Summary
여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.
Abstract
세포 기능이 세포 미세 환경의 틈새 특이적 요인에 의해 영향을 받므로 세포 국소화 및 이동을 해부하는 방법은 세포 기능에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. B-1a 세포는 건강과 질병 도중 발생하는 산화 특이적 에피토프에 대하여 보호천연 IgM 항체를 생성하는 마우스에 있는 유일한 B 세포 서브세트입니다. B-1a 세포 IgM 생산은 B-1a 세포 위치에 따라 다르며, 따라서 높은 항체 생산을 지지하는 틈새 시장까지 B-1a 국소화를 표적으로 하는 치료적 관점에서 유용하게 된다. 여기서 우리는 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 4(CXCR4)의 레트로바이러스 매개 과발현에 의해 골수로B-1a 세포 이동을 표적으로 하는 방법을 설명한다. 1 차적인 murine B 세포에 있는 유전자 유도는 도전적일 수 있고 전형적으로 기술에 따라서 10-20%의 낮은 형혈 성 효율성을 산출합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 성 환전이 30-40% 형질전환 효율을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 기증자 B-1a 세포 이동 및 국소화가 가시화될 수 있도록 B 세포 결핍 수용자 마우스로 변환된 B-1a 세포의 입양 세포 전달을 이용합니다. 이 프로토콜은 다른 레트로바이러스 구성을 위해 변형될 수 있으며, 기증자 세포 또는 숙주 세포 표현형 및 기능의 분석, 또는 B-1a 세포 전달 후 분비된 수용성 인자의 분석을 포함하여 다양한 기능성 분석사에서 사용될 수 있다. CD45.1 및 CD45.2 동형및 레트로바이러스 플라스미드 내에 GFP 리포터의 존재에 의해 분화된 뚜렷한 공여자 및 수용인자 마우스의 사용은 또한 내인성 B 세포 집단을 포함하는 다른, 면역 이충분한 마우스 모델에서 공여자 세포의 검출을 가능하게 할 수 있었다.
Introduction
최근 연구는 상당한 면역 세포, 특히 B 세포, 특히 세포 국소화에 따라 자형질 및 기능적 이질성을입증했다1,2,,3,,4,5.5 B-1a 세포는 보호 IgM 항체를 생성하는 이기종 용량을 가진 하나의 그러한 집단; 골수 B-1a 세포는 IgM을 분비하고 혈장 IgM 타이터6에크게 기여하며, 복막 B-1a 세포는 항상성에서 낮은 수준의 IgM 분비를 가지며 대신 선천적 톨-유사 수용체(TLR) 또는 사이토카인 매개 신호를 통해7,8,9,활성화될 수 있으며, 70 , 70 , 70 , 70 ,70. B-1a 세포 IgM 항체는 병원균, 세포자멸 세포 및 산화된 LDL에 존재하는 산화 특이적 에피토프(OSE)를 인식하고, OSE에 결합하는 IgM은 죽상동맥경화증 과 같은 질병에서 염증성 하류 신호를 방지할 수 있다11. 따라서, 골수와 같은 부위로의 후막 B-1a 세포 이동을 증가시켜 IgM 생산을 증가시키는 전략이 치료적으로 유용할 수 있다. 그러나, 이러한 전략에 대 한 중요 한 대상 및 세포 유형 특정, 오프 타겟 효과 면역 기능 또는 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
여기서 우리는 1차 뮤린 B-1a 세포에서 CXCR4의 표적화 및 장기 과발현에 대한 방법을 설명하고 세포 이동 및 기능적 IgM 항체 생산을 시각화하기 위한 후속 입양 전달을설명한다(도 1). 1 차적인 B 세포의 유전 조작은 형질전환된 세포주의 형질전환에 비해 낮은 형광 효율성에 의해 제한됩니다. 그러나, 형질전환된 세포주들이1차 세포(12,,13)로부터현저하게 이탈할 수 있기 때문에, 1차 세포의 사용은 정상 생리학에 보다 밀접하게 부합하는 결과를 제공할 가능성이 높다. 몇몇 기술은 레트로바이러스 전달, 아데노바이러스 전달, 지방흡입, 또는 세포 건강에 미치는 영향의 다양한 수준을 가지는 전기천공 기반 형질감염을 포함하는 1차 뮤린 B 세포에서유전자 전달을 위해 기술되었다13,,14,,15. 다음 방법은 레트로바이러스 전달을 활용하여 세포 생존율에 최소한의 영향을 미치면서 >30%의 적절한 유전자 전달 효율을 산출하였다. 앞서 설명한 레트로바이러스 를 사용하여 생성된 CXCR4-뮤린 줄기세포 바이러스-내부 리보솜 진입 부위-녹색 형광 단백질(MSCV-IRES-GFP; MigR1)16,마우스 CXCR4 유전자가 서브클로론된 4. MigR1(대조군(Ctl)-GFP) 및 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자는 이전에 발표된 프로토콜4,,14에기재된 바와 같이 칼슘 인산염 형질감염을 사용하여 생성되었다.
성공적으로 변환된 B-1a 세포를 정맥내 림프구 결핍Rag1-/- 마우스로 옮겼다. 기증자 및 수용자 마우스 는 또한 아포리포프로테인 E (ApoE) 유전자의 녹아웃을 포함, 이는 증가 OSE 축적 및 동맥 경화증의 결과, 따라서 생체 내 B-1 세포 활성화 및 IgM 생산을위한 모델을 제공. 더욱이, 기증자 및 수용자 마우스는 CD45 동형에서 달랐다; 공여자 B-1 세포는 CD45.1+ApoE-/- 마우스로부터 왔고Rag1-/- CD45.2+ApoE-/- 수용자로 옮겨졌다. 이는 유세포분석 동안 B 세포 마커에 대한 추가적인 얼룩을 가할 필요 없이 수용자 CD45.2 B 세포로부터 의 기증자 CD45.1의 분화를 허용했다. 여기에 제공된 결과는 B-1a 세포에 대한 표적 CXCR4 과발현이 B-1a 세포의 증가된 능력과 연관되어 골수로 이동하는 것을 보여 주며, 이는 증가된 혈장 항 OSE IgM과 연관되어 있다. 우리는 또한 부정적인 선택을 통해 후막 B-1 세포의 농축을위한 방법을 제공하고 효율적인 전달을위한 B-1 세포 활성화의 요구 사항을 입증합니다. 이 방법은 B-1a 세포 이동, 표현형 또는 기능에 대한 단백질 과발현의 효과를 연구하기 위해 다른 레트로바이러스 구조에 적응될 수 있다. 더욱이, CD45.1 대 CD45.2 동형 구별의 사용은 이론적으로 내인성 B 세포를 포함하는 그밖 면역 충분한 뮤린 모형으로 전송을 허용할 수 있었습니다.
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Protocol
모든 동물 프로토콜은 버지니아 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 자성 분리 및 각막 B-1 세포의 농축
- CO2를사용하여 12-14 주 된, 남성, CD45.1+ApoE-/- 마우스를 안락사 .
- 직선 수술 가위를 사용하여 복부에 피상적 인 컷을 확인하고 복막 벽을 노출 곡선 가위를 사용하여 다시 피부를 껍질. 10 mL 주사기 및 25 G 바늘을 사용하여 37 °C RPMI-1640 배지의 10 mL로 복강을 플러시합니다. 꼬리를 잡고 15-20s에 대한 철저하게 옆으로 마우스를 이동하여 세포를 분리하기 위해 마우스를 흔들어.
참고: 용암된 맥티노름을 마사지하면 세포 회복을 극대화할 수 있습니다. - 10 mL 주사기와 25 G 바늘을 사용하여 후막 유체를 수집하여 내장 근처의 엉덩이 수준 바로 위의 후막 의 오른쪽 하단에 유체를 끌어 서. 상피 지방 창고와 기본 장기를 방해하지 마십시오. 오멘탈 지방이 주사기에 쉽게 유입될 수 있기 때문에 마우스의 왼쪽에서 액체를 그리지 마십시오.
- 6~7mL의 유체가 수집되면 얼음 위에 놓인 50 mL 원엽 튜브로 분배합니다. 다음으로, 포인을 사용하여 격막 위의 복막 벽을 잡고 마우스를 수직으로 들어 올리면 남은 유체가 복강의 바닥에 남아 있게 됩니다. 간 위의 수술 가위를 사용하여 각막 벽에 작은 컷을 만들고 (간을 절단하지 않도록하십시오) 유리 파이프와 전구를 사용하여 남아있는 각액을 수집하십시오.
- 모든 CD45.1+ApoE-/- 마우스(n = 15−20)에서 50 mL 원뿔형 튜브로 풀 퍼미토네워시 아웃 세포를 넣고 얼음 위에 보관합니다.
참고 : 필요한 마우스의 수를 계산하기 위해 : B-1a 세포는 전체 복막 인구의 5-10 %를5 구성하고 저자의 손에 마우스 당 약 2.5-5 x 10 B-1a 세포를 산출한다. 전율 효율은 아래와 같이 ~ 30-40%입니다. - 트라이판 블루 및 혈세포계와 같은 생존 용염료를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다 (트리판 블루에서 샘플을 1:5로 희석하고 10 μL을 혈세포계 챔버에 로드). 튜브 당 최대 1 x 108 셀에서 풀 셀. 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리세포를 흡인한 다음 흡인한다.
- 안티 CD16/CD32항체(재료표)의1mL에 최대 1 x 108세포를 재중단하여 1:50을 분석 버퍼(1x 인산완충식염수[PBS], 0.5% 소 혈청 알부민[BSA], 2 mMEDTA)로 희석하여 수용체를 차단하였다. 셀 수에 따라 필요에 따라 배율을 조정합니다. 4 °C에서 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.
- 고갈을 위한 분석 완충액에서 생체티니티화된항체(표 1)의2x 마스터 믹스를 준비한다. 2x 마스터 믹스는 안티 CD16/CD32로 인큐베이팅할 때 세포가 이미 있는 액체의 부피를 차지합니다. 예를 들어, 세포가 희석된 항 CD16/CD32의 500 μL에서 인큐베이팅하는 경우, 생물질화된 Ter119, Gr-1, CD23 및 NK1.1 항체의 10 μL을 포함하는 2x 마스터 믹스의 500 μL을 추가하고, Table 125 μL의 생체측F4/80 항체를 최종 농도를 달성한다. 세포에 2x 마스터 믹스를 넣고 4°C에서 20분 동안 얼룩을 제거합니다.
- 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 5 mL의 분석 완충제 및 원심분리기를 5 mL로 세척하고 흡인상피제를 흡입한다.
- 제조업체가 권장하는 농도 및 프로토콜에 따라 분석 버퍼로 희석된 항바이오틴 마이크로비드(Tableof Materials)로세포를 재중단 및 배양한다.
- 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 5 mL의 분석 버퍼와 원심분리기를 세척합니다. 흡위제 및 분석 버퍼의 500 μL에서 최대 1 x 108 세포를 재중단한다.
- 분석 버퍼의 3 mL와 주요 자기 선택 열(재료의 표). 프라이밍 된 자기 선택 컬럼에 세포를 전달하고 얼음에 15 mL 원엽 튜브에서 농축 된 B-1 세포를 포함하는 용리액을 수집합니다. 수집된 전체 부피가 10 mL가 될 때까지 추가분석 버퍼로 자기 선택 컬럼을 세척한다.
참고: 사전 정제 및 후 정제 된 세포 분획의 aliquot는 그림 2에도시 된 바와 같이 CD19+ B 세포, F480+ 대식세포 및 CD5+ T 세포에 대한 염색에 의해 정제 효율을 위한 유세포측정에 의해 별도로 분석되어야 한다. - 1.6단계에서와 같이 살아있는 세포를 계수하여 정제 후 세포 분획(농축된 B-1 세포를 함유하는 용리액)을 카운트하고, B 세포 배양 배지에서 1 x 106 세포 / mL에서 다시 중단 (RPMI-1640, 10 % 열 불활성화 태아 소 혈청 [FBS], 10 mM HEPES, 1x 비 필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루바테, 50 μg / mL 젠타미신, 55 μM-β 메르카포에탄.
2. 복막 B-1 세포 자극
- 두 개의 트랜스듀싱 된 조건 (Ctl-GFP 및 CXCR4-GFP)에 대한 분할 풀화 된 세포를 따로 설정하고 비 변환 된 제어를 위해 적어도 10 x 106 셀을 도금합니다.
- 96 웰 라운드 바닥 플레이트에 잘 당 150 μL (150,000 셀)까지 플레이트.
- 세포 증식을 자극하기 위해 모든 우물에 100 nM TLR9 작용제 ODN1668을 추가합니다.
- 37 °C에서 16-18 시간 동안 배양, 5 %CO2.
3. 복막 B 세포의 레트로 바이러스 성 전환
- 이전에 발표된 프로토콜14에기재된 바와 같이 칼슘 인산염 형혈을 이용한 Ctl-GFP(MigR1) 및 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자를 생성한다.
참고 : 이것은 며칠이 걸릴 것이므로이 프로토콜을 시작하기 전에 -80 °C에서 aliquots를 준비하고 역류하여 저장하십시오. - 얼음에 레트로 바이러스 주식을 해동. 즉시 사용하고 동결 해동 주기 동안 바이러스 적재자가 크게 감소함에 따라 다시 동결하지 마십시오. Ctl-GFP 또는 CXCR4-GFP 레트로바이러스 초월제를 세포에 감염(MOI)의 복합성(MOI)으로 추가하여, 55μM 최종 농도에서 8 μg/mL 폴리브레인 및 신선한 β-메르카포에탄올이 존재합니다. 비변환 된 제어를 위해 따로 설정 된 세포에 바이러스 성 주식을 추가하지 마십시오.
- 실온에서 90 분 동안 800 x g에서 원심 분리 플레이트로 스프 감염을 수행하십시오.
- 37°C에서 레트로바이러스가 있는 플레이트를 배양하고, 5%CO2를 추가로 3시간 동안 배양한다.
- 신선한 B 세포 배지에서 세포를 수확하고 재플레이트하고 37°C, 5%CO2에서 밤새 배양한다.
4. 트랜스듀싱 된 각막 B-1a 세포의 세포 분류
- 배양된 세포를 수확하고 각 조건에 대해 3개의 분리된 50 mL 원추형 튜브로 풀: 비형화, Ctl-GFP 변환, 및 CXCR4-GFP 변환.
- 1.6단계에서와 같이 살아있는 세포를 카운트한 다음, 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기를 하고 흡인상상체를 흡인한다.
- Fc 수용체를 차단하기 위해 1:50 항 CD16/CD32항체(재료표)를함유하는 100,000개의 세포/μL을 정렬 버퍼(PBS + 1% BSA)에서 재중단한다. 4 °C에서 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.
- 보상 제어를 위한 Aliquot 세포 (보상 대조군 당 ~ 30,000 셀): 비형질화 된 샘플에서 비 스테인드 및 단일 얼룩 제어 알리쿼트 및 변환 된 샘플에서 GFP 단일 얼룩 제어 aliquot.
참고: 비형질 세포 수가 낮은 경우 상업적으로 이용 가능한 보상 비드는 단일 얼룩 제어에 사용할 수 있습니다. - 플루오로포폴을 함유하는 2x 항체 마스터 믹스를 정렬 완충액으로준비한다(표 1). 비변환, CTL-GFP 변환 및 CXCR4-GFP 변환 샘플에 2x 마스터 믹스를 추가합니다. 단일 얼룩 컨트롤에 개별 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
참고 : 2x 마스터 믹스는 1.8 단계에서와 같이 안티 CD16 / CD32로 인큐베이팅 할 때 세포가 이미있는 액체의 양을 차지합니다. 각 조건에서 세포의 aliquot는 CXCR4과발현을 확인하기 위해 CXCR4에 대해 별도로 염색될 수 있다. - 1 mL의 버퍼로 샘플을 세척하고 70 μm 필터를 통해 폴리 프로필렌 튜브로 변형시.
- 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기를 흡인하여 흡인한다. 정렬 버퍼에서 50,000 셀/μL에서 샘플을 다시 일시 중단합니다.
- 세포 선별 에 앞서 표지형 형광 활성화 세포 선별(FACS) 수집 튜브1 mL을 함유하는 포집 배지(RPMI-1640) 20% 열 불활성화 FBS, 10 mM HEPES, 1x 비필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루브, 50 μg/mL 겐타미신, 55μM β-메르카포에탄올) 각 집단에 대해 분류되어야 한다.
- 셀 선별기에서 샘플을 실행하기 전에 죽은 셀 판별에 대해 2x DAPI(정렬 버퍼에서 1:5000 희석으로 제조)를 추가합니다.
- GFP+ B-1a 세포를 DAPI-CD19+ GFP- + B220미드로 CD23-CTL-GFP 및 CXCR4-GFP 샘플로부터의+ 세포- DAPI로서 수집 배지를 포함하는 FACS 튜브로 정렬한다.- + 비형 변환 샘플을 사용하여 GFP+ 게이트를 설정하고 DAPI-CD19+- GFP- B220미드로 CD23-IgM+ + CD5+ 비형 변환 된 B-1a 세포를 정렬합니다.- - +
참고: 대안적으로, 비형 전환 된 세포는 또한 GFP- 분획 내에서 B-1a 세포를 별도로 게이팅하여 CTL-GFP 및 CXCR4-GFP 샘플로부터 분류될 수 있다. 트랜스듀싱 또는 비-트랜스듀싱 된 B-1b 세포는 또한 DAPI-CD19 + GFP+/- B220미드로 CD23- IgM+ CD5- 세포로서 이 정렬 전략을 사용하여 정렬 될 수있다.
5. 입양 이전
- 세포 선별 후, 원심분리세포를 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 조심스럽게 흡인한다.
- 1,000 세포/μL에서 차가운 멸균 1x PBS에서 세포를 다시 중단하십시오.
- 이소플루란을 사용하여 수컷Rag1-/- ApoE-/- 마우스를 마취시키고 초미세 인슐린 주사기를 사용하여 정맥 내 레트로 궤도 또는 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스 당 100 μL (100,000 세포)를 주입합니다. 대조군으로 1x PBS를 가진 몇몇 마우스를 주입하십시오.
6. 공여자 세포 및 혈장 IgM의 정량화
- 원하는 시간 에서 입양 후 전송, 골수 및 비장 조직수확에 의해 수용자 마우스에서 전송 된 세포를 분석 4 및 유세포 분석. CD45.1, CD45.2 및 CXCR4에 대한 염색을 통해 공여체 세포 국소화 및 CXCR4 과발현을 정량화하고 Flowjo와 같은 소프트웨어를 사용하여 유세포 분석 결과를 분석합니다.
참고: 이 단계에서 사용되는 항체는 표 1을 참조하십시오. GFP가 형질전환 공여자 세포상에 존재할 때 FITC 채널에서 형광이 존재하는 항체 컨쥬게이트를 사용하지 않도록 한다. - 동물 희생 시 심장 천자를 통해 수집된 전혈에 0.5 M EDTA의 10 μL을 첨가하여 혈장을 분리하였다. 7,000 x g에서 전혈을 분리된 1.5 mL 원심분리관으로 분리하여 원심분리기. ELISA4에의한 IgM과 같은 분비 인자의 분석을 수행 할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
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Representative Results
프로토콜의 개요는 그림 1에있습니다. 그림 2는 다른 각막 세포 유형의 자기 고갈 후 후막 B-1a 세포의 농축을 표시합니다. 고갈 후 분획에서 살아있는 단일 세포는 F4/80+ 대식세포에 비해+ CD19+ B 세포의 더 큰 비율을 가지며, CD5hi CD19-T 세포가 결여되고, CD19+CD5 미드 B-1a 세포의 증가된 주파수를 함유하고 있다.- + 도 3은 성공적인 레트로바이러스 B 세포 전멸을 위한 B 세포 활성화의 요구 사항및 Ctl-GFP 레트로바이러스를 사용하여 바이러스 MOI가 증가함에 따라 성공적으로 트랜스듀싱된 GFP+ B 세포 서브세트의 빈도증가. 표 2는 24웰 또는 6웰 플레이트에 비해 96개의 잘 둥근 바닥 판을 사용하여 감전 효율을 높였습니다. 그림 4는 성공적인 CXCR4 과식(>40%)을 표시합니다. B-1 세포에 CXCR4-GFP 레트로바이러스로 환전 후 시험관내 CXCL12로 B-1 세포 이동을 증가시키고, B 세포 생존가능성에 큰 영향을 미치지 않고. 그림 5는 비변환 조건(GFP-) 또는 2개의 변환된 조건(GFP+)에서 라이브, 싱글, CD19+ CD23+ IGM+ CD5+ B-1a 셀의 정렬을 위한 게이팅 전략을 표시합니다. CD23+ B-2 세포는 이전 자기 고갈로 인해 이러한 샘플에 존재하지 않습니다. 변환된 라이브, 싱글, CD19+ CD23- IgM+ CD5-B-1b 셀은 또한 이 게이팅 전략을 사용하여 정렬될 수 있습니다. 도 6은 CD45.1+ 공여자 세포 및 CD45.2 수용자 마우스의 골수 및 비장으로부터 회수된 공여자 세포에 대한 지속적인 CXCR4 과발현을 17주 간 세포 이송 후 전달하였다. 표 3은 골수에 대한 CXCR4 발현 및 공여자 세포 국소화 사이의 양성 연관성을 표시하지만 비장은 아니다. 표 4는 골수에서 공여자 세포 수와 항-MDA-LDL IgM의 혈장 양 사이의 양성 연관성을 나타낸다.
그림 1: 레트로바이러스 전달 및 입양 전달을 위한 실험 설계의 회로도. CD45.1 동종 마우스로부터 분리된 회막 세포는 생체항체 및 항비오틴 마이크로비드를 사용하여 자기 고갈을 통해 B-1 세포를 풍부하게 한다. 농축된 후막 B-1 세포는 TLR9 주작동근 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드로 세포 증식을 자극하기 위해 활성화된다. 활성화된 세포는 Ctl-GFP 또는 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자로 변환됩니다. 성공적으로 변환된 GFP+ B-1a 세포는 FACS를 사용하여 분류되고 입양적으로 CD45.2 동종형 숙주 마우스로 전달된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 후막 B-1 세포에 대한 농축. CD19+ B 세포에 대한 전자기 농축(상단) 및 후자성 농축(아래)의 대표적인 유동 세포분석 플롯. CD19+ F4/80-세포는 B 세포, CD19-F4/80+ 세포는 대식세포이고, CD19+ CD5중간 세포는 B-1a 세포이고, CD19-CD5하이 세포는 T 세포이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 레트로바이러스 성 환전은 B 세포 활성화가 필요하다. 복막 B 세포는 Ctl-GFP 레트로바이러스를 5:1, 10:1, 또는 25:1 MOI로 변환하거나 TLR9 주작동제 CpG ODN1668의 존재 또는 부재 에서 비-트랜스듀렉시로 전환하였다. 성공적으로 트랜스듀렉된 GFP+ B2, B1, B-1a, 또는 B-1b 세포의 빈도는 유세포분석 18시간 후 트랜스덕션에 의해 정량화되었다. 오류 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다.
도 4: 체외에서 CXCR4 과발현 및 증가된 B-1a 이동의 확인. CXCR4의 B 세포 특이적 결핍을 가진ApoE-/- 마우스로부터복막 B 세포를 Ctl-GFP 또는 CXCR4-GFP 레트로바이러스로 분리하고, 또는 트랜스덕트 없이 배양하였다. (a)비형변환(왼쪽 위), Ctl-GFP 트랜스듀싱(왼쪽 아래), 또는 CXCR4-GFP 트랜스듀싱(오른쪽 아래) 조건에서 B-1 세포에 대한 CXCR4 및 GFP 발현의 대표적인 플로팅. CXCR4 포지티브 게이트를 설정하는 데 사용되는 FMO-CXCR4(오른쪽 위). (b)비트랜스듀싱(n=1), Ctl-GFP 트랜스듀싱(n=2) 또는 CXCR4-GFP 변환(n=2) 조건에서 GFP+ B-1 셀상에서 CXCR4의 MFI의 정량화. c)트랜스웰에 로드된 총 B-1 셀 수의 백분율로 CXCL12로 마이그레이션된 비트랜스듀싱(n=1), Ctl-GFP 트랜스듀싱(n=2) 또는 CXCR4-GFP 트랜스듀싱(n=2) B-1 셀의 빈도. (d)성공적으로 변환 된 B 세포 집단 (CD19 + GFP +) 내에서 생존 세포의 정량화를위한 대표적인 게이팅 전략. (e)Ctl-GFP (n = 2) 또는 CXCR4-GFP 레트로바이러스(n=2)로 환전 후 살아있는 B 세포의 빈도. 오류 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 이 그림은 이전 발행물4에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 변환된 GFP+ B-1a 세포를 분류하기 위한 게이팅 전략. 비형전환 샘플(상단), Ctl-GFP 트랜스듀싱 샘플(가운데), CXCR4-GFP 트랜스듀싱 샘플(아래)으로부터 GFP+ 또는 GFP-B-1a 세포를 선별하기 위한 대표적인 유세포 분석 플롯. B-1a 세포는 살아있는, 단일, CD19+ CD23- IgM+ CD5+ 세포로 정의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 이송된 공여체 세포의 정량화. 대표적인 유동 세포분석 플롯은 하나의 PBS 대조군으로부터 CD45.1+ CD45.2-공여체 세포를 표시하고, 1개의 Ctl-GFP+ B-1a 세포 수용자(중간), 및 1개의 CXCR4+B-1a 세포 수용자(아래), 및 골수(a) 또는 비장(spleen) 에서 공여체 세포에 대한 CXCR4 발현의 후속 분석.ab 골수(c)또는 비장(d)으로부터의공여자 세포에 대한 CXCR4 발현(평균 형광 강도, MFI)의 정량화. 수용인의골수(e)또는 비장(f)에서 회수된 공여자 세포의 수의 정량화.f * P < 0.05 또는 ** P < 0.01 에 의해 Mann-Whitney 테스트. 오류 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 이 그림은 이전 발행물4에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프로토콜 단계 | 항 체 | 최종 농도 |
| 1.8단계 | Ter119 비오틴 | 최종 부피 100μL당 1 μL |
| CD3e 비오틴 | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| Gr-1 비오틴 | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| CD23 비오틴 | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| NK1.1 비오틴 | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| F4/80 비오틴 | 최종 부피 100μL당 2.5 μL | |
| 항 체 | 최종 농도 | |
| 4.5단계 | CD5 PE | 최종 부피 100μL당 1 μL |
| 이그엠 PECF594 | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| CD23 PECy7 | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| B220 APC | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| CD19 APCef780 | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| 항 체 | 최종 농도 | |
| 6.1단계 | CD45.1 퍼CP Cy5.5 | 최종 부피 100μL당 1 μL |
| CD45.2 BV421 | 최종 부피 100μL당 1 μL | |
| CXCR4 APC | 최종 부피 100μL당 2.5 μL |
표 1: 프로토콜에 사용되는 항체 및 이들의 최종 농도.
| 조건 | 총 인구의 %GFP+ | CD19+ B 셀의 %GFP+ |
| 96웰 라운드 보텀 플레이트 | 30.9% | 52.7% |
| 24웰 플레이트 | 8.4% | 21.2% |
| 6웰 플레이트 | 16.2% | 27.3% |
표 2: 플레이트 최적화. 성공적으로 변환 총 GFP + 세포 또는 GFP + CD19+ B 세포의 전송 후 6 x 106 농축 복막 B-1 세포 중 하나에 96 잘 둥근 바닥 플레이트 (40 웰 에서 150,000 웰 당 0 세포), 24 웰 플레이트 (잘 당 1 x 106 셀에서 6 웰), 또는 6 웰 플레이트 (3 웰 2 x 10잘 당 6 세포) 에서 20:1 CTl-GFP 레트로 바이러스와 MOI.
| 변수 | 기증자 B-1a 세포에 CXCR4의 MFI | |
| r-값 | p 값 | |
| 골수에 있는 기증자 B-1a 세포의 # | 0.71 | *0.014 |
| 비장의 기증자 B-1a 세포의 # | 0.43 | 0.18 |
표 3: 공여자 세포에 대한 CXCR4 발현과 공여자 세포 국소화 사이의 연관성. 공여자 B-1a 세포에 대한 CXCR4의 평균 형광 강도(MFI)는래그1-/- ApoE-/- 수용인자 마우스의 골수 또는 비장의 공여자 B-1a 세포의 수와 상관관계가 있다 17주 후 입양 전적. 상관 계수(r) 및 통계적 유의성(p)으로 제시된 데이터. 이 테이블은 이전 발행물4에서수정되었습니다.
| 변수 | 골수에 있는 기증자 세포의 # | |
| r-값 | p 값 | |
| 플라즈마 안티 MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| 플라즈마 E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| 플라즈마 1,3-덱스렌 IgM | 0.29 | 0.39 |
표 4: 항 OSE IgM의 공여자 세포 국소화 및 혈장 양 사이의 연관성. Rag1의 골수에서 공여자 B-1a 세포의 수는17주 후 입양 후 전이항-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM, 또는 반대로 1,3-dextran IgM의 순환량과 상관관계가 있다.-/- 상관 계수(r) 및 통계적 유의성(p)으로 제시된 데이터. 이 테이블은 이전 발행물4에서수정되었습니다.
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Discussion
여기에 제공된 방법은 안정적이고 비교적 효율적인 1차 B-1a 세포 유전자 전달, 생체 내 입양 전달, 주입된 세포의 식별 및 국소화를 가능하게 한다. 세포는 세포 전이 후 17주 동안 검출될 수 있었고 증가된 CXCR4 발현을 유지하였다. 레트로바이러스 매개 전달은 우리의 손에 있는 세포 생존에 최소한의 충격으로 1 차 적인 murine B-1a 세포의 30-40% transduction 효율성을 산출했습니다(그림 4e). 이것은 retroviral 감염, 아데노 바이러스 감염, 핵 제거, 또는 lipofectamine15를포함하여 1 차적인 뮤린 B 세포로 유전자 전송을 위한 기술을 비교한 Moghimi와 동료에 의하여 이전 연구 결과에서 결과와 일치합니다. 그러나, 우리는 CXCR4 과발현의 범위가 CXCR4-GFP 변환 B-1a 세포를 수신하는 수신자 내에서 상당히 변화한다는 것을 것을을 발견했습니다(도 6c,d). 따라서, 우리는 증가된 CXCR4 발현이 증가된 혈장 IgM(표3 및 표 4)과연관된 골수로의 B-1a 이동 및 국소화 증가와 상관관계가 있음을 입증하기 위해 연관 분석을 활용하였다.
이 방법의 한계는 성공적으로 변환된 B-1a 세포의 충분한 수를 얻기 위하여 요구된 마우스의 다수, 및 한 실험에서 다른 에 transduction 효율성에 있는 가변성을 포함합니다. 감전 효율은 적어도 2 x 107 전염성 입자 / mL14이어야하는바이러스 성 주식의 높은 역가에 의해 향상됩니다. 12-16주령의 오래된 마우스의 사용은 또한17세에따라 후막 B-1 세포 수가 증가함에 따라, 후막 B-1 세포 수율을 향상시킬 수 있다.
또한 이식 후 B-1a 세포에 의해 분비되는 IgM의 양은 동일한Rag1-/- ApoE-/- 모델(데이터가 도시되지 않음)으로 채택 전달 후 비형 변환 된 B-1a 세포에 의해 분비된 양보다 ~ 5 배 적었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이는 레트로바이러스 전달 전에 TLR9 주작동근을 가진 B-1 세포 활성화의 요구 때문일 수있다(그림 3),이는 생체 내 입양 후 전송에서 OSE에 대한 응답으로 이차 활성화 및 IgM 생산을 제한할 수 있다. 따라서, 전사된 B-1a 세포에 의한 강력한 IgM 생산을 필요로 하는 연구의 경우, 렌티바이러스전달(18,,19)과같은 이전 B-1a 세포 활성화를 필요로 하지 않는 대체 유전자 전달 기술이 유용할 수 있다. 대안적으로, IgM 분비 세포로의 B-1a 분화를 유도하는 활성화 전략을 수반하는 이 프로토콜에 대한 수정은 또한 이차 B 세포 활성화에 영향을 미치지 않고 성공적인 레트로바이러스 성전환에 충분할 수 있다. IL-5는 B-1a 세포 증식 및 생존을 조절하는 중요한 사이토카인이며, TLR9자극(20,,21)에대한 효과적인 대안이 될 수 있다.
선행 연구는 B220(B 세포 마커) 또는 Thy1.2(T 세포 마커)13,,14에대하여 항체를 사용하여 양성 또는 음성 선택 전략을 통해 단리된 비장 B 세포를 이용하였다. 그러나, B220+ 비장 B 세포는 B-1 및 B-2 세포 서브세트를 포함하는 이기종 집단이다. 더욱이, 총 비장 CD19+ B 세포 집단 내의 B-1 세포 빈도는 낮다(1−2%). 대조적으로, 이 방법은 B-1 세포가 이 구획22에있는 총 CD19+ B 세포의 60-70%를 구성하고, 복막 B-2 세포를 고갈시키는 마커로 CD23를 사용하기 때문에, 감속을 위한 B-1 세포 근원으로 복강을 이용한다. GFP, CD19, B220, CD23, IgM 및 CD5 발현에 기초하여 성공적으로 변환된 B-1a 셀의 후속 선별은 보다 구체적으로 정의된 세포 유형의 전달을 더 가능하게 한다. 복막 B-1 세포를 풍부하게 하는 자기 고갈 전략은 효과적으로 T 세포를 고갈시키고, F4/80 복막 대식세포 빈도를 우리 손에서 ~50% 감소시켰습니다(그림2),이 중요한 단계의 추가 최적화 및 문제 해결은 형광 효율을 증가시킬 수 있습니다. 예를 들어, 더 나은 대식세포 고갈을 위해 생체연화된 F4/80 항체의 더 높은 농도를 사용하면 다른 세포 유형의 "오프 타겟" 레트로바이러스 환전이 적기 때문에 B-1a 세포 전환 효율이 더욱 높아질 수 있다. 대신 평평한 바닥 24 웰 또는 6 웰 플레이트의 트랜스덕션을위한 96 웰 라운드 바닥 플레이트의 사용은 또한 상당히 향상된 처리 효율(표 2),처리 및 파이펫팅 시간을 증가하지만.
전반적으로, 이 방법은 B-1a 세포에 표적유전자 전달이 B-1a 세포 국소화 및 기능IgM 생산을 변화시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위한 유용한 개념 증명 접근법을 제공한다. 이 기술의 미래 응용은 다른 단백질을 표적으로 하는 레트로바이러스 구성물의 생체 내 전달, 및 세포 생존, 이동, 증식 또는 기능을 포함하는 생체 내 공여자 또는 숙주 세포 과정에 미치는 영향을 결정하기 위한 입양 전달을 포함할 수 있다. 면역 적격 숙주로의 입양 전달은 림프구 결핍 숙주보다는, 기증자 세포 (CD45.1+ GFP +)가 숙주 세포 (CD45.2 + GFP-)에서 분화 될 수 있기 때문에이 기술로도 가능할 것입니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 chemokine 수용 체를 대상으로 더 높은 IgM 생산의 허용 틈새 시장을 향해 B-1a 세포 마이그레이션을 대상으로 효과적으로 보호 IgM의 수준을 높일 수 있다는 가설을 지원할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작업은 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL055798의 프로젝트 3, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) 및 R01GM100776 (T.P. 벤더)에 의해 지원되었습니다. A. 우파디는 미국 심장 협회 전 박사 펠로우십 16PRE30300002 및 5T32AI007496-20의 지원을 받았습니다. 우리는 그들의 우수한 기술 지원을 위한 버지니아 흐름 세포 분석 코어의 대학에서 조앤 라니건, 마이크 솔가, 클로드 츄에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
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