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Immunology and Infection

マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移

doi: 10.3791/61003 Published: May 31, 2020

Summary

ここでは、生体内B-1a細胞の移行および局在化を調べるマウスB-1a細胞のレトロウイルス過剰発現および導入導入の方法について説明する。このプロトコルは、ドナーB-1a細胞の局在化の定量化や、導入後のドナー細胞由来分泌因子の分析を含む、多様な下流機能アッセイに拡張することができる。

Abstract

細胞機能は細胞微小環境におけるニッチ特有の因子の影響を受けるため、細胞の局在化および移行を解剖する方法は、細胞機能に関するさらなる洞察を提供することができる。B-1a細胞は、健康および疾患の間に生じる酸化特異的エピトープに対して保護的な天然IgM抗体を産生するマウスにおけるユニークなB細胞サブセットである。B-1a細胞IgMの産生はB-1a細胞の位置によって異なるため、治療的観点からB-1a局在化を標的とする標的、高い抗体産生を支持するニッチまで有用となる。ここでは、C-X-Cモチーフケモカイン受容体4(CXCR4)のレトロウイルス媒介過剰発現により骨髄へのB-1a細胞移行を標的とする方法について説明する。原発性マウスB細胞における遺伝子誘導は困難であり、通常は技術に応じて10〜20%の低いトランスフェクション効率をもたらす。ここでは、原生マウスB-1a細胞のレトロウイルス伝達が30〜40%のトランスダクション効率をもたらすことを実証する。この方法は、ドナーB-1a細胞の移行および局在化を可視化できるように、B細胞欠損レシピエントマウスへのB細胞欠損型マウスへの導入されたB-1a細胞の導入細胞移管を利用する。このプロトコルは、他のレトロウイルス構造のために変更することができ、ドナー細胞または宿主細胞表現型および機能の分析、またはポストB-1a細胞転写の可分泌因子の分析を含む、養子導入後の多様な機能アッセイで使用することができる。CD45.1およびCD45.2の同種別によって分化された別個のドナーおよびレシピエントマウスの使用およびレトロウイルスプラスミド内のGFPレポーターの存在はまた、内因性B細胞集団を含む他の免疫不十分なマウスモデルにおけるドナー細胞の検出を可能にすることができる。

Introduction

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最近の研究では、かなりの免疫細胞、特にB細胞、細胞の,局在1、2、3、4、52,3に依存1するフェノティピックおよび機能的異質性が実証されている。4,5B-1a細胞は、保護IgM抗体を産生する異種能力を有するそのような集団の1つである。骨髄B-1a細胞は、IgMを構成的に分泌し、血漿IgM力価6に大きく寄与する一方、腹膜B-1a細胞は恒常性で低レベルのIgM分泌を有し、代わりに自然なToll-like受容体(TLR)またはサイトカイン媒介シグナル伝達を介して活性化7,8,9,することができる。B-1a細胞IgM抗体は、病原体、アポトーシス細胞、および酸化LDLに存在する酸化特異的エピトープ(OSE)を認識し、OSEにIgM結合すると、アテローム性動脈硬化症などの疾患における炎症性下流シグナル伝達を防ぐことができる。したがって、骨髄のような部位への腹膜B-1a細胞遊泳を介してIgM産生を増加させる戦略は治療的に有用であり得る。しかし、オフターゲット効果が免疫機能や健康に悪影響を及ぼす可能性があるため、このような戦略を標的とし、細胞型特異的であることが重要です。

ここでは、一次マウスB-1a細胞におけるCXCR4の標的化および長期過剰発現の方法と、その後の細胞移動および機能IgM抗体産生を可視化するためのその後の導入導入について説明する(図1)。原発性B細胞の遺伝子操作は、トランスフェクション細胞株のトランスフェクションに比べてトランスフェクション効率が低い場合に制限されます。しかし、形質転換細胞株が12,13の原細胞から著しく逸脱する可能性があるため13初等細胞の使用は、通常の生理学により密接に一致する結果をもたらす可能性が高い。レトロウイルス伝達、アデノウイルス伝達、リポフェクション、またはエレクトロポレーションベースのトランスフェクションを含む、一次マウスB細胞における遺伝子導入に関するいくつかの技術が記載,14,されているが、これは、効率、一過性、および細胞の健康への影響のレベルが異なる。以下の方法は、細胞生存率に影響を及ぼしながら>30%の十分な遺伝子導入効率を生み出すため、レトロウイルス伝達を利用した。CXCR4発現レトロウイルスは、前述のレトロウイルス構築マウス幹細胞ウイルス-内部リボソームエントリー部位-緑色蛍光タンパク質(MSCV-IRES-GFP;MigR1)16,マウスCXCR4遺伝子がクローン4をサブクローニングした.MigR1 (制御(Ctl)-GFP) およびCXCR4-GFPレトロウイルス粒子は、前に公開されたプロトコル4,,14に記載されているようにリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して生成した。

正常にB-1a細胞を導入し、次いで静脈内にリンパ球欠損Rag1-/-マウスに移した。ドナーマウスとレシピエントマウスの両方に、さらにアポリポプロテインE(ApoE)遺伝子のノックアウトが含まれ、OSE蓄積およびアテローム性動脈硬化が増加し、それによってインビボB-1細胞活性化およびIgM産生のモデルを提供する。さらに、ドナーマウスとレシピエントマウスはCD45同種で異なった。ドナーB-1細胞はCD45.1+ApoE-/-マウスから来て、Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-レシピエントに移された。-/- -/-これにより、フローサイトメトリー分析中にB細胞マーカーの染色を追加する必要なしに、レシピエントCD45.2B細胞からのドナーCD45.1の転写後の分化が可能となった。ここで示した結果は、B-1a細胞上の標的CXCR4過剰発現が、B-1a細胞が骨髄に移行する能力の増加と関連していることを示し、これは血漿抗OSE IgMの増加と関連している。さらに、負選択による腹膜B-1細胞の濃縮方法を提供し、効率的なトランスダクションのためのB-1細胞活性化の要件を実証する。この方法は、B-1a細胞遊マイグレーション、表現型、または機能に対するタンパク質過剰発現の影響を研究するために、他のレトロウイルス構築物に適応することができる。さらに、CD45.1対CD45.2の同種区別の使用は、理論的には内因性B細胞を含む他の免疫不足のマウスモデルへの伝達を可能にする可能性がある。

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Protocol

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すべての動物のプロトコルは、バージニア大学の動物のケアと使用委員会によって承認されました.

1. 腹膜B-1細胞の磁気分離と濃縮

  1. CO2を使用して、12-14 週齢の男性、CD45.1+ApoE-/-マウスを安楽死させる。
  2. まっすぐな外科用はさみを使用して腹部に表面的なカットを行い、骨曲がったはさみを使用して皮膚を剥がして腹壁を露出させます。10 mLシリンジと25G針を使用して、10 mLの37°C RPMI-1640培地で腹腔を洗い流します。マウスを振って、尾を握り、マウス側を十分に左右に動かして細胞を外します。
    注:溶かした腹土をマッサージすると、細胞の回復を最大化することもできます。
  3. 腸の近く、股関節のレベルのすぐ上の腹膜の右下側に液体を描くことによって、10 mLシリンジと25G針を使用して腹膜液を収集します。エピディジマル脂肪デポと基礎臓器を破壊しないでください。オメンタル脂肪は注射器に簡単に引き込むことができるので、マウスの左側から流体を引き出さないでください。
  4. ~6~7 mLの流体が採取されたら、氷の上に配置された50 mLの円錐管に分配します。次に、残りの流体が腹腔の底に残るように、鉗子を使用してダイヤフラムの上に腹膜壁を保持することによって、マウスを垂直に高めます。肝臓の上の外科用はさみを使用して腹壁に小さな切り傷を行い(肝臓を切断しないようにしてください)、ガラスピペットと球根を使用して残りの腹膜液を収集します。
  5. すべてのCD45.1+ApoE-/-マウス(n = 15-20)から50 mL円錐管に腹膜洗浄細胞をプールし、氷の上に保存します。
    注: 必要なマウス数の計算: B-1a細胞は腹膜総集団の5-10%を含み、著者の手でマウス1匹あたりおよそ2.5-5 x 105 B-1a細胞を得る。以下に示すように、トランスダクション効率は~30~40%です。
  6. トリパンブルーやヘモサイトメーターなどの生存性染料を使用して生細胞を数えます(トリパンブルーでサンプル1:5を希釈し、ヘモサイトメーターチャンバーに10μLをロードします)。1つの管の1 x 10の8細胞までの細胞をプールする。遠心分離細胞は4°Cで5g分間400xgで、次いで吸気上清を吸引した。
  7. 1 mLの抗CD16/CD32抗体(材料表)で最大1 x 108細胞をアッセイバッファー(1xリン酸緩衝生理食塩水[PBS]、0.5%ウシ血清アルブミン[BSA]、2 mM EDTA)で1:50希釈してFc受容体を遮断する。必要に応じてセル数に基づいてスケールします。氷の上で4°Cで10分間インキュベートします。
  8. 滅菌のためのアッセイバッファーにビオチン化抗体の2倍のマスターミックスを調製します(表1)。2xマスターミックスは、抗CD16/CD32でインキュベートする際に細胞がすでに入っている液体の体積を占めています。例えば、細胞が500μLの希釈抗CD16/CD32でインキュベートしている場合、10μLのビオチン化Ter119、Gr-1、CD23、およびNK1.1抗体を含む2xマスターミックスの500 μLを加え、25μLのビオチン化F4/80抗体を添加して、最終的な濃度を達成する。細胞に2倍のマスターミックスを加え、4°Cで20分間染色します。
  9. 5 mLのアッセイバッファーと遠心分離機を400 x gで4°Cで5分間洗浄し、吸気上清を吸引します。
  10. 再懸濁し、メーカーが推奨する濃度とプロトコルに従ってアッセイバッファーに希釈抗ビオチンマイクロビーズ(材料表)で細胞をインキュベートします。
  11. 5 mLのアッセイバッファーと遠心分離機を400 x gで4°Cで5分間洗浄します。吸気上清は、500 μLのアッセイバッファーで最大 1 x 108個のセルを再懸濁します。
  12. 主磁気選択カラム(材料表)3 mLのアッセイバッファー。プライミングされた磁気選択カラムに細胞を移し、濃縮されたB-1細胞を含む溶出物を氷上の15 mL円錐管に集めます。全体の量が10 mLになるまで追加のアッセイバッファーで磁気選択カラムを洗浄します。
    注: 事前精製細胞分画と後精製細胞画分のアリコートは、図2に示すように、CD19+B細胞、F480+マクロファージ、およびCD5+T細胞の染色による精製効率のためのフローサイトメトリーによって別々に分析されるべきである。
  13. ステップ1.6のように生細胞を数えることによって、精製後の細胞画分(濃縮されたB-1細胞を含む溶性)を数え、 B細胞培地中の1 x 106細胞/mLで再懸濁(RPMI-1640、10%熱不活性化ウシ血清[FBS]、10mM HEPES、1x非必須アミノ酸、1mMナトリウムピルビン酸、50 μg/mLゲンタマイシン、55 μMβ-メルカプトエタノール)。

2. 腹膜B-1細胞刺激

  1. 2つの導入条件(Ctl-GFPおよびCXCR4-GFP)のプールされた細胞を分割し、未導入制御のために少なくとも10 x106細胞をメッキする。
  2. 1ウェルあたり最大150 μL(150,000セル)を96ウェルの丸底プレートにプレートします。
  3. 細胞増殖を刺激するために、すべてのウェルに100 nM TLR9アゴニストODN1668を加えます。
  4. 37°Cで16-18時間、5%CO2のインキュ2ベート。

3. 腹膜B細胞のレトロウイルス伝達

  1. 以前に公開されたプロトコル14に記載されているようにリン酸カルシウムトランスフェクションを用いてCtl-GFP(MigR1)およびCXCR4-GFPレトロウイルス粒子を生成する。
    注:これは数日かかるので、このプロトコルを開始する前に-80 °Cでレトロウイルスストックを準備し、保存し、アリコート。
  2. 氷の上にレトロウイルスストックを解凍します。すぐに使用し、凍結融解サイクル中にウイルスのチターが大幅に減少するので、再凍結しないでください。8 μg/mL ポリブレンと新鮮なβ-メルカプトエタノールの存在下で、細胞に20:1の感染多重度(MOI)でCtl-GFPまたはCXCR4-GFPレトロウイルス上清を加え、最終濃度55μMで新鮮なβ-メルカプトエタノールを添加します。非伝達制御のために確保された細胞にウイルス株を追加しないでください。
  3. 室温で90分間800xgで遠心板gでスプフレキシを行います。
  4. 37°Cでレトロウイルスを用いたプレートをインキュベートし、さらに3時間の場合は5%CO2。
  5. 新鮮なB細胞培地で細胞を収穫し、再プレートし、37°Cでインキュ2ベートし、5%CO2を一晩で行う。

4. 細胞の細胞分化型の細胞の細胞の細胞の並べ替え

  1. 培養細胞とプールを、各条件に対して3つの別々の50 mL円錐管(非トランスデューセ、Ctl-GFP導入、CXCR4-GFP導入)に収穫します。
  2. ステップ1.6のように生きた細胞を数え、4°Cで5分間400xgで遠心分離機を摂り、吸気上清を含む。 g
  3. Fc受容体を遮断するために、1:50抗CD16/CD32抗体(材料表)を含むソートバッファー(PBS + 1%BSA)の100,000細胞/μLで細胞を再懸濁させる。氷の上で4°Cで10分間インキュベートします。
  4. 補償対照のためのアリコート細胞(報酬対照当たり30,000個の細胞):非導入サンプルからの非染色および単染色制御アリコートおよび、トランスデューセサンプルからのGFP単染色対照アリコート用。
    注:市販の補償ビードは、代わりに、非トランスデューセの細胞数が低い場合は、単一の染色制御に使用することができます。
  5. フルオロフォア共役抗体を含む2倍の抗体マスターミックスをソートバッファーに用意する(表1)。2x マスターミックスを、非トランスデューシング、CTL-GFP 導入、CXCR4-GFPの導入サンプルに追加します。個々の抗体を単一の染色制御に追加します。暗闇の中で4°Cで20分間インキュベートします。
    注: 2x マスターミックスは、ステップ 1.8 のように、抗 CD16/CD32 でインキュベートするときに細胞が既に入っている液体の量を占めています。CXCR4がCXCR4過剰発現を確認するために、各条件からの細胞のアリコートを個別に染色することができる。
  6. 1 mLのソートバッファーでサンプルを洗浄し、70 μm フィルターを通してポリプロピレンチューブにひずみます。
  7. 遠心分離機は4°Cでg5分間400xgで吸気上清を用いた。ソートバッファー内の 50,000 セル/μL でサンプルを再中断します。
  8. 細胞選別前に、1 mLの回収培地(RPMI-1640、20%熱不活性化FBS、10mM HEPES、1x非必須アミノ酸、1mMナトリウムピルビン酸、50μg/mLゲンタマイシン、55μM-β)を含む標識された蛍光活性化細胞選別(FACS)コレクションチューブを調製する。
  9. 細胞ソーターでサンプルを実行する前に、死細胞識別のために2x DAPI(ソートバッファで1:5000希釈として用意)を追加します。
  10. GFP+ B-1a細胞を DAPI- CD19+ GFP+ B220ミッドロCD23- IgM+ CD5+ CTL-GFP サンプルから採取培地を含む FACS チューブに並べ替えます。非トランスデューセサンプルを使用してGFP+ ゲートを設定し、DAPI- CD19+ GFP- B220ミッドロCD23- IgM+ CD5+非トランスデューセ B-1a 細胞を並べ替えます。
    注: また、非導入細胞は、GFP-画分内の B-1a セルを個別にガッティングすることにより、CTL-GFP および CXCR4-GFP サンプルからソートすることもできます。トランスデューセドまたは非トランスデューセB-1b細胞は、DAPI-CD19 + GFP+/ - B220ミッドロCD23 -IgM+ CD5-細胞としてこのソート戦略を使用してソートすることもできる。-

5. 養子縁組の移転

  1. 細胞選別後、遠心分離細胞は4°Cで5g分間400xg、吸気上清を注意深く行う。
  2. 1,000細胞/μLで、冷たい生殖不能1x PBSの細胞を再懸濁する。
  3. イオブルランを使用して雄のRag1-/- ApoE-/-マウスを麻酔し、超微細インスリン注射器を使用して静脈内レトロ眼窩または尾静脈注射を介してマウスあたり100 μL(100,000細胞)を注入する。コントロールとして1x PBSを用いてマウスを数個注入する。

6. ドナー細胞と血漿IgMの定量化

  1. 養子後の移行が望ましい時に、骨髄および脾臓組織収穫4およびフローサイトメトリーによってレシピエントマウスで移された細胞を分析する。CD45.1、CD45.2、CXCR4の染色によるドナー細胞の局在化とCXCR4過剰発現を定量化し、フロージョなどのソフトウェアを用いてフローサイトメトリー結果を分析します。
    注: このステップで使用する抗体については、表 1を参照してください。結合ドナー細胞にGFPとしてFITCチャネルに蛍光を発する抗体コンジュゲートを使用しないようにしてください。
  2. 動物の犠牲時に心臓穿刺を介して採取した全血に0.5 M EDTAの10μLを加えて血漿を分離する。遠心分離機全血を7,000xgで全血、アリコート血漿を別々の1.5 mL遠心分離管に入った。 gELISA4によるIgMなどの分泌因子の分析を行うまで-80°Cで保管する。

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Representative Results

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プロトコルの概要は図 1に示します。図2は、他の腹膜細胞タイプの磁気枯渇後の腹膜B-1a細胞の濃縮を示す。非破壊後の分画中の生きたシングル細胞は、F4/80+マクロファージと比較してCD19+B細胞の割合が高く、CD5ハイCD19-T細胞が欠けており、プレ枯渇画分と比較+してCD19+CD5中期B-1a細胞の頻度が増加している。- +図3は、レトロウイルスB細胞の誘導を成功させるためのB細胞活性化の要件と、Ctl-GFPレトロウイルスを用いたウイルスMOIの増加に伴うGFP+B細胞サブセットの正常導入頻度の用量依存的増加を示す。表2は、24ウェルまたは6ウェルプレートと比較して96ウェルラウンドボトムプレートを使用して、増量されたトランスダクション効率を示しています。図 4は正常な CXCR4 過剰表現 (>40%)CxCR4-GFPレトロウイルスによるトランスダクション後のB-1細胞およびCXCL12 in vitroへのB-1細胞移動の増加は、B細胞の生存率に大きな影響を与えることなく行われた。図5は、非伝達状態(GFP-)または2つの経換条件(GFP+)のいずれかから生細胞、シングル、CD19+ CD23-IgM+ CD5+ Cd5+ B-1a細胞の並べ替えのための格言戦略を示しています。なお、CD23+ B-2細胞は、磁気枯渇の前に存在するため、これらのサンプルには存在しません。トランスデューシングライブ、シングル、CD19+ CD23- IgM+ CD5- B-1b細胞もこの格言戦略を用いてソートすることができる。図6は、細胞転移後17週目のCD45.2レシピエントマウスの骨髄および脾臓から回収されたドナー細胞に対して、転写されたCD45.1+ドナー細胞および持続的CXCR4過剰発現を示す。表3は、CXCR4発現とドナー細胞の骨髄への局在化との間の正の関連を示すが、脾臓は示していない。表4は、抗MDA-LDL IgMの骨髄におけるドナー細胞数と血漿量との間の正の関連を示す。

Figure 1
図1:レトロウイルス導入と養子転写の実験設計の概略図CD45.1アロタイプマウスから分離された腹膜細胞は、ビオチン化抗体および抗ビオチンマイクロビーズを用いた磁気枯渇を介してB-1細胞に富化される。富化した腹膜B-1細胞は、TLR9アゴニストCpGオリゴデオキシヌクレオチドによる細胞増殖を刺激するために活性化される。活性化細胞は、Ctl-GFPまたはCXCR4-GFPレトロウイルス粒子を使用して導入される。正常に導入されたGFP+ B-1a細胞はFACSを用いて選別され、CD45.2同種ホストマウスに養子に移される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:腹膜B-1細胞の濃縮。CD19+B細胞の腹膜細胞前磁気濃縮(上)およびポスト磁気濃縮(下)の代表的なフローサイトメトリープロット。CD19+F4/80-細胞はB細胞、CD19-F4/80+細胞はマクロファージ、CD19+CD5中型細胞はB-1a細胞、CD19-CD5ハイ細胞はT細胞である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:レトロウイルス伝達にはB細胞活性化が必要である。腹膜B細胞を5:1、10:1、または25:1 MOIでCtl-GFPレトロウイルスで導入したか、TLR9アゴニストCpG ODN1668の存在または不在で非トランスミクトされた。正常にGFP+ B2、B1、B-1a、またはB-1b細胞の伝達に成功した頻度を、フローサイトメトリー18時間ポストトランスダクションにより定量した。誤差範囲は平均値 ± SEM を表します

Figure 4
図4:CXCR4過剰発現の確認と、インビトロでのB-1a移行の増加。CXCR4のB細胞特異的欠損を有するApoE-/-マウス由来の腹膜B細胞を、Ctl-GFPまたはCXCR4-GFPレトロウイルスで単離して導入し、またはトランスフェクトせずに培養した。(a)非トランスデューセ(左上)、Ctl-GFP導入(左下)、またはCXCR4-GFP導入(右下)状態からのB-1細胞に対するCXCR4およびGFP発現の代表的なフロープロット。CXCR4の正のゲートを設定するために使用されるFMO-CXCR4(右上)。(b) 非導入からGFP+ B-1細胞上のCXCR4のMFIの定量(n=1)、Ctl-GFP導入(n=2)、またはCXCR4-GFP導入(n=2)条件。(c)非伝達(n=1)の周波数、Ctl-GFP導入(n=2)、またはCXCR4-GFPトランスフェクト(n=2)B-1細胞がCXCL12に向けて移行したB-1細胞は、トランスウェルにロードされたB-1細胞の総数に対する割合として示される。(d) 正常に導入されたB細胞集団内の生存細胞の定量化のための代表的な格言戦略(CD19+GFP+)。(e) Ctl-GFP(n =2)またはCXCR4-GFPレトロウイルス(n=2)による導入後の生きたB細胞の周波数。誤差範囲は平均値 ±SEM を表します。この図は、前回の出版物4から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:導入されたGFP+B-1a細胞を選別するためのGAT化戦略。非導入サンプルからGFP+またはGFP-B-1a細胞を並べ替えるための代表的なフローサイトメトリープロット(上)、Ctl-GFP導入サンプル(中央)、およびCXCR4-GFP導入サンプル(下)。B-1a細胞は、生細胞、シングル、CD19+CD23-IgM+CD5+細胞として定義される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:転動ドナー細胞の定量化1つのPBSコントロール(上)からCD45.1+CD45.2-ドナー細胞を表示する代表的なフローサイトメトリープロット、1つのCtl-GFP+ B-1a細胞レシピエント(中央)、および1つのCXCR4-GFP+ B-1a細胞レシピエント(下)、および骨髄中のドナー細胞に対するCXCR4発現の分析(a)または脾臓(b))。骨髄(c)または脾臓(d)からのドナー細胞に対するCXCR4発現(平均蛍光強度、MFI)の定量化骨髄(e)または脾臓(f)のレシピエントで回収されたドナー細胞の数の定量化。*P < 0.05 または **P < 0.01 マンホイットニーテストによる。誤差範囲は平均値 ±SEM を表します。この図は、前回の出版物4から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコルのステップ 抗体 最終濃度
ステップ 1.8 テル119ビオチン 1μL/100 μL最終ボリューム
CD3e ビオチン 1μL/100 μL最終ボリューム
Gr-1 ビオチン 1μL/100 μL最終ボリューム
CD23 ビオチン 1μL/100 μL最終ボリューム
NK1.1 ビオチン 1μL/100 μL最終ボリューム
F4/80 ビオチン 100 μL の最終ボリュームあたり 2.5 μL
抗体 最終濃度
ステップ 4.5 CD5 PE 1μL/100 μL最終ボリューム
IgM PECF594 1μL/100 μL最終ボリューム
CD23 PECy7 1μL/100 μL最終ボリューム
B220 APC 1μL/100 μL最終ボリューム
CD19 APCef780 1μL/100 μL最終ボリューム
抗体 最終濃度
ステップ 6.1 CD45.1 PerCP Cy5.5 1μL/100 μL最終ボリューム
CD45.2 BV421 1μL/100 μL最終ボリューム
CXCR4 APC 100 μL の最終ボリュームあたり 2.5 μL

表1:プロトコルで使用される抗体とその最終濃度。

条件 総人口の %GFP+ CD19+ B セルの %GFP+
96ウェルラウンドボトムプレート 30.9% 52.7%
24ウェルプレート 8.4% 21.2%
6ウェルプレート 16.2% 27.3%

表2:プレートの最適化96ウェルの丸底プレート(40ウェル、150、150、150、150、16ウェル、150、のいずれかで6 x 106富化腹膜B-1細胞の導入後にGFP+細胞またはGFP+ CD19+ B細胞の総トランスダクションに成功した頻度、またはGFP+ CD19+ B細胞の周波数 1ウェルあたり000細胞、24ウェルプレート(ウェルあたり1 x 106細胞で6ウェル)、または6ウェルプレート(1ウェルあたり2 x 106細胞で3ウェル)、Ctl-GFPレトロウイルスを有する20:1 MOIで。

変数 ドナーB-1a細胞上のCXCR4のMFI
R p値
骨髄中のドナーB-1a細胞の# 0.71 *0.014
脾臓中のドナーB-1a細胞の# 0.43 0.18

表3:ドナー細胞とドナー細胞の局在に関するCXCR4発現との関連ドナーB-1a細胞上のCXCR4の平均蛍光強度(MFI)は、骨髄中のドナーB-1a細胞の数またはRag1-- ApoE-/-レシピエントマウスの17週-/-後のレシピエントマウスと相関した。相関係数(r)と統計的有意性(p)として提示されるデータ。このテーブルは、前回のパブリケーション4から変更されています。

変数 骨髄中のドナー細胞の#
R p値
プラズマ抗MDA-LDL IgM 0.67 *0.028
プラズマ E06/T15 IgM 0.56 0.076
プラズマ 1,3 デキストラン IgM 0.29 0.39

表4:抗OSE IgMのドナー細胞局在化と血漿量との関連Rag1--- ApoE-/-レシピエントマウスの骨髄中のドナーB-1a細胞の数は、抗MDA-LDL IgM、E06/T15 IgM、または抗1,3デキストランIgMの循環量と相関した養子導入後17週のレシピエントマウス。相関係数(r)と統計的有意性(p)として提示されるデータ。このテーブルは、前回のパブリケーション4から変更されています。

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Discussion

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ここで提供される方法は、安定かつ比較的効率的な一次B-1a細胞遺伝子の送達、生体内導入導入、および注入された細胞の同定および局在化を可能にする。細胞は17週後の細胞転移を検出することができ、CXCR4発現の増加を保持した。レトロウイルス媒介性送達は、私たちの手の細胞生存率への影響を最小限に抑えて、プライマリマウスB-1a細胞の30〜40%のトランスダクション効率を生み出した(図4e)。これは、レトロウイルス感染、アデノウイルス感染、核切除、またはリポフェクタミンを含む原発性マウスB細胞への遺伝子導入の技術を比較したMoghimiたちの研究の結果と一致している。しかし、CXCR4の過剰発現範囲は、CXCR4-GFP導入B-1a細胞を受け取る受信者の範囲が大きく異なることがわかりました(図6c,d)。そこで、結合解析を利用して、CXCR4発現の増加がB-1a移行および骨髄への局在化の増加と相関していることを実証した。 Table 4

この方法の制限には、十分な数のB-1a細胞を正常に導入するために必要な多数のマウス、およびある実験から別の実験への伝達効率の変動性が含まれる。トランスダクション効率は、ウイルスストックの高い力価によって改善され、これは少なくとも2 x 107感染性粒子/mL14であるべきである。12-16週齢の高齢マウスの使用は、腹膜B-1細胞数が17歳とともに増加するため、腹膜B-1細胞収量を改善することもできる。

また、導入後のB-1a細胞によって分泌されるIgMの量は、同じRag1-/- ApoE-/- モデルへの養子転写後に非導入B-1a細胞によって分泌される量より〜5倍少なかったことに注意することも重要である(データ-/-は示されていない)。これは、レトロウイルス伝達前のTLR9アゴニストによるB-1細胞活性化の要件(図3)が、導入後のOSEに応答して二次活性化およびIgM産生を制限する可能性があるためである可能性がある。したがって、B-1a細胞を移管して強固なIgM産生を必要とする研究のために、レンチウイルス送達18、19,19などのB-1a細胞活性化を以前に必要としない代替遺伝子導入技術が、有用であることを証明し得る。あるいは、増殖を誘導する活性化戦略を伴うこのプロトコルの改変は、IgM分泌細胞へのB-1a分化を誘導しない場合でも、二次B細胞活性化に影響を与えることなくレトロウイルス伝達を成功させるには十分である可能性がある。IL-5はB-1a細胞増殖および生存を媒介する重要なサイトカインであり、TLR9刺激20,21,21に代わる有効な代替手段となり得る。

以前の研究では、B220(B細胞マーカー)またはThy1.2(T細胞マーカー)13,14,14に対する抗体を用いて、陽性または陰性選択戦略を介して単離された脾臓B細胞を利用している。しかし、B220+脾臓B細胞はB-1およびB-2細胞サブセットを含む異種集団である。また、総脾臓CD19+B細胞集団内のB-1細胞周波数は低い(1−2%)。これに対し、この方法は、B-1細胞がこのコンパートメント22内のCD19+B細胞の総60−70%を含むので、B-1細胞として、腹腔をB-1細胞源として利用し、そして、腹膜B-2細胞を枯渇させるマーカーとしてCD23を使用する。GFP、CD19、B220、CD23、IgM、およびCD5発現に基づく正常に形質転換されたB-1a細胞の後のソートは、さらに、より具体的に定義された細胞タイプの転写を可能にする。腹膜B-1細胞を濃縮する磁気枯渇戦略は、T細胞を効果的に枯渇させ、F4/80腹膜マクロファージ周波数を私たちの手で〜50%減少させた(図2)が、この重要なステップのさらなる最適化とトラブルシューティングは、伝達効率を高める可能性がある。例えば、マクロファージの枯渇を改善するためにビオチン化F4/80抗体の濃度を高くすると、他の細胞タイプの「オフターゲット」レトロウイルス伝達が少なくなるので、B-1a細胞のトランスダクション効率がさらに高まる可能性があります。平底24ウェルまたは6ウェルプレートの代わりに96ウェルの丸底プレートを使用すると、さらに大幅に改善されたトランスダクション効率(表2)が、処理時間とピペット処理時間が増加します。

全体として、この方法は、B-1a細胞への標的遺伝子送達がB-1a細胞の局在化および機能的IgM産生を変化させることができるかどうかを判断するための有用な概念実証アプローチを提供する。この技術の将来の用途には、他のタンパク質を標的とするレトロウイルス構築物のex vivo送達、および細胞生存、移動、増殖、または機能を含むインビボのドナーまたは宿主細胞プロセスに対するその影響を決定するための養子転移が含まれる可能性がある。ドナー細胞(CD45.1+GFP+)を宿主細胞(CD45.2+GFP-)から分化することができるので、リンパ球欠乏宿主ではなく免疫能力宿主への養子転移もこの技術で可能であろう。この方法を用いて他のケモカイン受容体を標的化することは、高いIgM産生の許容ニッチに向けてB-1a細胞の移動を標的化することは、効果的に保護IgMのレベルを高めることができるという仮説をさらに支持することができる。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この作業は、1R01 HL107490、1R01 HL136098、P01 HL055798のプロジェクト3、P01 HL136275-01(C.A.マクナマラ)、R01GM100776(T.P.ベンダー)によってサポートされました。A. Upadhyeは、米国心臓協会の博士研究員16PRE30300002および5T32AI007496-20によって支えられた。バージニア大学フローサイトメトリーコアのジョアン・ラニガン、マイク・ソルガ、クロード・チューの優れた技術支援に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 micron filter caps Falcon 352235
anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block Life Technologies MFCR00
B220 APC eBioscience 17-0452-83 Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
CD19 APCef780 eBioscience 47-0193-82 Clone: eBio1D3
CD23 biotin eBioscience 13-0232-81 Clone: B3B4
CD23 PECy7 eBioscience 25-0232-82 Clone: B3B4
CD3e biotin eBioscience 13-0033-85 Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560580 Clone: A20
CD45.2 BV421 BD Biosciences 562895 Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD5 PE eBioscience 12-0051-83 Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC eBioscience 17-9991-82 Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin Life Technologies MF48015 Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6 Treestar Inc. License required
Gentamicin Gibco 15710-064
Gr-1 biotin eBioscience 13-5931-82 Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum Gibco 16000-044
HEPES Gibco 15630-080
IgM PECF594 BD Biosciences 562565 Clone: R6-60.2
Insulin syringes BD Biosciences 329461
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405
Live/Dead Yellow Life Technologies L34968
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NK1.1 biotin BD Biosciences 553163 Clone: PK136
Non-essential amino acids Gibco 11140-050
ODN 1668 InvivoGen tlrl-1668
PBS Gibco 14190-144
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Ter119 biotin eBioscience 13-5921-82 Clone: Ter119

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マウスB-1a細胞におけるCXCR4のレトロウイルス過剰発現と骨髄およびIgM産生への標的B-1a細胞の移行のための養子転移
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Upadhye, A., Marshall, M., Garmey, J. C., Bender, T. P., McNamara, C. Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production. J. Vis. Exp. (159), e61003, doi:10.3791/61003 (2020).More

Upadhye, A., Marshall, M., Garmey, J. C., Bender, T. P., McNamara, C. Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production. J. Vis. Exp. (159), e61003, doi:10.3791/61003 (2020).

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