, 14219 (2017).
  15. Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition. Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).
  16. de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways. Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).
  17. Daubon, T., et al. The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection. Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029 (2019).

Tags

Kanser Araştırmaları Sayı 158 glioblastom hasta kaynaklı hücre küresel invazyon göç proliferasyon in vitro modeller
Glioblastoma için 3D Spheroid Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N.,More

Guyon, J., Andrique, L., Pujol, N., Røsland, G. V., Recher, G., Bikfalvi, A., Daubon, T. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (158), e60998, doi:10.3791/60998 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter