Summary
Her beskriver vi en metode til retroviral overekspression og adoptivoverførsel af murine B-1a celler til at undersøge in vivo B-1a cellemigration og lokalisering. Denne protokol kan udvides til forskellige downstream funktionelle analyser, herunder kvantificering af donor B-1a celle lokalisering eller analyse af donor celle-afledte udskillede faktorer post-adoptivoverførsel.
Abstract
Da cellefunktion påvirkes af nichespecifikke faktorer i det cellulære mikromiljø, kan metoder til dissekering af cellelokalisering og migration give yderligere indsigt i cellefunktion. B-1a celler er en unik B-celle delmængde i mus, der producerer beskyttende naturlige IgM antistoffer mod oxidation-specifikke epitoper, der opstår under sundhed og sygdom. B-1a celle IgM produktion varierer afhængigt af B-1a celle placering, og derfor bliver det nyttigt fra et terapeutisk synspunkt at målrette B-1a lokalisering til nicher støtter høj antistofproduktion. Her beskriver vi en metode til at målrette B-1a celle migration til knoglemarven ved retroviral-medieret overekspression af C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninduktion i primære murine B-celler kan være udfordrende og giver typisk lave transfektioner på 10-20% afhængigt af teknikken. Her viser vi, at retroviral transduktion af primær murine B-1a celler resulterer i 30-40% transduktionseffektivitet. Denne metode anvender adoptivcelleoverførsel af trans inducerede B-1a-celler til B-cellemangel recipientmus, så donor B-1a cellemigration og lokalisering kan visualiseres. Denne protokol kan ændres for andre retrovirale konstruktioner og kan anvendes i forskellige funktionelle analyser efter adoptivoverførsel, herunder analyse af donorcelle- eller værtscellefænotype og funktion, eller analyse af opløselige faktorer, der udskilles efter B-1a-celleoverførsel. Anvendelse af forskellige donor- og recipientmus, der er differentieret efter CD45.1- og CD45.2-allotype, og tilstedeværelsen af en GFP-reporter i det retrovirale plasmid kan også gøre det muligt at detektere donorceller i andre, immunforsynende musemodeller, der indeholder endogene B-cellepopulationer.
Introduction
Nylige undersøgelser har vist betydelig immuncelle, og specifikt B-celle, fænotypisk og funktionel heterogenitet afhængigt af cellelokalisering1,,2,,3,,4,5. B-1a celler er en sådan population med heterogen kapacitet til at producere beskyttende IgM antistoffer; knoglemarv B-1a celler udskiller IgM konstituerende og bidrager væsentligt til plasma IgM titere6,mens peritoneale B-1a celler har lavt niveau IgM sekretion på homøostase og i stedet kan aktiveres gennem medfødte vejafgift-lignende receptor (TLR) eller cytokin-medieret signalering til hurtigt at formere sig, migrere, og udskille IgM7,8,9,10. B-1a celle IgM antistoffer genkende oxidation-specifikke epitoper (OSE), der er til stede på patogener, apoptotiske celler, og oxideret LDL, og IgM bindende til OSE kan forhindre inflammatorisknedstrøm signalering i sygdomme som åreforkalkning11. Derfor kan strategier til at øge IgM produktion via stigende peritoneal B-1a celle migration til steder som knoglemarven være terapeutisk nyttige. Det er imidlertid vigtigt, at sådanne strategier målrettes og celletypespecifikke, da virkninger uden for målet kan have en negativ indvirkning på immunforsvaret eller sundheden.
Her beskriver vi en metode til målrettet og langsigtet overekspression af CXCR4 i primære murine B-1a celler og efterfølgende adoptivoverførsel for at visualisere cellemigration og funktionel IgM antistofproduktion (Figur 1). Genetisk manipulation af primære B-celler er begrænset af lav transfektion effektivitet sammenlignet med transfection af transformerede cellelinjer. Men da transformerede cellelinjer kan afvige betydeligt fraprimærcellerne 12,13, vil brugen af primærceller sandsynligvis give resultater, der i højere grad tilpasser sig normal fysiologi. Flere teknikker er blevet beskrevet for genoverførsel i primære murine B-celler, herunder retroviral transduktion, adenoviral transduktion, lipofection, eller elektroporation-baseret transinfektion, som har varierende niveauer af effektivitet, transience, og indvirkning på celle sundhed13,,14,15. Følgende metode anvendte retroviral transduktion, da den gav en tilstrækkelig genoverførselseffektivitet på >30%, mens den minimalt påvirkede cellernes levedygtighed. Den CXCR4-ekspresserende retrovirus blev genereret ved hjælp af den tidligere beskrevne retrovirale konstruktion murine stamcellevirus-interne ribosomal indrejse site-grøn fluorescerende protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, hvori musen CXCR4 genet var sub-klonede4. MigR1 (kontrol(Ctl)-GFP) og CXCR4-GFP retrovirale partikler blev genereret ved hjælp af calciumphosphattransfektion som beskrevet i tidligere offentliggjorte protokoller4,14.
Succesfuld trans induceret B-1a celler blev derefter intravenøst overført til lymfocyt-mangelfuld Rag1-/- mus. Både donor- og recipientmus indeholdt desuden knockout af apolipoprotein E (ApoE) genet, hvilket resulterer i øget OSE-akkumulering og åreforkalkning, hvilket giver en model for in vivo B-1-celleaktivering og IgM-produktion. Desuden var donor- og recipientmus forskellige i CD45-allotype; donor B-1 celler kom fra CD45.1 + ApoE-/- mus og blev overført til Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- modtagere. Dette gjorde det muligt at skelne mellem donor-CD45.1 fra modtager CD45.2 B-celler efter overførslen uden yderligere at plette for B-cellemarkører under flowcytometrianalyse. Resultaterne her viser, at målrettet CXCR4 overekspression på B-1a celler forbinder med øget evne til B-1a celler til at migrere til knoglemarven, som forbinder med øget plasma anti-OSE IgM. Vi leverer desuden en metode til berigelse af peritoneale B-1 celler gennem negativ udvælgelse og demonstrerer behovet for B-1 celleaktivering for effektiv transduktion. Denne metode kan tilpasses til andre retrovirale konstruktioner for at undersøge effekten af proteinoverekspression på B-1a cellemigration, fænotype eller funktion. Desuden kan anvendelsen af CD45.1 versus CD45.2 allotype skelnen teoretisk tillade overførsel til andre immunforsynende murinemodeller, der indeholder endogene B-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
1. Magnetisk adskillelse og berigelse af peritoneale B-1-celler
- Euthanize en 12−14-uger gammel, mand, CD45.1+ApoE-/- mus ved hjælp af CO2.
- Lav en overfladisk snit i maven ved hjælp af lige kirurgisk saks og skræl tilbage huden ved hjælp af buede saks til at udsætte bughinden væggen. Skylle bughulen med 10 ml 37 °C RPMI-1640 medium med en 10 ml sprøjte og 25 G nål. Ryst musen for at frigøre celler ved at gribe fat i halen og flytte musen fra side til side grundigt i 15-20 s.
BEMÆRK: Massere lavaged bughinden kan også maksimere celle opsving. - Opsaml bughindevæske ved hjælp af en 10 ml sprøjte og 25 G nål ved at trække væske op i den nederste højre side af bughinden lige over hoftens niveau nær tarmene. Undgå at forstyrre epidydimal fedt depoter og underliggende organer. Undgå at trække væske fra musens venstre side, da det omentale fedt let kan trækkes ind i sprøjten.
- Når der opsamles ~6−7 ml væske, hældes det i et konisk 50 ml rør, der er placeret på is. Dernæst hæve musen lodret ved at holde bughinden over mellemgulvet ved hjælp af pincet, således at eventuelle resterende væske forbliver i bunden af bughulen. Lav et lille snit i bughinden væggen ved hjælp af kirurgisk saks over leveren (sørg for ikke at skære leveren) og indsamle eventuelle resterende bugydvæske ved hjælp af et glas pipet og pære.
- Pool peritoneale udvaskningsceller fra alle CD45.1+ApoE-/- mus (n = 15−20) i 50 ml koniske rør og opbevares på is.
BEMÆRK: Til beregning af antallet af nødvendige mus: B-1a celler udgør 5−10% af den samlede peritoneale population og giver ca. 2,5−5 x 105 B-1a celler pr. mus i forfatternes hænder. Transduktionseffektivitet er ~30−40%, som vist nedenfor. - Tæl levende celler ved hjælp af et levedygtigt farvestof som trypanblåt og et hemocytometer (fortyndede prøver 1:5 i trypanblå og læg 10 μL i hemocytometerkammeret). Pool celler på op til 1 x 108 celler pr rør. Centrifugeceller ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og derefter aspirere supernatant.
- Opslæmmet op til 1 x10 8 celler i 1 ml anti-CD16/CD32 antistof (Tabel over Materialer) fortyndet 1:50 i analysebuffer (1x fosfat buffered saltvand [PBS], 0,5% kvæg serum albumin [BSA], 2 mM EDTA) for at blokere Fc receptorer. Skaler efter behov baseret på celletal. Inkuber på is i 10 min ved 4 °C.
- Der fremstilles en 2x masterblanding af de biotinylerede antistoffer (tabel 1) i analysebufferen til udtømning. 2x master mix tegner sig for mængden af væsken cellerne er allerede i, når inkubation med anti-CD16/CD32. Hvis celler for eksempel inkuberer i 500 μL fortyndet anti-CD16/CD32, derefter tilsættes 500 μL 2x master mix indeholdende 10 μL biotinyleret Ter119, Gr-1, CD23 og NK1.1 antistoffer og 25 μL biotinyleret F4/80 antistof for at opnå de endelige koncentrationer i tabel 1. Der tilsættes 2x master mix til celler og plette i 20 min ved 4 °C.
- Cellerne vaskes med 5 ml analysebuffer og centrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirate supernatant.
- Resuspend og inkubering af celler med antibiotinmikroperler (Tabel over Materialer) fortyndet i analysebuffer i henhold til den af fabrikanten anbefalede koncentration og protokol.
- Der vaskes med 5 ml analysebuffer og centrifuge ved 400 x g i 5 min. ved 4 °C. Aspireret supernatant og opslæmmet op til 1 x 108 celler i 500 μL analysebuffer.
- Prime magnetiske valg kolonner (Tabel over materialer) med 3 ml assay buffer. Celler overføres til primede magnetiske markeringssøjler, og elluenten, der indeholder berigede B-1-celler, overføres i et 15 ml konisk rør på is. Den magnetiske valgsøjle skal vaskes med ekstra analysebuffer, indtil det samlede opsamlede volumen er 10 ml.
BEMÆRK: En aliquot af de forrensede og post-rensede cellefraktioner skal analyseres separat ved flowcytometri til rensningseffektivitet ved farvning af CD19+ B-celler, F480+ makrofager og CD5+ T-celler som vist i figur 2. - Den postrensede cellefraktion (elluent, der indeholder berigede B-1-celler) tælles ved at tælle levende celler som i trin 1.6 og opslæmmes ved 1 x 106 celler/ml i B-cellekulturmedium (RPMI-1640, 10% varmeinaktiveret føtalt kvægserum [FBS], 10 mM HEPES, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat, 50 μg/ml gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol).
2. Peritoneal B-1 cellestimulation
- Opdelte poolede celler for de to trans inducerede tilstande (Ctl-GFP og CXCR4-GFP), mens der afsættes og plating mindst 10 x10 6 celler for en ikke-trans induceret kontrol.
- Plade op til 150 μL (150.000 celler) pr. brønd i 96 brøndplader med rund bund.
- Tilføj 100 nM TLR9 agonist ODN1668 til alle brønde for at stimulere celleprolifer spredning.
- Inkuber i 16-18 timer ved 37 °C, 5% CO2.
3. Retroviral transduktion af peritoneale B-celler
- Generer Ctl-GFP (MigR1) og CXCR4-GFP retrovirale partikler ved hjælp af calciumphosphattransfektion som beskrevet i tidligere offentliggjorte protokoller14.
BEMÆRK: Dette vil tage flere dage, så forberede og titer retrovirale lagre og gemme aliquots på -80 °C før du starter denne protokol. - Optø retroviruslagre på is. Brug straks og ikke re-fryse som virus titer betydeligt aftager under fryse-tø cykler. Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirale supernatanter ved 20:1-multiplicitet (MOI) til cellerne i nærværelse af 8 μg/ml polybren og frisk β-mercaptoethanol ved 55 μM endelig koncentration. Der må ikke tilsættes virale lagre til de celler, der er afsat til den ikke-trans inducerede kontrol.
- Spininfektion udføres ved centrifugeringsplader ved 800 x g i 90 minutter ved stuetemperatur.
- Der inkuberes plader med retrovirus ved 37 °C, 5% CO2 for yderligere 3 timer.
- Høst og replate celler i frisk B-celle medium og inkubere ved 37 °C, 5% CO2 natten over.
4. Cellesortering af trans inducerede peritoneale B-1a-celler
- Høst dyrkede celler og pool i tre separate 50 ml koniske rør for hver betingelse: ikke-trans induceret, Ctl-GFP trans induceret, og CXCR4-GFP transduced.
- Levende celler tælles som i trin 1.6, centrifuget derefter ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirate supernatant.
- Resuspendceller ved 100.000 celler/μL i sorteringsbuffer (PBS + 1% BSA), der indeholder 1:50 anti-CD16/CD32 antistof (Tabel over Materialer) for at blokere Fc-receptorer. Inkuber på is i 10 min ved 4 °C.
- Aliquot celler til kompensation kontrol (~ 30.000 celler pr kompensation kontrol): for uinddæftet og enkelt plet kontrol aliquot fra ikke-trans induceret prøve og for GFP enkelt pletkontrol aliquot fra trans inducerede prøver.
BEMÆRK: Kommercielt tilgængelige kompensationsperler kan alternativt bruges til enkeltpletkontrol, hvis ikke-trans induceret cellenummer er lavt. - Der fremstilles en 2x antistofmesterblanding, der indeholder fluoroforekonjugerede antistoffer i sorteringsbuffer (Tabel 1). Tilføj 2x master mix til ikke-trans inducerede, CTL-GFP trans induceret, og CXCR4-GFP trans induceret prøver. Tilføj individuelle antistoffer til enkelt plet kontrol. Inkuber i 20 min ved 4 °C i mørke.
BEMÆRK: 2x master mix tegner sig for mængden af væske cellerne er allerede i, når inkubation med anti-CD16/CD32, som i trin 1.8. En aliquot af celler fra hver tilstand kan farves separat for CXCR4 at bekræfte CXCR4 overekspression. - Prøverne vaskes med 1 ml slagsbuffer og stamme gennem 70 μmfiltre i polypropylenrør.
- Centrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspiratsupernatant. Opsuspend prøver ved 50.000 celler/μL i sorteringsbuffer.
- Før cellesortering forberede mærket fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) indsamling rør, der indeholder 1 ml opsamlingsmedium (RPMI-1640, 20% varmeinaktiveret FBS, 10 mM HEPES, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat, 50 μg/ml gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol) for hver population, der skal sorteres.
- Før der køres prøver på cellesorteringen, tilsættes 2x DAPI (fremstillet som 1:5000 fortynding i sorteringsbuffer) til forskelsbehandling af døde celler.
- Sortér GFP+ B-1a-celler i FACS-rør, der indeholder indsamlingsmedium som DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ celler fra CTL-GFP- og CXCR4-GFP-prøverne. Brug den ikke-transkerede prøve til at indstille GFP+ porten og til at sortere DAPI- CD19+ GFP- B220 mid-lo CD23- IgM+ CD5+ ikke-transgenererede B-1a-celler.mid-lo
BEMÆRK: Alternativt kan ikke-trans inducerede celler også sorteres fra CTL-GFP- og CXCR4-GFP-prøverne ved særskilt at gate B-1a-celler i GFP-fraktionen. Transduced eller ikke-trans inducerede B-1b celler kan også sorteres ved hjælp af denne slags strategi som DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- celler.
5. Adoptivoverførsel
- Efter cellesortering centrifugeres cellerne ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og aspirerende supernatant omhyggeligt.
- Resuspendceller i kold steril 1x PBS ved 1.000 celler/μL.
- Anesthetize mandlige Rag1-/- ApoE-/- mus ved hjælp af isofluran og injicere 100 μL (100.000 celler) per mus via intravenøs retro-orbital eller hale vene injektion ved hjælp af en ultra-fine insulin sprøjte. Injicer et par mus med 1x PBS som en kontrol.
6. Kvantificering af donorceller og plasma-IgM
- På det ønskede tidspunkt efter adoptivoverførslen analyseres overførte celler i recipientmus ved hjælp af knoglemarv og miltvævshøst4 og flowcytometri. Kvantificer donorcellelokalisering og CXCR4-overekspression ved farvning af CD45.1, CD45.2 og CXCR4, og analysér flowcytometriresultater ved hjælp af en software som Flowjo.
BEMÆRK: Se tabel 1 for antistoffer, der anvendes i dette trin. Sørg for ikke at anvende en antistofkonjugat, som fluoresces i FITC-kanalen som GFP vil være til stede på trans inducerede donorceller. - Isoler plasma ved at tilsætte 10 μL 0,5 M EDTA til fuldblod, der indsamles via hjertepunktur på tidspunktet for dyreofring. Centrifuge fuldblod ved 7.000 x g og aliquot plasma i separate 1,5 ml centrifugerør. Opbevares ved -80 °C, indtil elisa 4 foretager analyse af udskillede faktorer somF.eks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1indeholder en oversigt over protokollen . Figur 2 viser berigelse af peritoneale B-1a-celler efter magnetisk udtømning af andre peritoneale celletyper. Live singlet celler i post-udtynding fraktion har en større andel af CD19 + B-celler i forhold til F4/80+ makrofager, mangler CD5hi CD19- T-celler, og indeholder en øget hyppighed af CD19+ CD5 midten B-1a celler i forhold til pre-udtynding fraktion.mid Figur 3 viser behovet for B-celleaktivering for vellykket retroviral B-celletransduktion og en dosisafhængig stigning i hyppigheden af trans inducerede GFP+ B-celleundersæt med stigende moivirus ved hjælp af Ctl-GFP retrovirus. Tabel 2 viser øget transduktionseffektivitet ved hjælp af 96 godt runde bundplader sammenlignet med 24-brønde eller 6-brøndplader. Figur 4 viser vellykket CXCR4-overekspression (>40%) på B-1-celler og øget B-1-cellemigration til CXCL12 in vitro efter transduktion med CXCR4-GFP retrovirus uden væsentlig indvirkning på B-celleens levedygtighed. Figur 5 viser gating-strategien for sortering af levende, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ B-1a-celler fra enten en ikke-trans induceret tilstand (GFP-) eller de to trans inducerede tilstande (GFP+). Bemærk, at CD23+ B-2-celler ikke er til stede i disse prøver på grund af tidligere magnetisk udtynding. Transduced live, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5- B-1b celler kan også sorteres ved hjælp af denne gating strategi. Figur 6 viser overførte CD45.1+ donorceller og vedvarende CXCR4-overekspression på donorceller, der er genvundet fra knoglemarv og milt af CD45.2-modtagermus 17 uger efter celleoverførsel. Tabel 3 viser en positiv sammenhæng mellem CXCR4-ekspression og donorcellelokalisering til knoglemarven, men ikke milt. Tabel 4 viser en positiv sammenhæng mellem donorcelletal i knoglemarven og plasmamængden af anti-MDA-LDL IgM.
Figur 1: Skematisk forsøgsdesign til retroviral transduktion og adoptivoverførsel. Peritoneale celler isoleret fra CD45.1 allotype mus er beriget til B-1 celler gennem magnetisk udtynding ved hjælp af biotinylerede antistoffer og anti-biotin mikroperler. Berigede peritoneale B-1-celler aktiveres for at stimulere celleproliferation med TLR9-agonist CpG oligodeoxynukleotid. Aktiverede celler trans induceres med Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirale partikler. Succesfuld transduced GFP+ B-1a celler sorteres ved hjælp af FACS og overføres til CD45.2 allotype værtsmus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Berigelse af peritoneale B-1-celler. Repræsentative flowcytometriviser af peritoneale celler præmagnetisk berigelse (øverst) og postmagnetisk berigelse (nederst) for CD19+ B-celler. CD19+ F4/80- celler er B-celler, CD19- F4/80+ celler er makrofager, CD19+CD5-mellemceller er B-1a-celler, og CD19-CD5-hi-celler er T-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Retroviral transduktion kræver aktivering af B-celle. Peritoneal B-celler blev trans induceret med Ctl-GFP retrovirus på 5:1, 10:1, eller 25:1 MOI eller venstre ikke-transduced i tilstedeværelse eller fravær af TLR9 agonist CpG ODN1668. Hyppigheden af trans inducerede GFP+ B2-, B1-, B-1a- eller B-1b-celler blev kvantificeret ved flowcytometri 18 timer efter transduktion. Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Bekræftelse af CXCR4-overekspression og øget B-1a-migration in vitro. Peritoneal B-celler fra ApoE-/- mus med B-cellespecifik mangel på CXCR4 blev isoleret og transuceret med Ctl-GFP eller CXCR4-GFP retrovirus eller dyrket uden transduktion. aa) Repræsentative flowområder af CXCR4- og GFP-udtryk på B-1-celler fra ikke-transtilducerede (øverst til venstre), Transledet Ctl-GFP (nederst til venstre) eller CXCR4-GFP-transledede (nederste højre) forhold. FMO-CXCR4 (øverst til højre), der bruges til at indstille CXCR4-positiv port. b) Kvantificering af MFI for CXCR4 på GFP+ B-1-celler fra ikke-trans inducerede (n = 1), Ctl-GFP trans induceret (n = 2) eller CXCR4-GFP trans induceret (n = 2) betingelser. cc) Hyppighed af ikke-transforledte (n = 1), Transledet Ctl-GFP (n = 2) eller CXCR4-GFP trans inducerede (n = 2) B-1-celler, der migrerede mod CXCL12 som en procentdel af det samlede antal B-1-celler, der er indlæst i transwell. d) Repræsentativ gatingstrategi for kvantificering af levedygtige celler inden for den transtilførte B-cellepopulation (CD19+GFP+). e) Hyppigheden af levende B-celler efter transduktion med Ctl-GFP (n = 2) eller CXCR4-GFP retrovirus (n = 2). Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere publikation4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Gating-strategi for sortering af trans inducerede GFP+ B-1a-celler. Repræsentative flowcytometriparceller til sortering af GFP+ eller GFP- B-1a-celler fra en ikke-transledet prøve (øverst), en Transledet Ctl-GFP-prøve (i midten) og en trans induceret CXCR4-GFP-prøve (nederst). B-1a celler defineret som levende, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kvantificering af overførte donorceller. Repræsentative flow cytometri plots viser CD45.1+ CD45.2- donorceller fra en PBS kontrol (top), en Ctl-GFP + B-1a celle modtager (midten), og en CXCR4-GFP + B-1a celle modtager (nederst), og efterfølgende analyse af CXCR4 udtryk på donorceller i knoglemarv (a), eller milt (b). Kvantificering af CXCR4-ekspression (middelfluoridintensitet, MFI) på donorceller fra knoglemarv (c) eller milt (d). Kvantificering af antallet af donorceller, der er genvundet i knoglemarv (e) eller milt (f) af modtagere. * P < 0,05 eller ** P < 0,01 af Mann-Whitney test. Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra vores tidligere publikation4. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Protokoltrin | Antistof | Endelig koncentration |
| Trin 1.8 | Ter119 biotin | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen |
| CD3e biotin | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| Gr-1 biotin | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| CD23 biotin | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| NK1.1 biotin | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| F4/80 biotin | 2,5 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| Antistof | Endelig koncentration | |
| Trin 4.5 | CD5 PE | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen |
| IgM PECF594 | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| CD23 PECy7 | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| B220 APC | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| CD19 APCef780 | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| Antistof | Endelig koncentration | |
| Trin 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen |
| CD45.2 BV421 | 1 μL pr. 100 μL endeligt volumen | |
| CXCR4 APC | 2,5 μL pr. 100 μL endeligt volumen |
Tabel 1: Antistoffer og deres endelige koncentrationer, der anvendes i protokollen.
| Betingelse | %GFP+ for den samlede befolkning | %GFP+ af CD19+ B-celler |
| 96-godt rund bundplade | 30.9% | 52.7% |
| 24-brønd plade | 8.4% | 21.2% |
| 6-brønds plade | 16.2% | 27.3% |
Tabel 2: Pladeoptimering. Hyppighed af trans inducerede samlede GFP+ celler eller GFP+ CD19+ B-celler efter transduktion af 6 x10 6 berigede peritoneale B-1-celler i enten en 96-brønd rund bundplade (40 brønde ved 150.000 celler pr brønd), en 24-brønd plade (6 brønde ved 1 x 106 celler pr brønd), eller en 6-brønd plade (3 brønde på 2 x 106 celler pr brønde) på en 20:1 MOI med Ctl-GFP retrovirus.
| Variabel | MFI af CXCR4 på donor B-1a celler | |
| r-værdi | p-værdi | |
| # af donor B-1a celler i knoglemarv | 0.71 | *0.014 |
| # af donor B-1a celler i milt | 0.43 | 0.18 |
Tabel 3: Tilknytning mellem CXCR4-udtryk på donorceller og donorcellelokalisering. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) for CXCR4 på donor B-1a-celler korreleret med antallet af donor B-1a-celler i knoglemarv eller milt af Rag1-/- ApoE-/- modtagermus 17 uger efter adoptivoverførsel. Data præsenteret som korrelationskoefficient (r) og statistisk signifikans (p). Denne tabel er blevet ændret fra vores tidligere publikation4.
| Variabel | Antal donorceller i knoglemarv | |
| r-værdi | p-værdi | |
| Plasma anti-MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| Plasma E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| Plasma 1,3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
Tabel 4: Sammenhæng mellem donorcellelokalisering og plasmamængde af anti-OSE IgM. Antallet af donor B-1a celler i knoglemarv af Rag1-/- ApoE-/- modtagermus 17 uger efter adoptivoverføring korreleret med cirkulerende mængde anti-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM eller anti-1,3-dextran IgM. Data præsenteret som korrelationskoefficient (r) og statistisk signifikans (p). Denne tabel er blevet ændret fra vores tidligere publikation4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode, der her er angivet her, muliggør stabil og relativt effektiv primær B-1a celle genlevering, in vivo adoptivoverførsel og identifikation og lokalisering af injicerede celler. Celler var i stand til at blive opdaget 17 uger post-celle overførsel og bevaret øget CXCR4 udtryk. Retrovirus-medieret levering gav 30-40% transduktion effektivitet af primære murine B-1a celler med minimal indvirkning på cellens levedygtighed i vores hænder (Figur 4e). Dette er i overensstemmelse med resultaterne fra en tidligere undersøgelse foretaget af Moghimi og kolleger, som sammenlignede teknikker til genoverførsel til primær murine B-celler, herunder retroviral infektion, adenoviral infektion, nukleafsektion eller lipofectamin15. Vi konstaterede imidlertid, at udvalget af CXCR4-overekspression varierede betydeligt i de modtagere, der modtog transtransucerede B-1a-celler fra CXCR4 (figur 6c,d). Derfor brugte vi associative analyser for at påvise, at øget CXCR4-ekspression korreleret med øget B-1a migration og lokalisering til knoglemarven, som er forbundet med øget plasma IgM (tabel 3 og tabel 4).
Begrænsninger af denne metode omfatter det store antal mus, der kræves for at få tilstrækkeligt antal succesfuldt trans inducerede B-1a celler, og variabiliteten i transduktionseffektiviteten fra et forsøg til et andet. Transduktionseffektiviteten forbedres ved højere titere af virale bestande, som skal være mindst 2 x 107 infektiøsepartikler/ml 14. Brugen af ældre mus, i alderen 12−16 uger kan også forbedre peritoneal B-1 celle udbytte, som peritoneal B-1 celletal stige med alderen17.
Det er også vigtigt at bemærke, at mængden af IgM udskilles af trans inducerede B-1a celler post-adoptivoverførsel var ~ 5 gange mindre end den mængde udskilles af ikke-transduced B-1a celler efter adoptivoverførsel til samme Rag1-/- ApoE-/- model (data ikke vist). Dette kan skyldes kravet om aktivering af B-1-celler med TLR9-agonist før retroviral transduktion (figur 3), som kan begrænse sekundær aktivering og IgM-produktion som reaktion på OSE in vivo efter adoptivoverføring. For undersøgelser, der kræver robust IgM-produktion ved overførte B-1a-celler, kan alternative genoverførselsteknikker, der ikke kræver forudgående aktivering af B-1a-celler, såsom lentiviral levering18,19, derfor vise sig nyttige. Alternativt kan ændringer af denne protokol, der involverer aktiveringsstrategier for at fremkalde spredning, men ikke B-1a differentiering i IgM-udskillende celler, også være tilstrækkelige til vellykket retroviral transduktion uden at påvirke sekundær B-celleaktivering. IL-5 er en vigtig cytokin mægle B-1a celle spredning og overlevelse, og kan være et effektivt alternativ til TLR9 stimulation20,21.
Tidligere undersøgelser har udnyttet milt B-celler isoleret gennem positive eller negative udvælgelsesstrategier ved hjælp af antistoffer mod B220 (B-cellemarkør) eller Thy1.2 (T-cellemarkør)13,14. B220+ milt B-celler er imidlertid en heterogen population, der indeholder undergrupper af B-1 og B-2 celler. Desuden er B-1-cellefrekvensen inden for den samlede milt-CD19+ B-cellepopulation lav (1−2%). I modsætning hertil anvender denne metode bughulen som en B-1 celle kilde til transduktion, som B-1 celler omfatter 60−70% af den samlede CD19 + B-celler i dette rum22, og bruger CD23 som en markør for nedbryder bughinde B-2 celler. Efterfølgende sortering af let trans inducerede B-1a-celler baseret på GFP, CD19, B220, CD23, IgM og CD5-udtrykket giver yderligere mulighed for overførsel af en mere specifikt defineret celletype. Den magnetiske udtyndingsstrategi for at berige peritoneale B-1-celler effektivt forarmet T-celler, og reduceret F4/80 peritoneal makrofag frekvens med ~ 50% i vores hænder (Figur 2), selvom yderligere optimering og fejlfinding af dette kritiske skridt kan øge transduktion effektivitet. For eksempel kan ved hjælp af en højere koncentration af biotinyleret F4/80 antistof for bedre makrofag nedbrydning yderligere øge B-1a celletransduktion effektivitet, da der ville være mindre "off-target" retroviral transduktion af andre celletyper. Brugen af 96-godt runde bund plader til transduktion, i stedet for flad-bund 24-brønd eller 6-brønd plader yderligere væsentligt forbedret transduktion effektivitet (Tabel 2), men øger håndtering og pipettering tid.
Samlet set giver denne metode en nyttig proof-of-concept tilgang til at afgøre, om målrettet genlevering til B-1a celler kan ændre B-1a cellelokalisering og funktionel IgM produktion. Fremtidige anvendelser af denne teknik kan omfatte ex vivo levering af retrovirale konstruktioner rettet mod andre proteiner, og adoptivoverførsel for at bestemme dens virkning på donor eller vært celle processer in vivo, herunder celle overlevelse, migration, spredning, eller funktion. Adoptivoverførsel til immunkompetente værter i stedet for lymfocyt-mangelfulde værter vil også være mulig med denne teknik, da donorceller (CD45.1+ GFP+) kunne skelnes fra værtsceller (CD45.2+ GFP-). Målretning andre chemokine receptorer ved hjælp af denne metode kunne yderligere støtte den hypotese, at målretning B-1a celle migration mod nicher eftergivende af høj IgM produktion effektivt kan øge niveauet af beskyttende IgM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projekt 3 af P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) og R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye blev støttet af American Heart Association Pre-ph.d.-stipendium 16PRE30300002 og 5T32AI007496-20. Vi takker Joanne Lannigan, Mike Solga, og Claude Chew fra University of Virginia Flow Cytometry Core for deres fremragende teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
