Summary
כאן אנו מתארים שיטה של הבעה overexpression והעברה המאמצת של תאים מורנין ב-1a כדי לבחון ב vivo B-1a תא הגירה ולוקליזציה. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור שונים הזרם התפקודי של המטה אומר כולל כימות של לוקליזציה של התורם B-1a או ניתוח של הגורמים הנגזרים לתא התורם הנגזר לאחר העברה המאמצת.
Abstract
כאשר פונקציית התא מושפעת מגורמים ספציפיים לנישה בסביבת מיקרו-הסביבה הסלולרית, שיטות לנתח את הלוקליזציה של תאים והגירה יכולות לספק תובנה נוספת בנוגע לתפקוד התא. התאים b-1a הם קבוצת משנה ייחודית של תא B בעכברים לייצר נוגדנים IgM טבעי המגן נגד האפיסקופים ספציפיים חמצון הנובעים במהלך בריאות ומחלות. B-1a הייצור של תא IgM משתנה בהתאם למיקום התא B-1a, ולכן הוא הופך להיות שימושי מבחינה טיפולית כדי למקד את B-1a לוקליזציה לתמיכה נישות של ייצור נוגדנים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה למקד את ה-B-1a תא הגירה מח העצם על ידי retroviral-ביטוי overexpression של C-X-C מוטיב קולטן כימוקין 4 (CXCR4). האינדוקציה ג'ין בתאי murine הראשי B יכול להיות מאתגר ובדרך כלל לתשואות יעילות החצייה נמוכה של 10-20% בהתאם לטכניקה. כאן אנו מדגימים כי התמרה ויראלי של התאים הראשוניים B-1a התוצאות 30-40% יעילות התמרה. שיטה זו מנצלת העברת תאים המאמצת של תאים B-1a לתוך עכבר לקוי של הנמען תא כדי להפוך את העברת התאים של התורם B-1a ולוקליזציה ניתן לדמיין. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עבור מבנים retroviral יעיל אחרים ניתן להשתמש בתוך מגוון פונקציונלי שלאחר העברה המאמצת, כולל ניתוח של תא התורם או המחשב המארח של תאים ותפקוד, או ניתוח של גורמים מסיסים מופרש post B-1a העברת תאים. השימוש של תורמים ועכברים הנמען ברורים הבדיל על-ידי CD 45.1 ו-CD 45.2 allotype ואת הנוכחות של עיתונאי GFP בתוך הפלסטלינה הretroviral יעיל אמצע יכול גם לאפשר זיהוי של תאים תורמים אחרים, החיסונית מספיק מודלים של העכבר המכיל את אוכלוסיית התאים האנדוגניים B.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו תא החיסון ניכר, ובמיוחד B תא, פנוטיic ו טרוגניות פונקציונלי בהתאם לוקליזציה של התא1,2,3,4,5. B-1a תאים הם אחד כזה אוכלוסיה עם יכולת הטרוגנית לייצר נוגדנים IgM מגן; מח עצם B-1a תאים להפריש באופן קונסטיטוטיבי ולתרום בצורה משמעותית את מגדל פלזמה מטרים6, בעוד בתאי הצפק B-1a יש ברמה נמוכה igm הפרשה ב הומאוסטזיס ובמקום זאת ניתן להפעיל דרך קולטן מולדים שיחת כמו (tlr) או cytokine בתיווך איתות כדי להתרבות במהירות, להעביר, ו להפריש igm7,8,9,10. B-1a בתאי IgM לזהות אפיסקופים ספציפיים לחמצון (OSE) הנמצאים על פתוגנים, תאים אפוטוטיים, ו-LDL תחמוצת, ו-IgM קשירה כדי OSE יכול למנוע דלקת במורד הזרם מחלות כמו טרשת עורקים11. לכן, אסטרטגיות כדי להגדיל את ייצור IgM באמצעות הגדלת הצפק B-1a תא הגירה לאתרים כמו מח העצם עשוי להיות שימושי מבחינה רפואית. עם זאת, חשוב עבור אסטרטגיות כאלה כדי להיות ממוקד ותא סוג ספציפי, כמו תופעות מחוץ ליעד עלול להשפיע באופן שלילי על תפקוד המערכת החיסונית או בריאות.
כאן אנו מתארים שיטה ממוקדת לטווח ארוך הביטוי של CXCR4 ב-murine הראשי B-1a תאים העברה המאמצת הבאים כדי להמחיש את הגירה התא וליצור נוגדנים IgM פונקציונלי (איור 1). מניפולציה גנטית של תאי B ראשי מוגבל על ידי יעילות הזיהום נמוך לעומת העברה של קווי תאים שהפכו שינוי. עם זאת, כאשר קווי תאים שעברו שינוי יכולים לסטות באופן משמעותי מתאים ראשוניים12,13, השימוש בתאים ראשיים עשוי לספק תוצאות הדוקות יותר לפיזיולוגיה נורמלית. טכניקות מספר תוארו עבור העברת גנים בתאי murine הראשי, כולל התמרה ויראלית, התמרה ויראלית, ליפוגן, או אלקטרופורציה המבוססת על מעבר, אשר יש רמות שונות של יעילות, ארעיות, והשפעה על בריאות התא13,14,15. השיטה הבאה מנוצל התמרה ויראלי כפי שהוא הניב יעילות העברת גנים נאותה של > 30% בעוד מינימלית להשפיע על הכדאיות התא. וירוס CXCR4-הביע הופק באמצעות המבנה הקודם שתוארו כretroviral יעיל לבנות תא גזע מורטין הנגיף-פנימי הזנה ריבוזומאתר-חלבון פלורסנט ירוק (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, שבו העכבר CXCR4 הגן היה משוכפל משנה4. MigR1 (בקרה (Ctl)-gfp) ו-CXCR4-gfp החלקיקים נוצרו באמצעות הזיהום סידן פוספט כפי שמתואר פרוטוקולים שפורסמו בעבר4,14.
לאחר מכן הותמרה בהצלחה בתאים B-1a והועברו באופן מידי אל לימפוציטים Rag1-/- עכברים. גם עכברים התורם וגם הנמען הכילו נוקאאוט של הגנים אפוליפופרוטאין E (apoe), אשר תוצאות הצטברות OSE מוגברת טרשת עורקים, ובכך לספק מודל עבור vivo B-1 תא הפעלה ו igm הייצור. יתר על כן, עכברים תורמים ונמענים שונים ב-CD45 allotype; התאים התורמים B-1 הגיעו מתקליטור 45.1 + ApoE-/- עכברים והועברו לתוך Rag1- Cd 45.2 + apoe-/- הנמענים. זה מותר הבידול של 45.1 CD התורם מתקליטור הנמען 45.2 B תאים שלאחר ההעברה ללא צורך להכתים בנוסף עבור סמנים תא B במהלך הניתוח cy, try הזרימה. התוצאות המסופקות כאן להדגים כי ממוקדות CXCR4 overexpression על B-1a תאים מקורביו עם יכולת מוגברת של תאים B-1a לעבור את מח העצם, אשר מקורביו עם פלזמה מוגברת anti-OSE IgM. אנו מספקים בנוסף שיטה להעשרת התאים הפריפריאלית ב -1 באמצעות בחירה שלילית ולהדגים את הדרישה של הפעלת תא B-1 לצורך התמרה יעילה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת עבור מבנים retroviral יעיל אחרים כדי ללמוד את ההשפעה של ביטוי יתר חלבון על B-1a תא הגירה, פנוטיפ, או פונקציה. יתר על כן, השימוש CD 45.1 לעומת הבחנה CD 45.2 allotype יכול תיאורטית לאפשר העברה לתוך דגמי murine אחרים מספיק החיסונית המכילים תאים אנדוגניים B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פרוטוקולי החיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש באוניברסיטת וירג.
1. הפרדה מגנטית והעשרה של תאים בעלי 1 הצפק
- המתת חסד 12-14-שבוע בן, זכר, CD 45.1+apoe-/- עכבר באמצעות CO2.
- לעשות חתך שטחי בבטן באמצעות מספריים כירורגי ישר לקלף את העור האחורי באמצעות מספריים מעוקל לחשוף את הקיר הצפק. החלל הצפק סומק עם 10 מ ל של 37 ° c RPMI-1640 בינונית באמצעות מזרק 10 מ"ל ו 25 גרם מחט. לנער את העכבר כדי לנתק את התאים על ידי אוחז את הזנב והזזת העכבר לצד בצד ביסודיות עבור 15 לאחד.
הערה: עיסוי צפק לבנה יכול גם למקסם את שחזור התא. - לאסוף נוזל הצפק באמצעות מזרק 10 מ ל 25 גרם מחט על ידי ציור למעלה נוזל בצד הימני התחתון של צפק ממש מעל רמת הירך, ליד המעיים. הימנע משיבוש מחסני שומן ואיברים המשמשים כבסיס. להימנע מציור נוזל מהצד השמאלי של העכבר כמו שומן מאונטל יכול בקלות להיגרר לתוך המזרק.
- פעם אחת ~ 6-7 mL של נוזל נאסף, מוותר על צינור 50 mL ממוקם על קרח. הבא, העלה את העכבר אנכית על ידי החזקת הקיר הצפק מעל הסרעפת באמצעות מלקחיים כך כל נוזל שנותר נשאר בתחתית חלל הצפק. לעשות חתך קטן בקיר הצפק באמצעות מספריים כירורגי מעל הכבד (לוודא שלא לחתוך את הכבד) ולאסוף את כל נוזל הצפק הנותרים באמצעות זכוכית pipet ו הנורה.
- בריכת כשלון הצפק תאים מכל התקליטורים 45.1+apoe-/- עכברים (n = 15-20 למעלה) לצינורות חרוטי 50 mL, ולאחסן על הקרח.
הערה: לחישוב מספר העכברים הדרושים: התאים ב-1a מהווים 5-10% מכלל אוכלוסיית הצפק הכוללת ומפיקות בערך 2.5-5 x 10-B- 1a תאים לכל עכבר בידי מחברים. התמרה של יעילות היא ~ 30 לערך 40%, כפי שמוצג להלן. - לספור תאים חיים באמצעות צבע הכדאיות כגון טרילקון כחול ו-הומוציטומטר (לדלל דגימות 1:5 בטריקון כחול ולטעון 10 μL לתוך החדר הומוציטוטומטר). תאי בריכה במרחק של עד 1 x 108 תאים לכל צינור. בתאי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, ולאחר מכן לאחר מכן לאכול supernatant.
- להשעות עד 1 x 108 תאים 1 מ ל של ANTI-CD16/CD32הנוגדן (טבלה של חומרים) מדולל 1:50 במאגר מאגר (1x פוספט באגירה מלוחים [PBS], 0.5% בסרום פרה אלבומין [bsa], 2 מ"מ edta) על מנת לחסום קולטני Fc. קנה מידה לפי הצורך לפי ספירת תאים. דגירה על הקרח 10 דקות ב 4 ° c.
- הכינו שילוב מאסטר של 2x של הנוגדנים הביוטילביים (טבלה 1) במאגר ה, עבור דלדול הפחת. 2x מיקס בסיס חשבונות לנפח של הנוזל התאים כבר בזמן הדגירה עם anti-CD16/CD32. לדוגמה, אם התאים מודתים ב-500 μL של מדולל anti-CD16/CD32, ולאחר מכן להוסיף 500 μL של שילוב מאסטר 2x המכיל 10 μL של biotinylated Ter119, Gr-1, CD23, ולאחר מכן 1.1, ו 25 μL של biotinylated Table 1F4/80 נוגדנים כדי להשיג את הוסף תמהיל בסיס של 2x לתאים והכתם עבור 20 דקות ב-4 ° c.
- לשטוף את התאים עם 5 מ ל של מאגר השיטת וצנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו-supernatant.
- השהה מחדש את התאים האנטי-ביוטין (טבלת חומרים) מדולל במאגר הזמן לפי הריכוז והפרוטוקול המומלצים על ידי היצרן.
- לשטוף עם 5 מ ל של מאגר שיטת וצנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לאחר מכן השעיית מחדש עד 1 x 108 תאים ב 500 μl של שיטת האגירה.
- ראשי עמודות בחירה מגנטית (טבלת חומרים) עם 3 מ ל של מאגר השיטת. העבר תאים על עמודות בחירה מגנטי ולאסוף את המושלג המכיל מועשר B-1 תאים בצינור 15 מ ל חרוט על קרח. שטוף את עמודת הבחירה המגנטית עם מאגר שינויים נוסף עד שנפח האחסון הכולל שנאסף הוא 10 mL.
הערה: סדרת מחלקים של שברים מטוהרים מראש ושלאחר מטוהרים צריך להיות מנותח בנפרד על-ידי cy, לנסות לייעל את יעילות הטיהור על ידי צביעת עבור CD19 + B תאים, F480 + מקרופאגים, ו CD5 + T תאים כפי שמוצג באיור 2. - לספור את השבר התא לאחר מטוהרים (the מכיל מועשר B-1 תאים) על ידי ספירת תאים חיים כמו בשלב 1.6, והשעיית מחדש ב-1 x 106 תאים/mL בתוך התרבות B תא בינונית (RPMI-1640, 10% מופעל חום סרום העוברי העובר [fbs], 10 מ"מ hepes, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM נתרן פירובט, 50 μg/mL gentamicin, 55 μm β-mercaptoethanol).
2. גירוי תא פריפריאלי 1
- פצל תאים במאגר עבור שני מצבי התמרה (Ctl-GFP ו-CXCR4-GFP), תוך הגדרה הצידה וציפוי לפחות 10 x 106 תאים עבור שליטה ללא התמרה.
- צלחת עד 150 μL (150,000 תאים) לתוך 96-היטב לוחיות הקצה התחתון.
- הוסף 100 ננומטר TLR9 אגוניסט ODN1668 לכל הבארות כדי לעורר את התפשטות התא.
- מודט עבור 16/18 h ב 37 ° צ', 5% CO2.
3. התמרה ויראלית של תאי הצפק B
- צור Ctl-GFP (MigR1) ו-CXCR4-GFP חלקיקים ויראלי באמצעות התרגום סידן פוספט כמתואר בפרוטוקולים שפורסמו בעבר14.
הערה: זה ייקח מספר ימים, כדי להכין מניות retroviral יעיל ולאחסן את המניות ב-80 ° צ' לפני תחילת פרוטוקול זה. - . להפשיר רטרו וירוס על קרח השתמש מיד ולא להקפיא מחדש כמו סיכוייו וירוס מפחיתה באופן משמעותי במהלך הקפאת ההפשרה מחזורים. הוספת Ctl-GFP או CXCR4-GFP retroviral יעיל ב-20:1 ריבוי של זיהום (מוי) לתאים, בנוכחות של 8 μg/mL polybrene טריים β-mercaptoethanol ב 55 μM ריכוז סופי. אל תוסיף מניות ויראליות לתאים שנקבעו בצד לפקד שאינו מיועד לתאי התמרה.
- לבצע זיהום על ידי תפרידו צלחות ב 800 x g עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר.
- לוחיות הדגירה עם רטרו וירוס ב 37 ° צ', 5% CO2 עבור תוספת 3 h.
- הקציר ואת התאים הreplate בינונית תא B טרי ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 לילה.
4. תא מיון של תאים בצפק בנפח B-1a
- הבציר תאים מתורבתים ובריכה לתוך שלושה נפרדים 50 mL שפופרות חרוט עבור כל תנאי: לא מתתמרים, Ctl-GFP התמרה, ו-CXCR4-GFP.
- לספור תאים חיים כמו בשלב 1.6, אז צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו-supernatant.
- השהה מחדש תאים ב 100,000 תאים/μL במאגר מיון (PBS + 1% BSA) המכיל 1:50 anti-CD16/CD32 נוגדן (טבלת חומרים) כדי לחסום קולטני Fc. דגירה על הקרח 10 דקות ב 4 ° c.
- להתאים את התאים עבור פקדי פיצוי (~ 30,000 תאים לכל בקרת פיצוי): עבור בלתי מוכתם ושליטה אחת כתם בודד ממדגם ללא התמרה ועבור GFP יחיד בקרת הכתם מדגימות התמרה.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בחרוזי פיצוי מסחריים זמינים עבור פקדי כתמים בודדים אם מספר תא שאינו מקבל התמרה נמוך. - הכינו שילוב מאסטר של נוגדן 2x המכיל את הנוגדנים הצופפור בתוך מאגר מיון (שולחן 1). הוסף מיקס תבנית בסיס של 2x ללא התמרה, CTL-GFP, ו-CXCR4-GFP דגימות. הוסיפו נוגדנים בודדים. לפקדי כתם אחד דגירה של 20 דקות ב 4 ° c בחשיכה.
הערה: הראשי 2x מיקס חשבונות עבור נפח של נוזל התאים כבר כאשר מודגדירוג עם anti-CD16/CD32, כמו בשלב 1.8. מרחק של תאים מכל תנאי יכול בנפרד להיות מוכתם עבור CXCR4 כדי לאשר CXCR4 ביטוי יתר. - לשטוף דגימות עם 1 מ ל של מאגר מיון ולזן דרך מסנני 70 יקרומטר לתוך צינורות פוליפרופילן.
- צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ו-לאכול על ידי הסופר. השהה דגימות מחדש ב-50,000 תאים/μL במאגר מיון.
- לפני מיון התא להכין מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) אוסף צינורות המכילים 1 מ ל של אוסף בינוני (RPMI-1640, 20% חום-מופעל FBS, 10 מ"מ HEPES, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM נתרן פירובט, 50 μg/mL gentamicin, 55 μM β-mercaptoethanol) עבור כל אוכלוסייה להיות מיון.
- לפני הפעלת דגימות בסדרן התא להוסיף 2x DAPI (מוכן 1:5000 דילול במאגר מיון) עבור אפליה תא מת.
- מיון GFP + B-1a תאים לתוך צינורות FACS המכילים בינונית אוסף כמו DAPI- CD19+ gfp+ B220mid-lo CD23- IGM+ CD5+ תאים מתוך הדגימות CTL-gfp ו-CXCR4-gfp. השתמש במדגם שאינו התמרה כדי להגדיר את השער GFP + כדי למיין DAPI- CD19+ gfp- B220mid-lo CD23- igm+ CD5+ לא התמרה-B-1a תאים.
הערה: לחלופין, ניתן למיין תאים שאינם מתתמרים גם מדגימות CTL-GFP ו-CXCR4-GFP על-ידי בנפרד בתאי B-1a בתוך השבר GFP. התמרה או אי-התמרה תאים B-1b יכול להיות גם ממוין באמצעות אסטרטגיה זו מיון כמו DAPI- CD19+ gfp +/- B220mid-lo CD23- igm+ CD5 תאים.
5. העברה מאמצת
- לאחר מיון התא, בתאי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ומכה את supernatant בזהירות.
- השהה תאים מחדש בקור סטרילי 1x PBS ב 1,000 תאים/μL.
- לRag1 זכר-/- apoe- עכברים באמצעות isof, ולהזריק 100 μl (100,000 תאים) לכל עכבר באמצעות ורידי רטרו מסלולית או הזרקת הזנב באמצעות מזרק משובח במיוחד אינסולין. הכנס כמה עכברים באמצעות ה-PBS 1x כפקד.
6. קוונפיקציה של תאים תורמים ו פלזמה IgM
- בזמן הרצוי לאחר העברה המאמצת, לנתח תאים שהועברו בעכברים הנמען על ידי מח עצם והקציר רקמת הטחול4 ו cy, להזרים. מכמת לוקליזציה תא תורם ו CXCR4 overexpression יטוי על ידי כתמים עבור תקליטור 45.1, תקליטור 45.2, ו CXCR4 ולנתח את התוצאות של cy try באמצעות תוכנה כגון Flowjo.
הערה: עיין בטבלה 1 עבור נוגדנים הנמצאים בשימוש בשלב זה. ודא שלא להשתמש המשלים נוגדן כי זוהר בערוץ fitc כמו gfp יהיה נוכח בתאי תורם התמרה. - בידוד פלזמה על ידי הוספת 10 μL של 0.5 M EDTA כדי דם שלם שנאסף באמצעות ניקוב לב בזמן הקרבת בעלי חיים. צנטריפוגה דם שלם ב 7,000 x g ו סדרת מחלקים פלזמה לתוך שונים 1.5 mL צנטריפוגה צינורות. חנות at-80 ° צ' עד ביצוע ניתוח של גורמים המופרשים כגון IgM על ידי אליסה4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבט כולל על הפרוטוקול מוענק באיור 1. איור 2 מציג העשרת תאים בעלי הצפק B-1a לאחר דלדול מגנטי של סוגים אחרים של תאי הצפק. לחיות סינגתן תאים בשבר פוסט-דלדול יש שיעור גדול יותר שלCD19 + B תאים לעומת F4/80 מקרופאגים, חסרים CD5hi CD19- T תאים, ולהכיל תדירות מוגברת של CD19+ CD5באמצע B-1a תאים לעומת השבר טרום מחסור. איור 3 מציג את הדרישה של הפעלת תא b עבור התמרה מוצלחת של תאים b ויראלי, ועלייה במינון תלוי בתדירות של התמרה בהצלחה של מערכות המשנה של התא gfp + B עם הגדלת וירוס משרד החינוך משתמש ב-CTL-gfp רטרווירוס. טבלה 2 מציגה יעילות התמרה מוגברת באמצעות 96 לוחות מסביב לתחתית לעומת 24-היטב או 6-צלחות לוחות. איור 4 מציג CXCR4 ביטוי יתר מוצלח (> 40%) בתאים B-1 והגדילה הגירה תא B-1 לכיוון CXCL12 בתוך מבחנה לאחר התמרה עם CXCR4-GFP רטרווירוס, ללא השפעה משמעותית על הכדאיות תא B. איור 5 מציג את האסטרטגיה לצורך מיון בשידור חי, סינגתן, CD19 + CD23-IGM + CD5 + B-1a תאים ממצב של אי התמרה (gfp-), או שני מצבי התמרה (gfp +). שים לב כי CD23 + B-2 תאים אינם נמצאים בדגימות אלה עקב דלדול מגנטי מראש. התמרה בשידור חי, סינגלו, CD19 + CD23-IgM + CD5-B-1b ניתן גם למיין באמצעות אסטרטגיה זו לדון. איור 6 מציג הועבר cd 45.1 + תאים תורמים ומתמשכת CXCR4 overexpression על התאים התורמים התאושש מח עצם הטחול של תקליטור 45.2 עכברים הנמען 17 שבועות לאחר העברת התאים. טבלה 3 מציגה שיוך חיובי בין CXCR4 ביטוי ללוקליזציה של תא תורם לשד העצם, אבל לא טחול. טבלה 4 מציגה שיוך חיובי בין מספר התא התורם למוח העצם וכמות הפלזמה של אנטי-מד-א-LDL igm.
איור 1: סכמטית של תכנון ניסיוני להתמרה והעברה המאמצת. תאי הצפק מבודדים מעכברי CD 45.1 allotype מועשרים עבור תאים B-1 באמצעות דלדול מגנטי באמצעות נוגדנים biotinylated ומיקרוחרוזים נגד biotin. תאים מועשר הצפק B-1 מופעלים כדי לעורר התפשטות התא עם ה-CpG TLR9 אגוניסט oligodeoxynucleotide. תאים מופעלים מתתמרים בחלקיקי Ctl-GFP או CXCR4-GFP. בהצלחה התמרה GFP + B-1a תאים ממוינים באמצעות FACS והועבר באופן מאומצים לתוך העכבר 45.2 allotype מארח העכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העשרה לתאים פריפריאלית ב -1. תזרים מייצג cy, לנסות חלקות של תאים הצפק טרום מגנטית העשרה (למעלה) ופוסט מגנטי העשרה (למטה) עבור CD19 + B תאים. CD19 + F4/80-תאים הם תאים B, CD19-F4/80 + תאים הם מקרופאגים, CD19 + CD5באמצע תאים הם B-1a תאים, ו CD19-CD5 תאיםHi הם תאי T. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התמרה רטרונגיזציה מחייבת הפעלת תא B. תאי הצפק B התעברו התמרה עם וירוס Ctl-gfp ב 5:1, 10:1, או 25:1 משרד החוץ או שמאל ללא התמרה בנוכחות או היעדרות של ה-CpG TLR9 אגוניסט ODN1668. התדירות של התמרה בהצלחה של GFP + B2, B1, B-1a, או B-1a תאים היה כימות על ידי הזרמת cy, לנסות 18 h לאחר התמרה. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אישור של CXCR4 ביטוי יתר והגדלת ב-1a הגירה מבחנה. תאי הצפק B מ-ApoE- עכברים עם B מחסור ספציפי לתא של CXCR4 היו מבודדים והתעברו התמרה באמצעות הרטרווירוס CTL-GFP או CXCR4-gfp, או מתורבת ללא התמרה. (א) מתווה זרימה מייצגים של ביטוי CXCR4 ו-GFP בתאים B-1 מחוסר התמרה (משמאל למעלה), התמרה-GFP (משמאל למטה), או CXCR4-GFP (הימניהתחתון) תנאים. FMO-CXCR4 (ימנית עליונה) משמש לקביעת שער CXCR4 חיובי. (ב) קוונפיקציה של MFI של CXCR4 על gfp + b-1 תאים מתוך התמרה (n = 1), CTL-gfp (n = 2), או CXCR4-gfp התמרה (n = 2) תנאים. (ג) תדירות של אי-התמרה (n = 1), CTL-gfp (n = 2), או CXCR4-gfp (n = 2) תאים-1 שהועברו לכיוון CXCL12 כאחוז של המספר הכולל של תאים b-1 שנטענו בטרנסובאר. (ד) נציג האסטרטגיה עבור כימות התאים הקיימא בתוך האוכלוסייה תא B התמרה בהצלחה (CD19 + gfp +). (ה) תדירות של תאי B חיים לאחר התמרה עם CTL-gfp (n = 2) או CXCR4-gfp רטרווירוס (n = 2). קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± SEM. דמות זו שונתה מהפרסום הקודם שלנו4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: לעבור על האסטרטגיה למיון התמרה בתאי התאים GFP + B-1a. תזרים מייצג cy, לנסות מגרשים למיון GFP + או GFP-B-1a תאים ממדגם לא התמרה (למעלה), מדגם Ctl-GFP התמרה (באמצע), ו מדגם CXCR4-GFP (למטה). B-1 תאים המוגדרים כשידור חי, מCD19 + CD23-IgM + CD5 + תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: קוונפיקציה של תאים תורמים שהועברו. זרם מייצגים cy, מגרשים הצגת CD 45.1 + CD 45.2-התורמים תאים מפקד PBS אחד (למעלה), אחד Ctl-GFP + B-1a תא הנמען (באמצע), ואחד CXCR4-GFP + B-1a תא הנמען (למטה),וניתוח הבאים של CXCR4 ביטוי על תאי התורם במח העצם ( הכמת של ביטוי CXCR4 (מתכוון עוצמה פלואורסצנטית, MFI) על תאים תורמים מח עצם (c) או טחול (ד). הכמת של מספר תאי התורמים שנמצאו במח העצם (e) או הטחול (f) של הנמענים. * P < 0.05 או * * P < 0.01 על ידי מבחן מאן-ויטני. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± SEM. דמות זו שונתה מהפרסום הקודם שלנו4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שלב הפרוטוקול | נוגדן | ריכוז סופי |
| שלב 1.8 | Ter119 ביוטין | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח |
| CD3e ביוטין | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| Gr-1 ביוטין | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| CD23 ביוטין | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| NK 1.1 ביוטין | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| F4/80 ביוטין | 2.5 μL לכל 100 μL סופי של נפח | |
| נוגדן | ריכוז סופי | |
| שלב 4.5 | CD5 PE | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח |
| IgM PECF594 | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| CD23 PECy7 | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| B220 נגמ ש | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| CD19 APCef780 | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| נוגדן | ריכוז סופי | |
| שלב 6.1 | תקליטור 45.1 PerCP Cy 5.5 | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח |
| CD 45.2 BV421 | 1 μL לכל 100 μL סופי לנפח | |
| CXCR4 נגמ ש | 2.5 μL לכל 100 μL סופי של נפח |
שולחן 1: נוגדנים והריכוזים הסופיים שלהם בשימוש בפרוטוקול.
| מצב | % GFP + סך של אוכלוסיה | % GFP + CD19 + B |
| 96-הלוח העגול והתחתון | 30.9% | 52.7% |
| הצלחת 24-באר | 8.4% | 21.2% |
| צלחת 6-באר | 16.2% | 27.3% |
שולחן 2: אופטימיזציה לצלחת. תדירות של התמרה מוצלחת של תאים GFP בהצלחה או GFP + CD19 + B תאים לאחר התמרה של 6 x 106 מועשר הצפק B-1 תאים בלוח 96-באר עגול-תחתון (40 בארות ב 150,000 תאים לכל טוב), צלחת 24-באר (6 בארות בגובה 1 x 106 תאים לכל באר), או צלחת 6-הבאר (3 בארות ב 2 x 106 תאים לכל טוב) ב 20:1 מ א עם האנטי וירוס של Ctl-gfp.
| שתנה | MFI של CXCR4 בתאים B-1a של תורם | |
| ערך r | ערך פי | |
| של התורם ב-1a תאים במח העצם | 0.71 | * 0.014 הכול |
| בתאי התורם ב-1a בטחול | 0.43 | 0.18 |
שולחן 3: הקשר בין ביטוי CXCR4 בתאים תורמים ללוקליזציה של תא תורם. עוצמת האור הפלואורסצנטית הממוצע (MFI) של CXCR4 על התאים B-1a התורם בקורלציה עם מספר B-1a התורם תאים במח העצם או הטחול של Rag1-/- apoe- הנמען עכברים 17 שבועות לאחר העברה המאמצת. נתונים המוצגים כמקדם מתאם (r) ומשמעות סטטיסטית (p). טבלה זו שונתה מהפרסום הקודם שלנו4.
| שתנה | של תאי תורם במח העצם | |
| ערך r | ערך פי | |
| פלזמה אנטי-מד-LDL IgM | 0.67 | * 0.028 הכול |
| פלזמה E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| פלזמה 1, 3-דטרן IgM | 0.29 | 0.39 |
טבלה 4: שיוך בין לוקליזציה של תא תורם לבין כמות פלזמה של anti-OSE IgM. מספר התאים של B-1a התורם במח העצם של Rag1-/- apoe-/- עכברים הנמען 17 שבועות לאחר המאמץ העברה בקורלציה עם כמות במחזור של אנטי-מד א-LDL Igm, E06/T15 igm, או anti-1, 3-dextran igm. נתונים המוצגים כמקדם מתאם (r) ומשמעות סטטיסטית (p). טבלה זו שונתה מהפרסום הקודם שלנו4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המסופקת כאן מאפשרת יציבה ויעילה באופן יחסי B-1a משלוח גנטי התא, בהעברה המאמצת vivo, זיהוי ולוקליזציה של תאים מוזרק. תאים זוהו 17 שבועות העברה לאחר התאים ונשמר ביטוי CXCR4 גדל. וירוס בתיווך המסירה הניבה 30-40% יעילות התמרה של הראשונית murine B-1a תאים עם השפעה מינימלית על הכדאיות התא בידינו (איור 4e). זה בקנה אחד עם תוצאות ממחקר קודם על ידי Moghimi ועמיתים אשר בהשוואה טכניקות עבור גנים להעביר לתאי murine הראשי כולל זיהום רטרונגיפי, זיהום ויראלי, נוקלאופלוט, או lipofectamine15. עם זאת, מצאנו כי מגוון של CXCR4 overexpression מגוונים באופן משמעותי בתוך הנמענים מקבל CXCR4-GFP התמרה B-1a תאים (איור 6ג, ד). לכן, אנו משתמשים בניתוח אסוציאטיבית כדי להדגים כי גדל ביטוי CXCR4 בקורלציה עם הגירה B-1a מוגברת ולוקליזציה לשד העצם, אשר משויך IgM פלזמה מוגברת (שולחן 3 ושולחן 4).
מגבלות שיטה זו כוללות את המספר הגדול של עכברים הדרושים לקבלת מספר מספיק של תאים בהצלחה של B-1a, והשונות ביעילות התמרה מניסוי אחד למשנהו. התמרה יעילות משופרת על ידי מגדל גבוה יותר של מניות נגיפי, אשר צריך להיות לפחות 2 x 107 חלקיקים זיהומיות/mL14. השימוש בעכברים מבוגרים יותר, בגילאי 12 עד 16 שבועות יכול גם לשפר את תפוקת התאים הצפק ב -1, כאשר מספרי התאים הפריפריאלית ב -1 עולים עם גיל17.
חשוב גם לציין כי כמות IgM מופרש על ידי העברת התאים B-1a לאחר העברה המאמצת היה ~ 5 קיפול פחות מהסכום שמופרש על ידי תאים שאינם מתתמרים ב-1a לאחר העברת המאמצת לתוך אותו Rag1-/- apoe-/- דגם (נתונים לא מוצגים). זה יכול להיות בגלל הדרישה של B-1 תא הפעלה עם TLR9 אגוניסט לפני התמרה ויראלי (איור 3), אשר עשוי להגביל הפעלה משנית הפקה igm בתגובה OSE ב vivo פוסט המאמצת העברה. לכן, עבור מחקרים הדורשים הפקה חזקה igm על ידי העברת b-1a תאים, העברת גנים חלופיים טכניקות שאינן דורשות לפני הפעלת תא b-1a18, כגון משלוחויראלי 18,19, עשוי להוכיח שימושי. לחילופין, שינויים בפרוטוקול זה המערבות אסטרטגיות הפעלה כדי לגרום להפצה אך לא ב-1a בידול לתוך תאים IgM-הפרשה עשוי גם להיות מספיק עבור התמרה מוצלחת ויראלית מבלי להשפיע על הפעלת התא B משני. IL-5 הוא הפצת תאים והישרדות מדיטוקין חשוב ב-1a, וייתכן שתהיה חלופה אפקטיבית לגירוי TLR920,21.
מחקרים קודמים יש להשתמש בתאי הטחול B מבודדים באמצעות אסטרטגיות בחירה חיובית או שלילית באמצעות נוגדנים נגד B220 (B סמן תא) או את 1.2 שלך (T מסמן תא)13,14. עם זאת, B220 + הטחול B תאים הם אוכלוסיה הטרוגנית המכילה B-1 ו-B-2 ערכות משנה של תאים. יתרה מזאת, תדירות התא B-1 בתוך הCD19 הכולל של אוכלוסיית התאים הכוללת את הטחול נמוכה (1 עד 2%). לעומת זאת, שיטה זו מנצלת את חלל הצפק כמקור תא B-1 לצורך התמרה, כאשר תאי B-1 מהווים 60 ל-70% מהתאים הכולל CD19 + B בתא זה22, והוא משתמש בCD23 כסמן לצורך מכלה B-2 תאי הצפק. מיון הבא של בהצלחה התמרה של תאים B-1a בהתבסס על GFP, CD19, B220, CD23, IgM, ו CD5 ביטוי נוסף מאפשר העברה של סוג תא מוגדר יותר במפורש. האסטרטגיה מחסור מגנטי כדי להעשיר את התאים הצפק B-1 ביעילות לרוקן תאים T, ומופחתת F4/80 מקרופאג תדר הצפק על ידי ~ 50% בידינו (איור 2), למרות אופטימיזציה נוספת ופתרון בעיות של שלב זה קריטי יכול להגביר את היעילות התמרה. למשל, באמצעות ריכוז גבוה יותר של biotinylated F4/80 נוגדנים לדלדול מקרופאג טוב יותר עשוי להגדיל את B-1a תא התמרה יעילות, כפי שיהיה פחות "off-target" התמרה ויראלית של סוגי תאים אחרים. השימוש ב-96-הצלחות מעוגלות לאחר התמרה, במקום שטוח בתחתית 24-ובכן או 6-ובכן צלחות בנוסף השתפר במידה ניכרת יעילות התמרה (שולחן 2), למרות הגדלת הטיפול וזמן ליטוף.
בסך הכל, שיטה זו מספקת גישה שימושית של הוכחת קונספט לקביעה אם מסירה ממוקדת לתאי B-1a יכולה לשנות B-1a לוקליזציה של תא וייצור IgM תפקודית. יישומים עתידיים של טכניקה זו יכול לכלול לשעבר משלוח vivo של בנייה retroviral יעיל המיקוד על חלבונים אחרים, העברה המאמצת כדי לקבוע את השפעתו על התורם או תהליכים תא מארח ב vivo, כולל הישרדות התא, הגירה, התפשטות, או פונקציה. העברה המאמצת לתוך מארחים חיסוניים, במקום מארחים לימפוציטים לקויה, יהיה גם אפשרי עם טכניקה זו מאז תאי תורם (CD 45.1 + GFP +) ניתן לבדיל בין תאים מארחים (CD 45.2 + GFP-). פילוח של קולטני כימוקין אחרים באמצעות שיטה זו יכול עוד לתמוך ההשערה כי מיקוד B-1a הגירה תא לכיוון נישות מתירני של ייצור IgM גבוהה יכול להגביר ביעילות רמות של IgM מגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, פרויקט 3 של P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. מקנמרה), ו R01GM100776 (ט בנדר). A. Upadhye נתמך על ידי איגוד הלב האמריקני האגודה טרום דוקטורט 16PRE30300002 ו 5T32AI007496-20. אנו מודים לג'ואן לאנניגן, מייק סולגה, וקלוד ללעוס מאוניברסיטת וירג פלו ליבת הליבה על הסיוע הטכני המעולה שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
