Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.
Abstract
Da die Zellfunktion von Nischen-spezifischen Faktoren in der zellulären Mikroumgebung beeinflusst wird, können Methoden zur Sezieren von Zelllokalisierung und Migration weitere Einblicke in die Zellfunktion liefern. B-1a-Zellen sind eine einzigartige B-Zell-Untergruppe in Mäusen, die schützende natürliche IgM-Antikörper gegen oxidationsspezifische Epitope produzieren, die während Gesundheit und Krankheit entstehen. Die B-1a-Zell-IgM-Produktion unterscheidet sich je nach B-1a-Zellposition, und daher wird es aus therapeutischer Sicht nützlich, die B-1a-Lokalisierung auf Nischen auszurichten, die eine hohe Antikörperproduktion unterstützen. Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten B-1a-Zellmigration in das Knochenmark durch retroviral-vermittelte Überexpression des C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptors 4 (CXCR4). Die Geninduktion in primären murinen B-Zellen kann eine Herausforderung darstellen und führt je nach Technik zu niedrigen Transfektionseffizienzen von 10-20%. Hier zeigen wir, dass die retrovirale Transduktion von primären murinen B-1a-Zellen zu einer Transduktionseffizienz von 30-40% führt. Diese Methode nutzt die Adoptivzellübertragung von transduzierten B-1a-Zellen in B-Zell-mangelhafte Empfängermäuse, so dass spender-B-1a-Zellmigration und -lokalisierung visualisiert werden können. Dieses Protokoll kann für andere retrovirale Konstrukte modifiziert werden und kann in verschiedenen funktionellen Assays nach der Adoption verwendet werden, einschließlich der Analyse des Phänotyps und der Funktion von Spenderzellen oder Wirtszellen oder der Analyse von löslichen Faktoren, die nach der B-1a-Zellübertragung abgesondert werden. Die Verwendung von unterschiedlichen Spender- und Empfängermäusen, die nach CD45.1- und CD45.2-Allotyp unterschieden werden, und das Vorhandensein eines GFP-Reporters innerhalb des retroviralen Plasmids könnten auch den Nachweis von Spenderzellen in anderen, immunreichen Mausmodellen ermöglichen, die endogene B-Zellpopulationen enthalten.
Introduction
Jüngste Studien haben eine beträchtliche Immunzelle, insbesondere B-Zelle, phänotypische und funktionelle Heterogenität in Abhängigkeit von der Zelllokalisierung1,2,3,4,5gezeigt. B-1a-Zellen sind eine solche Population mit heterogener Fähigkeit, schützende IgM-Antikörper zu produzieren; Knochenmark B-1a-Zellen sezernieren IgM konstitutiv und tragen signifikant zu Plasma-IgM-Titers6bei, während peritoneale B-1a-Zellen bei Homöostase eine niedrige IgM-Sekretion haben und stattdessen durch angeborenen mautähnlichen Rezeptor (TLR) oder zytokinvermittelte Signalisierung aktiviert werden können, um sich schnell zu vermehren, zu migrieren und igM7,8,9,10zu sezernieren. B-1a-Zell-IgM-Antikörper erkennen oxidationsspezifische Epitope (OSE), die auf Krankheitserregern, apoptotischen Zellen und oxidierter LDL vorhanden sind, und IgM-Bindung an OSE kann entzündliche nachgeschaltete Signalisierung bei Krankheiten wie Arteriosklerose verhindern11. Daher können Strategien zur Erhöhung der IgM-Produktion durch erhöhung der peritonealen B-1a-Zellmigration zu Orten wie dem Knochenmark therapeutisch nützlich sein. Jedoch, Es ist wichtig, dass solche Strategien gezielt und zellspezifisch sind, da Off-Target-Effekte die Immunfunktion oder Gesundheit negativ beeinflussen können.
Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten und langfristigen Überexpression von CXCR4 in primären murinen B-1a-Zellen und nachfolgender Adoptivübertragung zur Visualisierung der Zellmigration und der funktionellen IgM-Antikörperproduktion (Abbildung 1). Die genetische Manipulation von primären B-Zellen wird durch niedrige Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Transfektion transformierter Zelllinien eingeschränkt. Da transformierte Zelllinien jedoch erheblich von den Primärzellen12,13abweichen können, ist es wahrscheinlich, dass die Verwendung von Primärzellen Ergebnisse liefert, die sich stärker an der normalen Physiologie ausrichten. Mehrere Techniken wurden für den Gentransfer in primären murinen B-Zellen beschrieben, einschließlich retroviraler Transduktion, adenoviraler Transduktion, Lipofektion oder elektroporationsbasierter Transfektion, die unterschiedliche Effizienz, Vergänglichkeit und Auswirkungen auf die Zellgesundheit haben13,14,15. Die folgende Methode nutzte die retrovirale Transduktion, da sie eine ausreichende Genübertragungseffizienz von >30 % bei minimaler Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit ergab. Das CXCR4-exezierende Retrovirus wurde mit dem zuvor beschriebenen retroviralen Konstrukt murinen Stammzellvirus-internen ribosomalen Eintrag site-greenescent Protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, in das das Maus-CXCR4-Gen 4 subkloniert4wurde. MigR1 (Control(Ctl)-GFP) und CXCR4-GFP retrovirale Partikel wurden mit Calciumphosphattransfektion erzeugt, wie in den zuvor veröffentlichten Protokollen4,14beschrieben.
Erfolgreich transduzierte B-1a-Zellen wurden dann intravenös in lymphozyten-defizientenRag1-/- Mäusen übertragen. Sowohl Spender- als auch Empfängermäuse enthielten zusätzlich Knockout des Apolipoproteins E (ApoE)-Gens, was zu einer erhöhten OSE-Akkumulation und Arteriosklerose führt und somit ein Modell für die In-vivo-B-1-Zellaktivierung und IgM-Produktion darstellt. Darüber hinaus unterschieden sich Spender- und Empfängermäuse in CD45-Allotyp; Spender-B-1-Zellen stammten von CD45.1+ ApoE-/- Mäusen und wurden in Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- Empfänger übertragen. Dies ermöglichte die Differenzierung von Spender-CD45.1 von Empfänger-CD45.2-B-Zellen nach der Übertragung, ohne dass b-Zellmarker während der Durchflusszytometrieanalyse zusätzlich gefärbt werden mussten. Die hier bereitgestellten Ergebnisse zeigen, dass die gezielte CXCR4-Überexpression auf B-1a-Zellen mit einer erhöhten Fähigkeit von B-1a-Zellen zur Migration in das Knochenmark assoziiert, was mit erhöhtem Plasma-Anti-OSE-IgM assoziiert. Darüber hinaus bieten wir ein Verfahren zur Anreicherung von peritonealen B-1-Zellen durch negative Selektion an und demonstrieren die Anforderung der B-1-Zellaktivierung für eine effiziente Transduktion. Diese Methode kann für andere retrovirale Konstrukte angepasst werden, um die Wirkung der Proteinüberexpression auf die B-1a-Zellmigration, den Phänotyp oder die Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus könnte die Verwendung von CD45.1 im Vergleich zu CD45.2-Allotyp-Unterscheidung theoretisch den Transfer in andere immunausreichende murine Modelle ermöglichen, die endogene B-Zellen enthalten.
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Protocol
Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Virginia genehmigt.
1. Magnetische Trennung und Anreicherung von peritonealen B-1-Zellen
- Euthanisieren Sie eine 12-14 Wochen alte, männliche, CD45.1+ApoE-/- Maus mit CO2.
- Machen Sie einen oberflächlichen Schnitt in den Bauch mit geraden chirurgischen Schere und schälen Sie rücken Die Haut mit gebogenen Schere, um die Peritonealwand auszusetzen. Unterspülen Sie die Peritonealhöhle mit 10 ml 37 °C RPMI-1640 Medium mit einer 10 ml Spritze und einer 25 G Nadel. Schütteln Sie die Maus, um Zellen zu lösen, indem Sie den Schwanz greifen und die Mausseite gründlich für 15-20 s bewegen.
HINWEIS: Die Massierung des lavaged Peritoneumkannes kann auch die Zellwiederherstellung maximieren. - Sammeln Sie Peritonealflüssigkeit mit einer 10 ml Spritze und 25 G Nadel, indem Sie Flüssigkeit an der unteren rechten Seite des Peritoneums knapp über dem Niveau der Hüfte, in der Nähe des Darms. Vermeiden Sie die Störung epidydimaler Fettdepots und der darunter liegenden Organe. Vermeiden Sie das Ziehen von Flüssigkeit von der linken Seite der Maus, da das Omentalfett leicht in die Spritze gezogen werden kann.
- Sobald 6 x 7 ml Flüssigkeit gesammelt ist, in ein 50 ml kegelförmiges Rohr auf Eis gelegt geben. Als nächstes heben Sie die Maus vertikal, indem Sie die Peritonealwand mit Zangen über dem Zwerchfell halten, so dass die verbleibende Flüssigkeit am Boden der Peritonealhöhle verbleibt. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Peritonealwand mit chirurgischen Scheren über der Leber (stellen Sie sicher, nicht die Leber zu schneiden) und sammeln Sie alle verbleibenden Peritonealflüssigkeit mit einer Glaspipette und Glühbirne.
- Peritoneale Auswaschzellen aus allen CD45.1+ApoE-/- Mäusen (n = 15-20) in 50 ml konische Röhren bündeln und auf Eis lagern.
HINWEIS: Zur Berechnung der Anzahl der benötigten Mäuse: B-1a-Zellen machen 5 bis 10 % der gesamten Peritonealpopulation aus und ergeben etwa 2,5 x 5 x 105 B-1a-Zellen pro Maus in den Händen der Autoren. Die Transduktionseffizienz liegt bei 30 bis 40 %, wie unten gezeigt. - Zählen Sie lebende Zellen mit einem Lebensfähigkeitsfarbstoff wie Trypanblau und Hämozytometer (Proben 1:5 in Trypanblau verdünnen und 10 l in die Hämozytometerkammer laden). Poolzellen mit bis zu 1 x 108 Zellen pro Tube. Zentrifugenzellen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C, dann Aspirat Überstand.
- Bis zu 1 x 108 Zellen in 1 ml Anti-CD16/CD32-Antikörper (Materialtabelle) 1:50 im Assaypuffer verdünnt (1x Phosphat gepufferte Kochstoffkochin [PBS], 0,5% Rinderserumalbumin [BSA], 2 mM EDTA), um Fc-Rezeptoren zu blockieren. Skalieren Sie je nach Bedarf basierend auf der Zellanzahl. 10 min bei 4 °C auf Eis bebrüten.
- Bereiten Sie eine 2x Master-Mischung der biotinylierten Antikörper (Tabelle 1) im Assay-Puffer für die Erschöpfung vor. Der 2x Master Mix berücksichtigt das Volumen der Flüssigkeit, in der sich die Zellen bereits beim Inkubieren mit Anti-CD16/CD32 befinden. Wenn beispielsweise Zellen in 500 L verdünnter Anti-CD16/CD32 brüten, fügen Sie 500 L 2x Master-Mix hinzu, der 10 l biotinylierte Ter119-, Gr-1-, CD23- und NK1.1-Antikörper enthält, und 25 l biotinylierten F4/80-Antikörpern, um die in Tabelle 1angegebenen Endkonzentrationen zu erreichen. 2x Master-Mix zu den Zellen geben und 20 min bei 4 °C färben.
- Waschzellen mit 5 ml Assaypuffer und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und Aspiratüberstand.
- Resuspend und inkubieren Zellen mit Anti-Biotin-Mikroperlen (Tabelle der Materialien) im Assay-Puffer gemäß der vom Hersteller empfohlenen Konzentration und Protokoll verdünnt.
- Mit 5 ml Assaypuffer und Zentrifuge bei 400 x g 5 min bei 4 °C waschen. Aspirieren Sie Überstand und resuspendieren Sie bis zu 1 x 108 Zellen in 500 l Assaypuffer.
- Prime magnetische Auswahlsäulen (Materialtabelle) mit 3 ml Assaypuffer. Übertragen Sie Zellen auf grundierte magnetische Selektionssäulen und sammeln Sie das Eluent, das angereicherte B-1-Zellen enthält, in einem 15 ml konischen Rohr auf Eis. Waschen Sie die magnetische Selektionssäule mit zusätzlichem Assaypuffer, bis das gesammelte Gesamtvolumen 10 ml beträgt.
ANMERKUNG: Ein Aliquot der vorgereinigten und nachgereinigten Zellfraktionen sollte separat durch Durchflusszytometrie zur Reinigung der Effizienz durch Färbung von CD19+ B-Zellen, F480+ Makrophagen und CD5+ T-Zellen analysiert werden, wie in Abbildung 2dargestellt. - Zählen Sie die postgereinigte Zellfraktion (das Eluent, das angereicherte B-1-Zellen enthält) durch Zählen lebender Zellen gemäß Schritt 1.6, und bei 1 x 106 Zellen/ml im B-Zellkulturmedium (RPMI-1640, 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum [FBS], 10 mM HEPES, 1x nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 50 g/ml Gentamicin, 55 m-Mercaptoethanol)
2. Peritoneale B-1-Zellstimulation
- Split gepoolte Zellen für die beiden transduced Bedingungen (Ctl-GFP und CXCR4-GFP), während beiseite und beschichtungen mindestens 10 x 106 Zellen für eine nicht-transduced Steuerung.
- Platte bis zu 150 l (150.000 Zellen) pro Well in 96-well Rundbodenplatten.
- Fügen Sie 100 nM TLR9 Agonist ODN1668 zu allen Brunnen hinzu, um die Zellproliferation zu stimulieren.
- Inkubieren für 16-18 h bei 37 °C, 5%CO2.
3. Retrovirale Transduktion von Peritoneal-B-Zellen
- Generieren Sie ctl-GFP (MigR1) und CXCR4-GFP retrovirale Partikel mit Calciumphosphattransfektion, wie in den zuvor veröffentlichten Protokollen14beschrieben.
HINWEIS: Dies wird mehrere Tage dauern, also bereiten und titer retrovirale Bestände und speichern Aliquots bei -80 °C vor Dem Start dieses Protokolls. - Tauen Retrovirus-Bestände auf Eis. Verwenden Sie sofort und nicht wieder einfrieren, da Virus-Titer während des Frost-Tau-Zyklen deutlich abnimmt. Fügen Sie den Zellen ctl-GFP oder CXCR4-GFP retrovirale Überstandmittel bei 20:1 Infektionsvielfalt (MOI) in Gegenwart von 8 g/ml Polybren und frischem Mercaptoethanol bei einer Endkonzentration von 55 m hinzu. Fügen Sie den Zellen, die für die nicht-transduced Kontrolle vorgesehen sind, keine virusischen Bestände hinzu.
- Führen Sie die Spritzinfektion durch Zentrifugieren von Platten bei 800 x g für 90 min bei Raumtemperatur durch.
- Inkubieren Platten mit Retrovirus bei 37 °C, 5%CO2 für zusätzliche 3 h.
- Stammzellen in frischem B-Zellmedium ernten und neu probandieren und bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht inkubieren.
4. Zellsortierung von transduzierten peritonealen B-1a-Zellen
- Ernten Sie kultivierte Zellen und bündeln Sie in drei separate 50 ml konische Röhren für jede Bedingung: nicht transduced, Ctl-GFP transduced und CXCR4-GFP transduced.
- Zählen Sie lebende Zellen wie in Schritt 1.6, dann Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und Aspirat überstand.
- Resuspend Zellen bei 100.000 Zellen/L im Sortierpuffer (PBS + 1% BSA) mit 1:50 Anti-CD16/CD32 Antikörper (Tabelle der Materialien), um Fc-Rezeptoren zu blockieren. 10 min bei 4 °C auf Eis bebrüten.
- Aliquot-Zellen für Kompensationskontrollen (30.000 Zellen pro Kompensationskontrolle): für ungefärbte und einzelne Fleckenkontrollen, die aus nicht transduced Proben aliquot werden, und für GFP-Einzelfleckenkontrolle, die aus transduzierten Proben aliquot.
HINWEIS: Kommerziell erhältliche Kompensationsperlen können alternativ für einzelne Fleckenkontrollen verwendet werden, wenn die nicht transducierte Zellnummer niedrig ist. - Bereiten Sie einen 2x Antikörper-Master-Mix vor, der die fluorophorkonjugierten Antikörper im Sortierpuffer enthält (Tabelle 1). Fügen Sie den 2x Master-Mix nicht transduced, CTL-GFP transduced und CXCR4-GFP transduced Samples hinzu. Fügen Sie einzelne Antikörper zu einzelnen Fleckenkontrollen hinzu. 20 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
HINWEIS: Der 2x Master-Mix berücksichtigt das Volumen der Flüssigkeit, in der sich die Zellen bereits bei der Inkubation mit Anti-CD16/CD32 befinden, wie in Schritt 1.8. Ein Aliquot von Zellen aus jeder Bedingung kann separat für CXCR4 gebeizt werden, um die CXCR4-Überexpression zu bestätigen. - Proben mit 1 ml Sortierpuffer waschen und durch 70 m Filter in Polypropylen-Rohre abziehen.
- Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und Aspirat-Überstand. Resuspend Proben bei 50.000 Zellen / L im Sortierpuffer.
- Vor der Zellsortierung präzierte fluoreszenzaktivierte Zellsortierungs-Röhrchen (FACS) mit 1 ml Sammelmedium (RPMI-1640, 20% hitzeinaktiviertes FBS, 10 mM HEPES, 1x nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 50 g/ml Gentamicin, 55 m -M-Mercaptoethanol) für jede zu sortierende Population.
- Vor dem Ausführen von Proben auf dem Zellsortierer fügen Sie 2x DAPI (vorbereitet als 1:5000 Verdünnung im Sortierpuffer) für die Diskriminierung toter Zellen hinzu.
- Sortieren Sie GFP+ B-1a-Zellen in FACS-Röhren, die ein Sammelmedium als DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ Zellen aus den Proben CTL-GFP und CXCR4-GFP enthalten. Verwenden Sie das nicht transduced Sample, um das GFP+-Gate einzustellen und DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ nicht transduced B-1a-Zellen zu sortieren.
HINWEIS: Alternativ können nicht transducierte Zellen auch aus den CTL-GFP- und CXCR4-GFP-Proben sortiert werden, indem B-1a-Zellen innerhalb der GFP-Fraktion getrennt gekreuzt werden. Transduced oder nicht-transduced B-1b-Zellen können auch mit dieser Sortierstrategie als DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- Zellen sortiert werden.
5. Adoptivtransfer
- Zentrifugenzellen bei 400 x g bei 5 min bei 4 °C und Aspiratüberstand bei 4 °C vorsichtig ansaugen.
- Resuspend Zellen in kaltsterilen 1x PBS bei 1.000 Zellen/L.
- Anästhetisieren Sie männliche Rag1-/- ApoE-/- Mäuse mit Isofluran und injizieren Sie 100 l (100.000 Zellen) pro Maus mittels intravenöser retroorbitaler oder Schwanzveneninjektion mit einer ultrafeinen Insulinspritze. Injizieren Sie ein paar Mäuse mit 1x PBS als Steuerung.
6. Quantifizierung von Spenderzellen und Plasma IgM
- Analysieren Sie zum gewünschten Zeitpunkt nach der Adoption übertragene Zellen in Empfängermäusen nach Knochenmark und Milzgewebe Ernte4 und Durchflusszytometrie. Quantifizieren Sie die Lokalisierung der Spenderzellen und die CXCR4-Überexpression durch Färbung für CD45.1, CD45.2 und CXCR4, und analysieren Sie die Ergebnisse der Durchflusszytometrie mithilfe einer Software wie Flowjo.
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Antikörper, die in diesem Schritt verwendet werden. Achten Sie darauf, kein Antikörperkonjugat zu verwenden, das fluoreszenz im FITC-Kanal als GFP auf transduzierten Spenderzellen vorhanden ist. - Isolieren Sie das Plasma, indem Sie 10 l 0,5 M EDTA zu Vollblut hinzufügen, das zum Zeitpunkt der Tieropfer durch Herzpunktion gesammelt wurde. Zentrifugieren Sie Vollblut bei 7.000 x g und Aliquotplasma in separate 1,5 ml Zentrifugenröhren. Bei -80 °C speichern, bis die Analyse von sezernierten Faktoren wie IgM von ELISA4durchgeführt wird.
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Representative Results
Eine Übersicht über das Protokoll finden Sie in Abbildung 1. Abbildung 2 zeigt die Anreicherung von peritonealen B-1a-Zellen nach magnetischer Erschöpfung anderer Peritonealzelltypen. Lebende Singletzellen in der Post-Depletion-Fraktion haben einen größeren Anteil an CD19+ B-Zellen im Vergleich zu F4/80+ Makrophagen, fehlen CD5hi CD19- T-Zellen und enthalten eine erhöhte Frequenz von CD19+ CD5-Mittel-B-1a-Zellen im Vergleich zur Vor-Depletion-Fraktion.mid Abbildung 3 zeigt die Anforderung der B-Zellaktivierung für eine erfolgreiche retrovirale B-Zelltransduktion und eine dosisabhängige Erhöhung der Häufigkeit erfolgreich transduzierter GFP+B-Zellteilmengen mit zunehmendem Virus MOI mit Ctl-GFP-Retrovirus. Tabelle 2 zeigt eine erhöhte Transduktionseffizienz mit 96 gut runden Bodenplatten im Vergleich zu 24-Well- oder 6-Well-Platten. Abbildung 4 zeigt erfolgreiche CXCR4-Überexpression (>40%) auf B-1-Zellen und erhöhte B-1-Zellmigration in Richtung CXCL12 in vitro nach der Transduktion mit CXCR4-GFP-Retrovirus, ohne signifikante Auswirkungen auf die B-Zell-Lebensfähigkeit. Abbildung 5 zeigt die Gating-Strategie für die Sortierung von Live-, Singlet-, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ B-1a-Zellen aus einer nicht transduced Condition (GFP-) oder den beiden transduced conditions (GFP+). Beachten Sie, dass CD23+ B-2-Zellen in diesen Proben aufgrund einer früheren magnetischen Erschöpfung nicht vorhanden sind. Mit dieser Gating-Strategie können auch transduced live, singlet, CD19+ CD23- IgM+ CD5- B-1b Zellen sortiert werden. Abbildung 6 zeigt übertragene CD45.1+-Spenderzellen und eine anhaltende CXCR4-Überexpression auf Spenderzellen, die aus Knochenmark und Milz von CD45.2-Empfängermäusen 17 Wochen nach der Übertragung der Zelle gewonnen wurden. Tabelle 3 zeigt eine positive Assoziation zwischen CXCR4-Expression und Spenderzelllokalisierung zum Knochenmark, aber nicht Milz. Tabelle 4 zeigt eine positive Assoziation zwischen der Spenderzellzahl im Knochenmark und der Plasmamenge von Anti-MDA-LDL IgM.
Abbildung 1: Schematic des experimentellen Designs für retrovirale Transduktion und Adoptivübertragung. Peritonealzellen, die aus CD45.1-Allotyp-Mäusen isoliert sind, werden durch magnetische Erschöpfung mit biotinylierten Antikörpern und Antibiotin-Mikroperlen für B-1-Zellen angereichert. Angereicherte peritoneale B-1-Zellen werden aktiviert, um die Zellproliferation mit DemLR9-AgonistcpG-Oligodeoxynukleotid zu stimulieren. Aktivierte Zellen werden mit ctl-GFP oder CXCR4-GFP retroviralen Partikeln transduziert. Erfolgreich transduced GFP+ B-1a-Zellen werden mit FACS sortiert und adoptiv in CD45.2-Allotyp-Wirtsmäuse übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Anreicherung für peritoneale B-1-Zellen. Repräsentative Durchflusszytometrie-Plots von Peritonealzellen vormagnetische anreicherung (oben) und postmagnetische Anreicherung (unten) für CD19+ B-Zellen. CD19+ F4/80- Zellen sind B-Zellen, CD19- F4/80+ Zellen sind Makrophagen, CD19+CD5-Mittelzellen sind B-1a-Zellen und CD19-CD5-Hi-Zellen Sind T-Zellen.hi Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die retrovirale Transduktion erfordert eine B-Zellaktivierung. Peritoneale B-Zellen wurden mit Ctl-GFP-Retrovirus bei 5:1, 10:1 oder 25:1 MOI transduziert oder in Gegenwart oder Abwesenheit des TLR9-Agonisten CpG ODN1668 nicht transduziert zurückgelassen. Die Häufigkeit erfolgreich transducierter GFP+ B2-, B1-, B-1a- oder B-1b-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie 18 h nach der Transduktion quantifiziert. Fehlerbalken stehen für den Mittelwert SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bestätigung der CXCR4-Überexpression und erhöhte B-1a-Migration in vitro. Peritoneale B-Zellen aus ApoE-/- Mäuse mit B-Zell-spezifischem CXCR4-Mangel wurden isoliert und mit Ctl-GFP- oder CXCR4-GFP-Retrovirus transduziert oder ohne Transduktion kultiviert. (a) Repräsentative Durchflussdiagramme der CXCR4- und GFP-Expression auf B-1-Zellen aus nicht transduced (oben links), Ctl-GFP-Transduced (unten links) oder CXCR4-GFP-transduced (unten rechts) Bedingungen. FMO-CXCR4 (oben rechts) zur Einstellung des CXCR4-Positivgates. (b) Quantifizierung des MFI von CXCR4 auf GFP+ B-1-Zellen aus nicht transduced (n = 1), Ctl-GFP transduced (n = 2) oder CXCR4-GFP transduced (n = 2) Bedingungen. (c) Häufigkeit von nicht transduzierten (n = 1), Ctl-GFP-Transduced (n = 2) oder CXCR4-GFP-Transduced (n = 2) B-1-Zellen, die in Prozent der Gesamtanzahl der in Transwell geladenen B-1-Zellen in CXCL12 migriert wurden. (d) Repräsentative Gating-Strategie zur Quantifizierung lebensfähiger Zellen innerhalb der erfolgreich transduzierten B-Zellpopulation (CD19+GFP+). (e) Häufigkeit lebender B-Zellen nach Transduktion mit Ctl-GFP (n = 2) oder CXCR4-GFP-Retrovirus (n = 2). Fehlerbalken stellen den Mittelwert " SEM" dar. Diese Zahl wurde aus unserer vorherigen Veröffentlichung4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Gating-Strategie zum Sortieren von transduzierten GFP+ B-1a-Zellen. Repräsentative Durchflusszytometrie-Plots zum Sortieren von GFP+- oder GFP-B-1a-Zellen aus einer nicht transduced Probe (oben), einer Ctl-GFP-Transduced-Probe (Mitte) und einer CXCR4-GFP-transduzierten Probe (unten). B-1a-Zellen definiert als Live-, Singlet-, CD19+ CD23- IgM+ CD5+-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Quantifizierung der übertragenen Spenderzellen. Repräsentative Durchflusszytometrie-Plots mit CD45.1+ CD45.2- Spenderzellen von einem PBS-Steuerelement (oben), einem Ctl-GFP+ B-1a-Zellempfänger (Mitte) und einem CXCR4-GFP+ B-1a-Zellempfänger (unten) und anschließender Analyse der CXCR4-Expression auf Spenderzellen im Knochenmark (a) oder Milz (b). Quantifizierung der CXCR4-Expression (mittlere Fluoreszenzintensität, MFI) auf Spenderzellen aus Knochenmark (c) oder Milz (d). Quantifizierung der Anzahl der Spenderzellen, die im Knochenmark (e) oder Milz (f) der Empfänger zurückgewonnen wurden. *P < 0.05 oder **P < 0.01 von Mann-Whitney test. Fehlerbalken stellen den Mittelwert " SEM" dar. Diese Zahl wurde aus unserer vorherigen Veröffentlichung4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Protokollschritt | Antikörper | Endgültige Konzentration |
| Schritt 1.8 | Ter119 Biotin | 1 L pro 100 l Endvolumen |
| CD3e Biotin | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| Gr-1 Biotin | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| CD23 Biotin | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| NK1.1 Biotin | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| F4/80 Biotin | 2,5 l pro 100 l Endvolumen | |
| Antikörper | Endgültige Konzentration | |
| Schritt 4.5 | CD5 PE | 1 L pro 100 l Endvolumen |
| IgM PECF594 | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| CD23 PECy7 | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| B220 APC | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| CD19 APCef780 | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| Antikörper | Endgültige Konzentration | |
| Schritt 6.1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 1 L pro 100 l Endvolumen |
| CD45.2 BV421 | 1 L pro 100 l Endvolumen | |
| CXCR4 APC | 2,5 l pro 100 l Endvolumen |
Tabelle 1: Antikörper und ihre endgültigen Konzentrationen, die im Protokoll verwendet werden.
| Zustand | %GFP+ der Gesamtbevölkerung | %GFP+ der CD19+ B-Zellen |
| 96-Well-Rundbodenplatte | 30.9% | 52.7% |
| 24-Well-Platte | 8.4% | 21.2% |
| 6-Well-Platte | 16.2% | 27.3% |
Tabelle 2: Plattenoptimierung. Häufigkeit erfolgreich transduzierter Gesamt-GFP+-Zellen oder GFP+ CD19+ B-Zellen nach Transduktion von 6 x 106 angereicherten peritonealen B-1-Zellen in einer 96-well-Rundbodenplatte (40 Bohrungen bei 150,00 0 Zellen pro Brunnen), eine 24-Well-Platte (6 Brunnen bei 1 x 106 Zellen pro Brunnen) oder eine 6-Well-Platte (3 Brunnen bei 2 x 106 Zellen pro Brunnen) bei einem 20:1 MOI mit Ctl-GFP-Retrovirus.
| Variable | MFI von CXCR4 auf Spender-B-1a-Zellen | |
| r-Wert | p-Wert | |
| Anzahl der B-1a-Zellen im Knochenmark | 0.71 | *0.014 |
| Anzahl der B-1a-Zellen in Milz | 0.43 | 0.18 |
Tabelle 3: Zuordnung zwischen CXCR4-Expression auf Spenderzellen und Spenderzelllokalisierung. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CXCR4 an Spender-B-1a-Zellen korrelierte mit der Anzahl der Spender-B-1a-Zellen im Knochenmark oder Milz von Rag1-/- ApoE-/- Empfängermäusen 17 Wochen nach der Adoption. Daten, die als Korrelationskoeffizient (r) und statistische Signifikanz (p) dargestellt werden. Diese Tabelle wurde aus unserer vorherigen Veröffentlichung4geändert.
| Variable | Anzahl der Spenderzellen im Knochenmark | |
| r-Wert | p-Wert | |
| Plasma anti-MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| Plasma E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| Plasma 1,3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
Tabelle 4: Assoziation zwischen Spenderzelllokalisierung und Plasmamenge an Anti-OSE IgM. Die Anzahl der Spender-B-1a-Zellen im Knochenmark von Rag1-/- ApoE-/- Empfängermäuse 17 Wochen nach der Adoptionsübertragung korreliert mit der zirkulierenden Menge an Anti-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM oder Anti-1,3-Dextran IgM. Daten, die als Korrelationskoeffizient (r) und statistische Signifikanz (p) dargestellt werden. Diese Tabelle wurde aus unserer vorherigen Veröffentlichung4geändert.
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Discussion
Die hier angebotene Methode ermöglicht eine stabile und relativ effiziente primäre B-1a-Zellgenabgabe, in vivo-Adoptivübertragung sowie die Identifizierung und Lokalisierung der injizierten Zellen. Zellen konnten 17 Wochen nach der Zellübertragung nachgewiesen und eine erhöhte CXCR4-Expression beibehalten werden. Retrovirus-vermittelte Abgabe ergab 30-40% Transduktionseffizienz der primären murinen B-1a-Zellen mit minimalen Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit in unseren Händen (Abbildung 4e). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen einer früheren Studie von Moghimi und Kollegen, die Techniken für den Gentransfer in primäre murine B-Zellen einschließlich retroviraler Infektion, adenoviraler Infektion, Nukleofektion oder Lipofectamin15verglichen hat. Wir stellten jedoch fest, dass das Spektrum der CXCR4-Überexpression innerhalb der Empfänger, die CXCR4-GFP-transduzierte B-1a-Zellen erhielten, erheblich variierte(Abbildung 6c,d). Daher haben wir assoziative Analysen verwendet, um zu zeigen, dass eine erhöhte CXCR4-Expression mit einer erhöhten B-1a-Migration und Lokalisierung auf das Knochenmark korreliert, die mit erhöhtem Plasma-IgM verbunden ist (Tabelle 3 und Tabelle 4).
Zu den Einschränkungen dieser Methode gehören die große Anzahl von Mäusen, die erforderlich sind, um eine ausreichende Anzahl erfolgreich transduzierter B-1a-Zellen zu erhalten, und die Variabilität der Transduktionseffizienz von einem Experiment zum anderen. Die Transduktionseffizienz wird durch höhere Titer von Virusbeständen verbessert, die mindestens 2 x 107 infektiöse Partikel/ml14betragen sollten. Die Verwendung älterer Mäuse im Alter von 12 bis 16 Wochen kann auch die peritoneale B-1-Zellausbeute verbessern, da die peritonealen B-1-Zellzahlen mit17Jahren zunehmen.
Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Menge an IgM, die von transducierten B-1a-Zellen nach der Transadoption abgesondert wurde, um das 5-fache geringer war als die Menge, die von nicht transducierten B-1a-Zellen nach der Adoptivübertragung in dasselbe Rag1-/- ApoE-/- Modell sezerniert wurde (Daten werden nicht angezeigt). Dies kann auf die Anforderung der B-1-Zellaktivierung mit TLR9-Agonisten vor der retroviralen Transduktion (Abbildung 3) zurückzuführen sein, die die sekundäre Aktivierung und IgM-Produktion als Reaktion auf OSE in vivo post-adoptive Übertragung einschränken kann. Daher können sich für Studien, die eine robuste IgM-Produktion durch übertragene B-1a-Zellen erfordern, alternative Gentransfertechniken als nützlich erweisen, die keine vorherige Aktivierung von B-1a-Zellen erfordern, wie z. B. die Lentiviral-Verabreichung18,19. Alternativ könnten Änderungen an diesem Protokoll, die Aktivierungsstrategien zur Vermehrung beinhalten, aber nicht eine B-1a-Differenzierung in IgM-Sekretionszellen, auch für eine erfolgreiche retrovirale Transduktion ausreichen, ohne die sekundäre B-Zellaktivierung zu beeinträchtigen. IL-5 ist ein wichtiges Zytokin, das die Proliferation und das Überleben von B-1a-Zellen vermittelt, und kann eine wirksame Alternative zur TLR9-Stimulation20,21sein.
Frühere Studien haben Splenic-B-Zellen verwendet, die durch positive oder negative Selektionsstrategien isoliert wurden, indem Antikörper gegen B220 (B-Zellmarker) oder Thy1.2 (T-Zellmarker)13,14verwendet wurden. B220+ Splenic B-Zellen sind jedoch eine heterogene Population, die B-1- und B-2-Zellteilmengen enthält. Darüber hinaus ist die B-1-Zellfrequenz innerhalb der gesamten Milz-CD19+ B-Zellpopulation gering (1-2%). Im Gegensatz dazu nutzt diese Methode die Peritonealhöhle als B-1-Zellquelle für die Transduktion, da B-1-Zellen 60 bis 70 % der gesamten CD19+ B-Zellen in diesem Fach22ausmachen und CD23 als Marker für die Erschöpfung peritonealer B-2-Zellen verwenden. Die nachfolgende Sortierung erfolgreich transduzierter B-1a-Zellen auf Basis von GFP, CD19, B220, CD23, IgM und CD5-Expression ermöglicht die Übertragung eines genauer definierten Zelltyps. Die magnetische Erschöpfungsstrategie zur Anreicherung peritonealer B-1-Zellen dezimierte effektiv T-Zellen und reduzierte die Peritoneal-Makrophagenfrequenz von F4/80 in unseren Händen um 50 % (Abbildung 2), obwohl eine weitere Optimierung und Fehlerbehebung dieses kritischen Schritts die Transduktionseffizienz erhöhen könnte. Beispielsweise könnte die Verwendung einer höheren Konzentration von biotinylierten F4/80-Antikörpern für eine bessere Makrophagenererererpletion die B-1a-Zelltransduktionseffizienz weiter erhöhen, da es weniger "off-target" retrovirale Transduktion anderer Zelltypen geben würde. Die Verwendung von 96-Well-Rundbodenplatten zur Transduktion anstelle von flachen 24-Well- oder 6-Well-Platten hat die Transduktionseffizienz zusätzlich erheblich verbessert (Tabelle 2), erhöht jedoch die Handhabungs- und Pipettierzeit.
Insgesamt bietet diese Methode einen nützlichen Proof-of-Concept-Ansatz, um zu bestimmen, ob eine gezielte Genabgabe an B-1a-Zellen die B-1a-Zelllokalisierung und die funktionelle IgM-Produktion verändern kann. Zukünftige Anwendungen dieser Technik könnten die Ex-vivo-Lieferung retroviraler Konstrukte für andere Proteine und die Adoptivübertragung umfassen, um ihre Auswirkungen auf Spender- oder Wirtszellprozesse in vivo zu bestimmen, einschließlich Zellüberleben, Migration, Proliferation oder Funktion. Eine Adoptivübertragung auf immunkompetente Wirte statt lymphozyten-defizienten Wirten wäre mit dieser Technik auch möglich, da Spenderzellen (CD45.1+ GFP+) von Wirtszellen (CD45.2+ GFP-) unterschieden werden könnten. Targeting andere Chemokin-Rezeptoren mit dieser Methode könnte weiter die Hypothese unterstützen, dass targeting B-1a-Zell-Migration in Nischen frei von hoher IgM-Produktion kann effektiv steigern Niveaus der schützenden IgM.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 von P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) und R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye wurde von American Heart Association Pre-Doctoral Fellowship 16PRE30300002 und 5T32AI007496-20 unterstützt. Wir danken Joanne Lannigan, Mike Solga und Claude Chew von der University of Virginia Flow Cytometry Core für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
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