Summary
A fluorescência de imagens ao longo da vida monitora, quantifica e distingue as tendências de agregação de proteínas em modelos de doença susturais de C. elegans vivos, envelhecidos e estressados.
Abstract
Fibrilas amilóides estão associadas a uma série de doenças neurodegenerativas, como Huntington, Parkinson ou Doença de Alzheimer. Essas fibrilas amilóides podem sequestrar proteínas metastáveis endógenas, bem como componentes da rede de proteotase (PN) e, assim, exacerbar a proteína dobrável na célula. Há um número limitado de ferramentas disponíveis para avaliar o processo de agregação de proteínas amilóides dentro de um animal. Apresentamos um protocolo de microscopia vitalícia de fluorescência (FLIM) que permite o monitoramento, bem como a quantificação da fibrilização amiloide em células específicas, como neurônios, de forma não invasiva e com a progressão do envelhecimento e após perturbação de o PN. FLIM é independente dos níveis de expressão do flúor e permite uma análise do processo de agregação sem qualquer maior coloração ou branqueamento. Fluoróforos são extintos quando estão próximos de estruturas amilóides, o que resulta em uma diminuição da vida útil da fluorescência. A saciedade correlaciona-se diretamente com a agregação da proteína amilóide. FLIM é uma técnica versátil que pode ser aplicada para comparar o processo de fibrilização de diferentes proteínas amilóides, estímulos ambientais ou origens genéticas in vivo de forma não invasiva.
Introduction
A agregação proteica ocorre tanto no envelhecimento quanto na doença. Os caminhos que levam à formação e deposição de grandes amilóides ou inclusões amorfas são difíceis de seguir e seus cinéticos são igualmente desafiadores para desvendar. As proteínas podem se desdobrar devido a mutações intrínsecas dentro de suas sequências de codificação, como no caso de doenças genéticas. As proteínas também se desdobram porque a rede de proteota (PN) que as mantém solúveis e devidamente dobradas é prejudicada, como acontece durante o envelhecimento. A PN inclui acompanhantes moleculares e máquinas de degradação e é responsável pela biogênese, dobramento, tráfico e degradação de proteínas1.
C. elegans emergiu como um modelo para estudar o envelhecimento e a doença devido à sua curta vida útil, natureza isogênica e facilidade de manipulação genética. Várias cepas transgênicas C. elegans que expressam proteínas causadoras de doenças humanas em tecidos vulneráveis foram criadas. É importante ressaltar que muitas das cepas que contêm proteínas propensas à agregação recapitulam a marca registrada de distúrbios amilóides, a formação de grandes inclusões. Graças ao corpo transparente de C. elegans, esses agregados podem ser visualizados in vivo, não invasiva e não destrutivo2. Gerar qualquer proteína de interesse (POI) em fusão com um flúor permite investigar suas localizações, tráfico, rede de interação e destino geral.
Apresentamos um protocolo para monitorar a agregação de proteínas causadoras de doenças em vivos e envelhecimento s c. elegans via fluorescência de imagem ao longo da vida (FLIM). FLIM é uma técnica poderosa baseada na vida de um fluoróforo, em vez de seus espectros de emissão. A vida útil (tau, τ) é definida como o tempo médio exigido por um fóton para decair de seu estado animado de volta ao seu estado terrestre. A vida útil de uma determinada molécula é calculada com a técnica de domínio temporal da contagem de fótons únicos correlacionados com o tempo (TCSPC). No TCSPC-FLIM, a função de decaimento fluorescente é obtida por excitar o fluoróforo com pulsos laser curtos e de alta frequência e medir os tempos de chegada do fóton emitido a um detector em relação aos pulsos. Ao digitalizar uma amostra, um conjunto de dados tridimensional é criado para cada pixel: o array inclui informações sobre a distribuição dos fótons em suas coordenadas espaciais x,y e sua curva de decaimento temporal. Uma determinada amostra torna-se, portanto, um mapa de vidas revelando informações sobre a estrutura, a ligação e o ambiente da proteína3,4. Cada proteína fluorescente possui uma vida útil intrínseca e precisamente definida, geralmente de alguns nanossegundos (ns), dependendo de suas propriedades fisioquímicas. É importante ressaltar que a vida útil de um flofófono é independente de sua concentração, intensidade fluorescente e da metodologia de imagem. No entanto, dentro de um sistema biológico, pode ser afetado por fatores ambientais como pH, temperatura, concentrações de íons, saturação de oxigênio e seus parceiros de interação. As vidas também são sensíveis a mudanças estruturais internas e orientação. Fundir um florofófono a um POI resulta em uma mudança em sua vida útil e, consequentemente, informações sobre o comportamento da proteína fundida. Quando um fluoróforo é cercado ou encapsulado em um ambiente bem ligado, como as folhas beta antiparalelas de uma estrutura amilóide, ele perde energia não radiativamente, um processo conhecido como saciamento5. A saciedade do flúor resulta em um encurtamento de sua vida aparente. Quando solúvel, a vida útil de uma proteína permanecerá mais próxima de seu valor original e mais alto. Em contraste, quando uma proteína começa a se agregar, sua vida útil inevitavelmente mudará para um valor mais baixo6,7. Assim, torna-se possível monitorar a propensão de agregação de qualquer proteína formadora de amilóide em diferentes idades em c. elegansvivos .
Aqui descrevemos um protocolo para analisar a agregação de uma proteína de fusão que compreende diferentes trechos de poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 e Q85). Ilustramos como a técnica pode ser aplicada igualmente a diferentes fluoróforos, como proteína fluorescente de ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (FpS) e proteína fluorescente vermelha monórica (mRFP); e em todos os tecidos de C. elegans,incluindo os neurônios, músculos e o intestino. Além disso, no contexto da proteotase, a FLIM é uma ferramenta muito útil para observar mudanças no esgotamento das acompanhantes moleculares. Derrubar uma das principais acompanhantes moleculares, a proteína de choque térmico 1 (hsp-1), através da interferência do RNA produz o desdobramento prematuro das proteínas. O aumento da carga de agregação como resultado do envelhecimento, doença ou acompanhantes deficientes, é então medido como uma diminuição na vida útil da fluorescência.
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Protocol
1. Sincronização de C. elegans
- Sincronize C. elegans através do tratamento da solução de hipoclorito alcalino ou através de um simples ovo por 4 h a 20 °C8.
- Cultivar e manter nematóides a 20 °C em placas médias de crescimento de nematóides (NGM) semeadas com OP50 E. coli de acordo com os procedimentos padrão9. Idade dos nematóides até o estágio ou dia de desenvolvimento desejado.
NOTA: Neste protocolo, adultos jovens são imagem no dia 4 e nematóides velhos são imagem no 8º dia de vida.
2. R. RMS mediado por maquinaria de acompanhante através da alimentação
NOTA: Realize o knockdown da proteína de choque térmico 1 (hsp-1) acompanhante alimentando o vetor RNAi correspondente aos nematoies10. O plasmídeo hsp-1 RNAi foi obtido da biblioteca Ahringer (ID do clone: F26D10.3).
- Cresça o HT115 (DE3) E. coli expressando o plasmídeo hsp-1 RNAi por 6 h a noite no meio Luria Bertani (LB) contendo ampicillina de 50 μg/mL.
- Prepare placas de ágar NGM frescas contendo isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) e ampicillina (25 μg/mL) e sementes com a bactéria Hsp-1 RNAi. Deixe as placas secarem e induza em temperatura ambiente por 1-3 dias.
- Coloque ovos sincronizados em uma placa de siRNA e deixe chocar, ou coloque nematóides gravid e deixe colocar ovos por 4h a 20 °C antes de remover. Cresça os nematóides até a idade ou estágio desejado.
NOTA: A segunda geração de nematóides pode apresentar um fenótipo mais forte do knockdown. O protocolo siRNA e as condições aqui descritas são gerais e adaptados ao hsp1. A interferência de RNA via siRNA de um clone/gene específico precisa ser estabelecida e otimizada pelo usuário final. É importante notar que nem todos os siRNA têm a mesma eficiência e, portanto, recomenda-se testar a eficácia do knockdown por quantificação por recorrentação reversa quantitativa de reação em cadeia (RT-qPCR) ou mancha ocidental.
3. Preparação de slides de microscopia
- No dia da imagem, comece preparando os slides de imagem. Derreta aagarose em ddH2O a uma concentração de 3% (c/v) e deixe esfriar ligeiramente.
- Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL e tome cerca de 200 μL de agarose derretida. Pipa a agarose em um deslizamento de vidro limpo e imediatamente coloque um segundo em cima, evitando a formação de quaisquer bolhas. Deixe secar e retire suavemente a lâmina de vidro superior. O resultado é um deslizamento de vidro com uma superfície de agarose uniforme onde os nematoides serão posicionados.
NOTA: Cada slide será usado para visualizar entre 5-10 nematóides. Os slides podem ser preparados e armazenados por algumas horas em uma caixa humificada para evitar que a agarose seque.
4. Montagem de nematoides em slides de microscopia
NOTA: A FLIM exige que os nematóides sejam imobilizados. Realize esta etapa assim que a configuração de imagem (por exemplo, microscópios, lasers, detectores) estiver pronta para uso.
- Usando uma palheta de fio de platina, coloque nematóides da idade desejada em uma placa fresca não semeada e deixe-os rastejar para remover o excesso de bactérias OP50 de seus corpos.
- Prepare o composto anestésico (azida de sódio ou levamisole) para imobilizar o nematóide. Mantenha um estoque de 500 mM NaN3 no escuro a 4 °C e diluir em ddHfresco 2O para uma concentração final de 250 mM. Se utilizar levamisole, diluir um estoque de 20 mM para uma solução de trabalho de 2 mM em ddH2O.
ATENÇÃO: A zida de sódio (NaN3) é altamente tóxica. Use luvas e óculos de proteção e trabalhe sob um capô ventilado. - Trabalhando um microscópio estereomicroscópio, coloque uma gota de 10 μL de composto anestésico em uma almofada de agarose e transfira suavemente 5-10 nematóides para ele. Use uma ponta de cílios para separar os nematóides. Mantenha-os juntos, mas não tocando para permitir uma localização mais fácil dos nematoides durante a aquisição de imagens.
- Sobreponha cuidadosamente os nematóides com um deslizamento de cobertura. Faça medições dentro de 1 h após a montagem.
NOTA: Ambos os anestésicos acabarão por matar C. elegans. Os nematóides devem estar completamente imóveis durante a imagem, porque o mapa da vida é registrado a partir de cada pixel. Qualquer movimento dos parâmetros x,y impede a leitura da vida no mesmo pixel animado.
5. Aquisição de dados FLIM
NOTA: Neste protocolo, a vida útil do flúor é adquirida através do método TCSPC de domínio temporal. FLIM requer um pulso de luz para ser gerado pelo laser a uma taxa de repetição definida e constante. A taxa de repetição varia de acordo com o tipo de laser e precisa ser conhecida pelo usuário. As medições de vida são obtidas por detectores e equipamentos eletrônicos instalados ao lado de um microscópio convencional. Neste protocolo, as medições são realizadas em três microscópios confocais de varredura a laser diferentes com detectores e software fornecidos por duas empresas diferentes (Tabela de Materiais) para aquisição de vida smFP, CFP e YFP, respectivamente. Verifique se os filtros corretos de emissão/excitação estão no lugar e minimize qualquer fundo ou monitor de luz de fundo antes de iniciar. Antes de iniciar qualquer experimento, estabeleça a fotoestabilidade do flúor escolhido. Se o fluoróforo clarear em um curto espaço de tempo dentro dos tecidos nematoides, não é adequado para medidas FLIM em C. elegans.
- Abra o software de aquisição da FLIM. O software FLIM também permite o controle do microscópio confocal. Localize a guia/botão para permitir que as saídas do detector sejam ativadas e pressione Habilitar saídas.
- Adquira a função de resposta do instrumento (IRF), que descreve a precisão de tempo da configuração instrumental.
NOTA: Esta etapa deve ser realizada preferencialmente antes da montagem dos nematóides.- Se disponível, remova os filtros de excitação/emissão.
- Coloque um deslizamento de cobertura vazio acima do objetivo e encontre sua superfície. Registre o sinal de dispersão obtido a partir do deslizamento de cobertura para um mínimo de 30 s.
NOTA: Para vidas de vários nanossegundos, o software de aquisição pode estimar automaticamente o deslocamento do IRF. A aquisição de um IRF é sempre recomendada.
- Coloque o slide com os C. elegans montados no palco. Utilizando uma lente de ampliação de 10x no modo de transmissão e localize a posição dos nematóides no slide.
- Remova o slide, mude o objetivo para uma lente de ampliação de 63x e aplique o meio de imersão necessário (por exemplo, óleo). Substitua o slide no palco e localize os nematóides.
- Localize o Gerenciador pinhole no software de aquisição e abra-o ao Máximo. Comece a digitalizar a amostra, selecione uma região de interesse (por exemplo, cabeça, parte superior do corpo) e concentre-se em seu plano de projeção máxima.
- Monitore a taxa de pulso de laser e os outros três valores presentes na interface do software: O Discriminador de Fração Constante (CFD), o Tempo de Amplitude (TAC) e o Conversor Analógico-para-Digital (ADC).
NOTA: O laser deve ter um portão máximo de 1 x 108 contagens de fótons únicos. Este número representa o número máximo de fótons fornecidos pelo laser. O CFD fornece informações sobre o recebimento do pulso de fóton único em referência ao pulso de laser pelo detector. Este valor deve ser aproximadamente 1 x 105. O TAC discrimina entre o momento em que um fóton foi detectado e o próximo pulso de laser. Finalmente, a ADC converte a tensão TAC em um sinal de memória estorável11. O CFD, tac e ADC devem ter valores semelhantes para garantir que os fótons emitidos pelo flúor não sejam perdidos. A avaliação correta desses parâmetros garante que fótons suficientes estão sendo coletados para criar um mapa de vida preciso. - Na interface do software FLIM, visualize o número de fótons detectados: o valor de ADC deve ser entre 1 x 104 e 1 x 105. Se necessário, mude o foco em um plano diferente ou aumente a potência do laser para coletar mais fótons.
NOTA: Em geral, o número de fótons registrados por segundo não deve exceder 1% da taxa de repetição do laser. - Na barra de menu, selecione a guia para definir os parâmetros de aquisição. Selecione scansync in para permitir a detecção de fótons únicos.
- Defina a aquisição como um período fixo de tempo ou um número fixo de fótons. Por exemplo, adquira uma curva de decaida vitalícia por 2 min ou até que um único pixel atinja uma contagem de fótons de 2.000 eventos únicos. Pressione Comece a iniciar a aquisição.
NOTA: Diferentes fluoróforos exigirão diferentes lasers e filtros de excitação e emissão. De acordo com o brilho da amostra, a potência do laser também pode ser ajustada, o que não interferirá com a vida útil. Estes protocolos utilizam as seguintes configurações de excitação/emissão: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Um laser de dois fótons pulsado foi empregado para medições de PCP usando ex800/em440 nm. A quantidade de tempo e contagem de fótons necessários para a aquisição de um mapa FLIM precisará ser empiricamente estabelecida para cada configuração e cada finalidade experimental.
6. Análise de dados FLIM usando software FLIMfit
NOTA: Realize a análise de dados usando a ferramenta de software FLIMfit desenvolvida no Imperial College London12 (ver Figura 1).
- Abra o software e importe arquivos de dados FLIM via File | Carregar dados FLIM. Carregar todas as amostras de uma condição, mesmo que obtidas em sessões diferentes e de diferentes repetições biológicas.
- Se necessário, segmente um único nematóide de qualquer imagem FLIM via Segmentação | Gerente de Segmentação. Arraste a ferramenta de corte ao redor da área de interesse até que ela seja destacada. Uma vez concluído, pressione OK.
NOTA: A segmentação deve ser feita para todas as imagens. - Selecione uma pequena região onde a imagem baseada em intensidade de um C. elegans aparece(Figura 1, Setas 1). A curva de decaida dessa região aparecerá na grande janela de decomposição no lado direito da interface(Figura 1, Seta 2).
NOTA: A decomposição pode ser exibida linearmente ou logaritmo. - Defina os parâmetros corretos para extrapolar a vida útil através do algoritmo do software, conforme descrito nas etapas 6.5-6.8.
- Na guia Dados (Figura 1,Seta 3):
- Defina um valor mínimo integrado arbitrário para excluir quaisquer pixels que sejam muito fracos para produzir um bom ajuste. Dependendo da amostra c. elegans este valor varia de 40-300. Insira valores diferentes até que uma visualização satisfatória seja alcançada.
- Selecione um número De Min de Tempo e Um Máximo de Tempo para limitar o sinal FLIM a esses valores. Todos os eventos que aparecerem antes e depois deste limite serão excluídos.
NOTA: Por exemplo, para a análise do mRFP, foram excluídos os eventos anteriores a 800 cv e após 4.000 cv. Esses valores dependem da vida útil do fluoróforo e precisam ser determinados pelo usuário final. - Não altere a contagem predefinida/Fóton de 1.
- Insira a Taxa de Repetição,em MHz, do laser utilizado durante a aquisição.
NOTA: Para o protocolo atual, diferentes lasers foram utilizados com várias taxas de repetição. O laser de dois fótons utilizado para aquisição de vida de CFP possui uma taxa de repetição de 80 MHz, para YFP o laser se repete a 40 MHz, e para mRFP o valor é de 78,01 MHz. Esses valores foram inseridos no FLIMfit de acordo com a amostra analisada. - Insira um valor gate max para excluir todos os pixels saturados.
NOTA: Para medições vitalícias em C. elegans,este valor é definido para qualquer número grande (por exemplo, 1 x 108).
- Na guia Lifetime, selecione um encaixe global a ser usado (por exemplo, um encaixe em sentido de pixel). Ver Figura 1,Seta 4.
NOTA: Um encaixe em sentido pixel produzirá uma decadência instalada em cada pixel individual. Um ajuste em termos de imagem produzirá um ajuste global de cada imagem individual e exibirá um único valor de vida por imagem. Um ajuste global produzirá um único encaixe em todo o conjunto de dados. Um único valor vitalício é fornecido para todas as imagens. - Não altere nenhum outro parâmetro, exceto o Nº. Seleção de Exp se for sabido que a decaida de fluorescência escolhida é multiexponencial e exibe mais de uma vida útil.
NOTA: No presente protocolo, esta função foi utilizada para calcular as vidas do fluoróforo biexponencial cfp. - Faça upload do IRF através do menu IRF: IRF | Carregar IRF. Para estimar o turno do IRF, selecione IRF | Estimativa irf shift. Um conjunto de valores aparecerá automaticamente na guia IRF. Uma vez estabelecido, não altere nenhum outro parâmetro desta guia.
- Uma vez definidos todos os parâmetros, pressione O conjunto de dados de ajuste (Figura 1,Seta 5). O algoritmo produzirá um ajuste para a curva de decaimento e estabelecerá um valor vitalício para cada imagem.
NOTA: O ajuste resultante, destacado em uma linha azul, deve se sobrepor a todos os eventos. Um bom ajuste é obtido quando todos os eventos estão alinhados ao longo do ajuste. - Clique na guia Parâmetros (Figura 1, Seta 6), localizada nos menus superior direito da interface do software, e selecione Estatística: w_mean (média ponderada) e verifique se o valor chi2 está o mais próximo possível de 1.
NOTA: Um chi2 próximo a um garante a precisão do ajuste. O valor vitalício da imagem selecionada é, portanto, revelado como tau_1. - Exportar qualquer informação de interesse: Arquivo | Imagens de intensidade de exportação/tabela de resultados de ajuste/imagens/histogramas. Salvar as configurações de dados usadas para calcular a vida útil: Arquivo | Salvar configurações de dados.
NOTA: Os parâmetros utilizados serão salvos para análise futura das amostras selecionadas.
7. Representações gráficas de dados FLIM
NOTA: As vidas coletadas de diferentes amostras podem ser representadas visualmente de várias maneiras. Selecione para denotar os valores de vida em nanossegundos ou picosegundos.
- Mostre a qualidade do ajuste e a precisão da curva exportando a curva de decaimento diretamente da FLIMfit.
- Representar a distribuição dos fótons plotando a freqüência da contagem de fótons versus o valor vitalício em um histograma.
- Finalmente, para comparação estatística, se comparar duas ou mais amostras, coloque valores de vida mais desvio padrão da média em um gráfico de barra de gráfico de dispersão. Realize qualquer análise estatística desejada.
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Representative Results
O protocolo mostra como monitorar com precisão a formação de espécies agregadas em C. elegansvivos, tanto durante seu envelhecimento natural quanto quando submetidos ao estresse. Selecionamos quatro cepas diferentes de nematóides transgênicos que expressam proteínas de poliglutamina de repetições de 40T, 44T ou 85Q. Essas proteínas são sintetizadas em diferentes tecidos e foram fundidas a diferentes floróforos. As cepas C. elegans expressaram Q40-mRFP nos músculos da parede do corpo (mQ40-RFP), Q40-CFP no sistema nervoso (nQ40-CFP) e q44-YFP ou Q85-YFP no intestino (iQ44-YFP e iQ85-YFP)13. Para ilustrar como o envelhecimento promove a agregação, coletamos a vida dessas cepas de poliq em nematóides jovens, no 4º dia da vida, e nematóides velhos, no dia 8. Para mostrar os efeitos de uma deficiência na PN, realizamos um knockdown de hsp-1 nas cepas mQ40-RFP e nQ40.
Uma vez que os valores de vida foram extrapolados através do software FLIMfit, os dados obtidos mostraram uma clara redução na vida útil de qualquer um dos construtos de poliQ quando agregados devido à carga de glutamina, envelhecimento ou estresse. FLIM distinguiu entre a fração de proteína solúvel e espécies agregadas, e sua transição, registrando uma mudança em suas vidas.
No dia 4, o mQ40-RFP apresentou uma vida útil média de fluorescência de 1,69 ns(Figura 2). Após o envelhecimento, surgiram espécies mais agregadas, aparecendo como focos de baixa vida nas imagens de vida e mudando o histograma para vidas reduzidas (Figura 2A). Ao traçar a vida média de fluorescência de cada imagem adquirida ao longo da idade dos nematoides, uma redução significativa da vida útil da fluorescência e, portanto, o acúmulo de espécies agregadas, tornou-se visível(Figura 2B). A capacidade de dobramento de proteínas da PN diminuiu após o 4º dia de vida em C. elegans14 e as proteínas propensas à agregação se desdobraram ainda mais para agrupar-se em agregados amilóides e amorfos. Além da PN, as propensões de agregação intrínseca de uma determinada proteína desempenharam um papel importante na progressão da formação agregada. Isso foi analisado comparando-se o comportamento do iQ44-YFP e do iQ85-YFP. O q-trecho mais longo do iQ85 foi mais propenso à agregação e exibiu uma mudança de vida de fluorescência no histograma já no dia 4 da vida(Figura 3A). De fato, no dia 4, observou-se formação de focos para o iQ85, ainda ausente no iQ44. Ao envelhecer, no entanto, o iQ44 também apresentou formação de focos e, portanto, uma vida reduzida de fluorescência. Como o iQ85 já apresentava agregados no início da vida adulta, a progressão da agregação sobre o envelhecimento foi menos acentuada, mas significativa(Figura 3B). Finalmente, não detectamos a formação de focos nem diminuiu a vida útil da fluorescência na cepa nQ40-CFP(Figura 4A). Para essa cepa, houve apenas mudanças sutis e não significativas na vida média de fluorescência ao envelhecer (Figura 4B), potencialmente devido aos neurônios serem menos suscetíveis por razões ainda desconhecidas.
Derrubar o hsp-1 representa um desafio para o PN de mQ40 e nQ40 expressando nematóides. O esgotamento mediado pela RNAi do HSP-1 levou a um aumento significativo da agregação(Figura 5 e Figura 6). O Q40 expresso nos músculos da parede corporal tendia a formar um pequeno número de grandes focos cercados por material não agregado. Isso resultou em dois picos distintos nos histogramas (em torno de 1,7 ns e 1,4 ns, ver Figura 5A). Os nematóides tratados com idade e RNAi apresentaram um forte aumento no pico de baixa vida, diminuindo a vida média de fluorescência (Figura 5B). Comparado a esse comportamento bifásico do Q40 nos músculos, o Q40 neuronal apresentou um comportamento de agregação mais diverso. Não foi possível correlacionar diretamente a formação de focos com a agregação como na cepa de expressão muscular(Figura 6A). Como a FLIM oferece uma oportunidade de avaliar o grau de agregação, os histogramas revelaram que não houve pico distinto, mas uma distribuição generalizada das vidas de fluorescência, apontando para uma composição complexa de diferentes oligômeros e agregados de ordem superior. Ainda assim, o grau geral de agregação poderia ser avaliado por traçar a vida média de fluorescência(Figura 6B),mostrando que o knockdown hsp-1 levou a um aumento na agregação.
É importante notar que a vida útil dos fluoróforos, livres de um parceiro de fusão e fora de um sistema biológico, foi maior. Como a vida útil é afetada principalmente pelo seu ambiente, uma ligeira redução da vida útil de YFP e RFP já era perceptível dentro dos tecidos de C. elegans. Por isso, é importante obter a vida útil do POI solúvel dentro do nematóide como um controle adequado. Uma comparação entre a fração solúvel com uma maior vida útil e uma fração agregada com uma vida útil menor pode então ser feita. Aqui, a diminuição da vida se correlaciona com a formação de focos visíveis dentro do músculo e das células intestinais. Ainda assim, uma fração de focos não apresentou diminuição da vida útil da fluorescência (ver Figura 2 e Figura 3, setas brancas). Esta característica destaca como apenas parte da construção de fusão pode ser agregada em um determinado ponto espacial, e a presença e disponibilidade de proteína sem limites. Um cenário mais complexo surgiu da investigação da cepa neuronal Q40-CFP. O PCP possui intrinsecamente duas vidas distintas de fluorescência. Embora o PCP seja um fluoróforo ideal para a transferência de energia de ressonância förster (FRET)15 medidas, em conjunto com o YFP, não é aconselhável empregá-lo para monitorar a formação de agregados em C. elegans.
Figura 1: Captura de tela da interface de software FLIMFit. Captura de tela do software usado para calcular as vidas de fluorescência. A janela retrata a interface após as configurações serem definidas como descrito no texto, e o cálculo de vidas foi realizado. Setas numeradas referem-se a etapas específicas dentro do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As vidas de fluorescência do Q40-RFP muscular diminuíram com a idade. (A) Mapas representativos de C. elegans expressando musculoso Q40-RFP no dia 4 ou dia 8 de vida gerada pela FLIMfit. Vidas de fluorescência, intensidade de fluorescência e uma imagem mesclada de ambos são fornecidas. Barras de escala = 25 μm. Os histogramas mostram uma distribuição de vidas medidas para todos os nematóides analisados divididos em 100 categorias. (B) Parcelas de barras mostrando a vida média ponderada de todos os animais analisados no dia 4 ou 8 da vida, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: As vidas de fluorescência do Q44-YFP intestinal e do Q85-YFP intestinal diminuíram com a idade. (A) Mapas representativos de C. elegans expressando q44-YFP intestinal ou q85-YFP intestinal no dia 4 ou dia 8 de vida gerada pela FLIMfit. Vidas de fluorescência, intensidade de fluorescência e uma imagem mesclada de ambos são fornecidas. Barras de escala = 25 μm. Os histogramas mostram uma distribuição de vidas medidas para todos os nematóides analisados divididos em 100 categorias. (B) Parcelas de barras mostrando a vida média ponderada de todos os animais analisados no dia 4 ou 8 da vida, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: As vidas de fluorescência do Q40-PCP neuronal não mudaram com a idade. (A) Mapas representativos de C. elegans expressando o Neurônio Q40-CFP no dia 4 ou 8 de vida gerado pela FLIMfit. Vidas de fluorescência, intensidade de fluorescência e uma imagem mesclada de ambos são fornecidas (a segunda vida útil, τ2, é indicada em todas as amostras). Barras de escala = 25 μm. Os histogramas mostram uma distribuição de vidas medidas para todos os nematóides analisados divididos em 100 categorias. (B) Parcelas de barras mostrando a vida média ponderada de todos os animais analisados no dia 4 ou 8 da vida, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Vida útil da fluorescência do Q40-RFP muscular diminuiu após o knockdown de hsp-1. (A) Mapas representativos de C. elegans expressando musculoso Q40-RFP no dia 4 ou dia 8 de vida gerada pela FLIMfit. Uma mesclagem do mapa de vida e intensidade da fluorescência é exibida. Para ambos os pontos de tempo, são mostrados nematóides que cresceram em bactérias que expressam um vetor vazio (controle) ou bactérias que expressam o construto hsp-1 RNAi. Barras de escala = 25 μm. Os histogramas mostram uma distribuição de vidas medidas para todos os nematóides analisados divididos em 100 categorias. (B) Parcelas de barras que mostram a vida média ponderada de todos os animais analisados no dia 4 ou dia 8 de vida, com controle ou hsp-1 RNAi, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: As vidas de fluorescência do Q40-CFP neuronal diminuíram após o knockdown do hsp-1. (A) Mapas representativos de C. elegans expressando o Neurônio Q40-CFP no 4º dia de vida gerado pela FLIMfit. Uma mesclagem do mapa de vida e intensidade da fluorescência é exibida. Os nematoides mostrados foram cultivados em bactérias que expressam um vetor vazio (controle) ou bactérias expressando o construto hsp-1 RNAi. Barras de escala = 25 μm. Os histogramas mostram uma distribuição de vidas medidas para todos os nematóides analisados divididos em 100 categorias. (B) Parcelas de barras mostrando a vida média ponderada de fluorescência de todos os animais analisados no dia 4, com controle RNAi ou o hsp-1 RNAi. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado descreve uma técnica baseada em microscopia para identificar espécies agregadas no sistema modelo C. elegans. FLIM pode caracterizar com precisão a presença de espécies agregadas e solúveis fundidas a um fluoróforo através da medição de suas decaidas ao longo da vida de fluorescência. Quando uma proteína de fusão começar a agregar sua vida média registrada passará de um valor mais alto para um valor mais baixo16. A propensão da agregação pode então ser deduzida pela queda na vida: quanto menor a vida útil, maior a presença de espécies proteicas agregadas no sistema. Assim, torna-se possível acompanhar os efeitos do envelhecimento, doença ou comprometimento da PN na propensão de agregação de qualquer proteína.
Para destacar a versatilidade da técnica, nossos resultados mostraram claramente que a FLIM poderia identificar as mudanças na estrutura dos diversos construtos de poliQ, independentemente do tecido ou fluoroforre. É importante ressaltar que a FLIM já foi aplicada com sucesso na caracterização de outras proteínas propensas à agregação dentro de C. elegans, como α-sinucleína17. Além disso, torna-se possível aplicar qualquer fator de estresse a C. elegans e acompanhar o desdobramento e agregação de qualquer POI. Osmótico, ion-metal, redox ou estresse químico podem promover desequilíbrios tóxicos que podem ser monitorados com sucesso em C. elegans empregando FLIM. O inverso também pode ser possível: um atraso na agregação ou mesmo desagregação devido à presença de compostos benéficos ou aumento da PN, pode resultar em um resgate da proteína e um consequente aumento da vida.
A FLIM tem sido amplamente empregada para monitorar mudanças na vida de qualquer substância em uma ampla gama de disciplinas, desde química até biologia do câncer18 até diagnósticos médicos, mas algumas limitações permanecem. Um problema principal é a fotoestabilidade dos fluoróforos. Como o FLIM requer a gravação de um grande número de fótons, o fotobranqueamento reduz o número de fótons coletados e pode alterar a curva de decaimento resultante. Além disso, especialmente dentro do sistema nematode, se a intensidade do fluoróforo em si não é suficientemente alta para que fótons suficientes sejam coletados, uma excitação mais alta é necessária, levando a um fotobranqueamento mais rápido e uma curva de decaimento não confiável. Por fim, a técnica requer equipamentos sofisticados e caros como complementos aos sistemas de microscopia pré-existentes, sendo um elemento crítico a sensibilidade dos detectores19.
Por outro lado, uma das principais vantagens de calcular a vida útil de um fluoróforo e sua proteína de fusão é que ele fornece informações sobre diferentes frações do mesmo complexo fluoroforro-proteína em diversos estados de interações dentro de seu ambiente, independentemente de sua concentração amplamente desconhecida. O FLIM também pode ser usado para medir a vida útil em qualquer fase, gás, líquido ou sólido e em qualquer meio ou organismo que possa ser normalmente imagem, de células a organismos, e organelas a proteínas imobilizadas e purificadas20. As técnicas de microscopia geralmente dependem da imagem de estado estável de uma proteína marcada fluorescentemente. Ao contrário das técnicas de estado estável, a FLIM pode resolver mudanças na ligação, composição e conformação de um substrato biológico. Para investigar proteínas propensas à agregação, a presença de grandes inclusões fluorescentes ou focos pode ser facilmente vista, mas estas representam apenas um instantâneo estático baseado em intensidade3. No caso de espécies agregadas, os focos visualizados também podem ser enganosos, pois uma alta concentração de fluoróforo não resulta necessariamente em forte formação amilóide. Via FLIM é possível distinguir solúvel de material insolúvel. Finalmente, torna-se benéfico para qualquer investigação obter tanto as medidas baseadas em intensidade quanto a medição paralela da vida. Dentro da complementaridade dessas técnicas de microscopia está sua força.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
A cepa músculo-Q40-mRFP fornecida pelo CGC, que é financiada pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). O neuronal-Q40-CFP foi um presente gentil do Laboratório Morimoto. Reconhecemos o DFG (KI-1988/5-1 para JK, a bolsa de doutorado NeuroCure pelo Cluster de Excelência neurocure para MLP), a EMBO (bolsa de curto prazo para a MLP) e a Companhia de Biólogos (bolsas de viagem para CG e MLP) para financiamento. Também reconhecemos a instalação de imagens de microscopia avançada de luz no Centro Max Delbrück de Medicina Molecular, Berlim, por fornecer a configuração para a imagem que o YFP constrói.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
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