Summary
我们优化了一种市售雌激素受体β记者检测，用于筛查人类和非人类灵长类动物的食物，以进行雌激素活性活动。我们通过显示已知的雌激素人类食物大豆注册高，而其他食物显示没有活性来验证这一分析。
Abstract
植物是许多动物的食物来源，它们可以产生成千上万的化学物质。其中一些化合物影响消耗它们的脊椎动物的生理过程，如内分泌功能。植物雌激素，研究最充分的内分泌活性植物化学物质，直接与脊椎动物内分泌系统的下丘脑-皮质淋巴轴相互作用。在这里，我们介绍了一种新颖的利用基于细胞的检测方法来筛选植物提取物，以发现具有雌激素生物活性的化合物的存在。这种分析使用哺乳动物细胞设计，以高度表达雌激素受体β（ER+），并且已经与露西费酶基因转染。接触具有雌激素活性的化合物会导致细胞产生光。这种检测是测试生物雌激素活性的可靠和简单方法。它比瞬态透变检测有几种改进，最明显的是易于使用、细胞的稳定性和检测的灵敏度。
Introduction
植物是许多动物必需的食物来源，提供对生存、繁殖、生长、发育和行为至关重要的卡路里和营养物质。植物产生成千上万的化学物质，许多是适应自身生长、植物维持和繁殖的。其他化合物，被视为植物二次代谢物（PSM），其功能不太清晰，虽然有些是有毒的，并可能用作防御食草动物和寄生虫（如生物碱，单宁）2，3.其中一些化学物质有能力影响动物的长期生理过程，如内分泌功能，虽然为什么这些内分泌活性植物化学物质与脊椎动物内分泌系统相互作用仍不清楚2，4。
植物雌激素，研究最充分的内分泌活性植物化学物质，是多酚类PSM，在结构和功能上模仿雌激素，直接与脊椎动物内分泌系统5的假体-垂体淋巴轴相互作用。在人类饮食中摄入植物雌激素与预防某些癌症、心脏病和更年期症状有关，尽管其他影响包括生育问题。事实上，这些化合物的生理影响是在20世纪40年代发现的，当时绵羊的不育归因于它们对富含植物雌激素的三叶草（三叶草）的放牧。摄入后，植物雌激素可以进入细胞并模仿雌激素的作用。虽然植物雌激素对绵羊的生育能力有负面影响，但植物雌激素与生理学之间的关系并不简单。与绵羊一样，南方白犀牛对源自大量大豆和紫花花的饲料中的雌激素化合物表现出敏感性。在怀孕期间喂养这种饮食的女性的女儿不太可能繁殖7。然而，其他研究表明，植物雌激素也可能有积极的影响，包括卵巢卵泡的成熟在老老鼠8，预防某些癌症，抗氧化活性和抗增殖作用9。
植物雌激素的影响范围并不奇怪，因为雌激素影响广泛的生物功能，包括生长，发育和调节生殖和中枢神经系统10。虽然有许多作用机制，植物雌激素往往有能力修改，增强或破坏雌激素信号，通过他们的能力，作为配体的核内雌激素受体阿尔法和β（ER+和ER+）。许多植物雌激素具有类似于雌激素的酚环结构，允许它们结合雌激素受体。那些具有痛苦的雌激素活性功能，如雌激素，形成一个激活的ER-ligand复合物，可以变暗和结合雌激素反应元素（ERE），并触发基因转录11。因此，雌激素和植物雌激素通过它们作为转录因子的行为来调节细胞活动和系统功能。
在这里，我们介绍了一种新颖的利用基于细胞的检测方法来筛选植物提取物，以发现具有雌激素生物活性的化合物的存在。这种检测使用中国仓鼠卵巢CHO细胞设计，以高度表达ER+，已被转染与萤火热病毒（Photinus皮拉里斯）荧光酶基因链接到ERE促进者12。当雌激素化合物存在时，它们与急ER结合，变暗，并结合到ERE，导致荧光酶基因的转录。加入基板溶液后，卢西费酶催化导致光子发射的反应。因此，阳性样品产生的光和阴性样品不。
这种市售的检测无需实验室用报告基因和雌激素受体13、14来传染哺乳动物细胞，这些受体的功效不稳定且变化无常。该检测提供了一个稳定的转染平台，能够快速而简单地通过受体结合确定植物是否具有雌激素活性。
我们测试了这样一个假设，即大豆的雌激素活性高于所有其他食物，因为大豆已知浓度为雌激素异黄酮15， 使用来自当地杂货店的人类食物。
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Protocol
1. 植物材料的准备
- 冷冻使用嗜酸剂新鲜收集的干燥植物物品。
- 为了保护样品免受光线照射，在干燥过程中用铝箔盖住腔室。
- 为了确保样品完全干燥，嗜酸，直到室不再感到寒冷触摸和植物材料不再失去质量时称重。
- 将干燥的植物存放在无菌低残留袋中，在没有光线的情况下，直到研磨。
- 使用带 0.85 mm 网格屏幕的研磨机精细研磨样品。
- 在没有光线的情况下将地面样品存放在袋子里，直到提取。
2. 提取植物二次代谢物
- 要提取二级植物代谢物，请使用 1 克干样品与 10 mL 的 HPLC 级甲醇的比例。
- 在分析平衡上称量样品，并将其添加到大小合适的埃伦迈尔烧瓶（125-250 mL）中。然后添加适量的甲醇。记录提取的样本的质量。
- 用铝箔盖住植物甲醇溶液，然后在室温 （RT） 下以 100 rpm 的速度在轨道摇床上旋转 3 天，使潜在的雌激素化合物溶解到甲醇中。
- 使用滤纸（125毫米）将超细长剂倒入滴滤系统。
- 使用旋转蒸发器，将植物提取物干燥，直到样品变厚，但可倒入 300 mL 的圆底烧瓶中。将样品倒入 50 mL 圆底烧瓶中，用少量甲醇冲洗大烧瓶。继续在小烧瓶中干燥样品，直到甲醇完全蒸发。
- 使用分析平衡对样品残留物进行称重。记录残留质量。
- 将植物提取物溶解在二甲基硫化物 （DMSO） 中，浓度为 0.1 克提取物到 2 mL DMSO。漩涡，直到同质化。
- 将植物提取物-DMSO溶液在4°C下存放在琥珀色玻璃瓶中，直到检测。
警告：植物可以产生未知的生物活性化学物质，DMSO是一种可以通过细胞膜运输它们的工具。在处理这些样品时，使用适当的个人防护设备并小心谨慎。
3. 人体雌激素受体β转位检测12
注：检测协议的第 1 天需要无菌技术和层流罩。
- 为标准曲线准备 17+ 雌二醇的稀释。
- 将细胞恢复介质和复合筛选介质 （CSM） 从冰柜存储中转移，并在 37 °C 水浴中解冻。
- 标记微中心管中间体 1 和 2 （INT1，INT2） 和 1-8。
- 用 995 μL 的 CSM 填充 INT1，用 615 μL 的 CSM 填充 INT2，用 900 μL 的 CSM 填充 1 管，用 600 μL 的 CSM 填充 2-8。将管 8 放在一边。
- 将 100 μM 17+Estradiol 库存的 5 μL 转入 INT1。丢弃提示。涡。
- 每次传输前，冲洗移液器 3 次，然后从 INT1 传输 10 μL 到 INT2。丢弃提示。
- 冲洗移液器3次，然后从INT2传输100μL到管1。丢弃提示。将 300μL 从 1 管转移到 2 管中。重复管 3 到 7。将 300μL 从 7 管中丢弃到废物容器中。管8是零，不接收雌二醇。镀膜标准的最终浓度为：400、133.3、44.44、14.815、4.938、1.646、0.5487和0 pM雌二醇。
- 准备样品化合物。
- 漩涡样本。
- 以 DMSO 中每个植物样本的 4 μL 为例，并添加到 496 μL 的 CSM 中，以产生 0.8% 的 DMSO 解决方案。
- 迅速解冻记者细胞。
- 从 37 °C 水浴中取出细胞恢复介质管。使用 70% 乙醇对外部表面进行消毒。
- 通过将预加热的 CRM 的 10 mL 传输到冷冻细胞管中，从 -80 °C 存储中检索记者细胞并解冻。
- 关闭记者细胞管，转移到 37°C 的水浴室 5-10 分钟。
- 从水浴中取出记者细胞悬浮管。轻轻倒置细胞管数次，以分解细胞聚集物并产生同质悬浮物。用 70% 乙醇清洁管子表面。
- 检测电镀
- 使用多通道移液器将 100 μL 的记者细胞悬浮液分配到每个井中。
- 将 100 μL 的样品分三次放入适当的检测井中。
- 将板转移到 37 °C 中，加湿 5% CO2 孵化器 22-24 小时。
- 在黑暗的冰箱中通宵解冻检测基板和检测缓冲区，为第 2 天做准备。
- 在板式孵化结束之前，从冰箱中取出检测基板和检测缓冲区，放置在低光区域，直到平衡到 RT。一旦在RT，轻轻倒置每个管几次，以彻底混合解决方案。
- 在孵化完成之前，将检测缓冲区的全部内容倒入检测基板管中，以创建 Luciferase 检测试剂。轻轻混合，以免产生泡沫。
- 孵化完成后，倒置板将内容倒置到适当的废容器中。轻轻敲击干净的吸水纸巾上的板，从井中取出最后一滴水滴。
- 在每个油井中添加 100μL 的卢西费酶检测试剂。让检测板在RT上休息15分钟。不要摇盘子。
- 使用 96 井板读数氧化铝计量化发光。
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Representative Results
在人类饮食中常见的22种水果和蔬菜提取物被筛选出雌激素化合物的存在。各种食物被检测，包括豆类，如大豆，雪豌豆和豌豆，因为豌豆家族是已知的植物雌激素16的来源，以及无花果，枣，玉米，胡萝卜，苹果，香蕉，草莓，番茄，甘蓝和卷心菜。内分泌破坏化合物存在于常见物质（例如塑料和杀虫剂）中，有些通过红外体17具有生物活性。如果可能，对有机和非有机种植的物品进行检测，以解释具有雌激素活性的杀虫剂可能影响结果的可能性。
每个植物食品都镀在三联体中，发光度计报告了每口井在相对光单元（RLUs）中的活性。RLUs 的背景级别在标准曲线中与标准 8、零浓度一起确定，并用于参考。 折叠活化值（是曲线上零点的 RLU 上方的乘数）由方程计算：
折叠激活 = 未知 （RLU） ÷标准 8 （RLU）
出于解释目的，雌激素活性以通常、定性的方式呈现，即高、美、低或无活动。高于标准 4 倍激活值的高活动值注册。标准 5 和标准 4 之间的中等值，低值介于标准 6 和标准 5 之间。折叠激活值低于标准 7 的任何示例均被视为无活动。提到 表1，大豆，有机和非有机，筛选在高水平的活动，而所有其他水果和蔬菜项目登记没有活动。将大豆结果与标准曲线（图1）进行比较，可以发现，无论是否有机生长，它们在这个浓度下的雌二醇活性水平都比曲线高。大豆提取物是已知的异黄酮 daidzein 和基因斯坦9的有力来源，进一步用于确定稀释产生 50% 的信号到最大值 （图 2）。此提取物需要 422 倍以上的稀释才能产生我们标准稀释协议的一半信号。
| 生产项目 | 有机/非有机 | 相对光单位（卢姆） | 折叠激活 | 折叠激活（平均） | 植物雌激素活动 |
| 大豆 | 有机 | 1687 | 29.016 | 31.06 | 高 |
| 2023 | 34.796 | ||||
| 1706 | 29.353 | ||||
| 大豆 | 非有机 | 2041 | 35.106 | 32.05 | 高 |
| 1956 | 33.647 | ||||
| 1593 | 27.399 | ||||
| 雪豌豆 | 非有机 | 53 | 0.919 | 0.92 | 无活动 |
| 59 | 1.015 | ||||
| 49 | 0.836 | ||||
| 捕捉豌豆 | 非有机 | 66 | 1.142 | 1.21 | 无活动 |
| 60 | 1.032 | ||||
| 85 | 1.462 | ||||
| 玉米 | 非有机 | 29 | 0.502 | 0.53 | 无活动 |
| 30 | 0.513 | ||||
| 33 | 0.575 | ||||
| 草莓 | 非有机 | 35 | 0.609 | 0.77 | 无活动 |
| 47 | 0.808 | ||||
| 51 | 0.884 | ||||
| 草莓 | 有机 | 56 | 0.956 | 0.88 | 无活动 |
| 59 | 1.015 | ||||
| 39 | 0.678 | ||||
| 香蕉 | 有机 | 32 | 0.544 | 0.52 | 无活动 |
| 28 | 0.489 | ||||
| 31 | 0.533 | ||||
| 香蕉 | 非有机 | 33 | 0.564 | 0.60 | 无活动 |
| 41 | 0.712 | ||||
| 31 | 0.533 | ||||
| 车前 草 | 非有机 | 37 | 0.64 | 0.70 | 无活动 |
| 39 | 0.667 | ||||
| 47 | 0.805 | ||||
| 甘蓝 | 有机 | 26 | 0.447 | 0.47 | 无活动 |
| 26 | 0.444 | ||||
| 30 | 0.519 | ||||
| 甘蓝 | 非有机 | 40 | 0.685 | 0.63 | 无活动 |
| 28 | 0.485 | ||||
| 42 | 0.719 | ||||
| 白菜 | 有机 | 33 | 0.568 | 0.54 | 无活动 |
| 27 | 0.468 | ||||
| 34 | 0.588 | ||||
| 白菜 | 非有机 | 44 | 0.757 | 0.66 | 无活动 |
| 34 | 0.585 | ||||
| 36 | 0.626 | ||||
| 苹果 | 有机 | 30 | 0.523 | 0.49 | 无活动 |
| 25 | 0.437 | ||||
| 30 | 0.509 | ||||
| 苹果 | 非有机 | 41 | 0.705 | 0.62 | 无活动 |
| 31 | 0.53 | ||||
| 37 | 0.63 | ||||
| 番茄 | 有机 | 51 | 0.874 | 0.87 | 无活动 |
| 57 | 0.974 | ||||
| 44 | 0.76 | ||||
| 番茄 | 非有机 | 61 | 1.056 | 1.19 | 无活动 |
| 81 | 1.386 | ||||
| 66 | 1.128 | ||||
| 胡萝卜 | 有机 | 33 | 0.575 | 0.51 | 无活动 |
| 33 | 0.561 | ||||
| 22 | 0.382 | ||||
| 胡萝卜 | 非有机 | 31 | 0.53 | 0.52 | 无活动 |
| 21 | 0.365 | ||||
| 38 | 0.657 | ||||
| 图 | 非有机 | 29 | 0.506 | 0.61 | 无活动 |
| 42 | 0.716 | ||||
| 36 | 0.619 | ||||
| 日期 | 非有机 | 29 | 0.495 | 0.59 | 无活动 |
| 39 | 0.667 | ||||
| 35 | 0.602 |
表 1.用于植物雌激素活性的水果和蔬菜项目筛选的 ER+记者检测系统的代表性结果。阳性活动由高、中、低或无活动表示。
图 1.17°-雌二醇标准的序列稀释（标准1至8浓度=400， 133.3， 44.44， 14.815， 4.938， 1.646， 0.5487 和 0 pm， 分别使用 Er + 记者分析系统。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2。ER+记者分析 使用大豆提取物的序列稀释来确定产生最大信号 50% 的信号与背景比的稀释。 从标准提取方法中，将二甲基硫化物（DMSO）中的植物提取物溶解在0.1克提取物中，到DMSO的2mL浓度，大豆必须稀释422次，才能发出最大响应的50%的信号。 请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
ER+记者检测开发为单独筛选药物制剂也适用于筛选植物性植物雌激素通过 ER+生物活性的食物。协议中的重要考虑因素包括小心处理植物样品：需要迅速干燥新鲜植物材料以防止成型或其他生物退化，并且需要远离光线以防止化合物18的光解。制造商提供的检测协议12 是明确的，需要很少的修改进行筛选。制造商建议的标准曲线已在此协议中进行了修改，以增加曲线指数范围内的点数（图 1），同时保留顶部和底部的高原。使用这种检测进行定量分析是可能的，但我们的目的是将高活性植物与生物效应、食物选择以及食用它们的动物的其他行为联系起来。
为了进一步说明提取和测定的有效性，我们包括了大豆提取物的剂量反应曲线（图2），并确定鉴于正常萃取协议的效力，大豆必须在信号降至最大50%之前广泛稀释。这突出了这样一个事实，即在植物雌激素的高浓度下，信号稳定在稳定的最大信号。在非常低的浓度下，信号可能不够强，无法与背景区分开来。重要的是要与高浓度的提取物工作，以检测植物雌激素存在于样品中的低量，尽量减少假阴性。最初，实验室使用比甲醇提取的植物残留物（即 10 mL 的 DMSO 到 0.1 克植物残留物）的 DMSO 体积更大。样品太稀释，无法引起阳性样品的强烈发光。由于报告器单元的可行性和板材油井内的体积限制的最大 DMSO 百分比，在将 DMSO 添加到植物残留物时应优化样品提取物浓度。每个盘子中都应该包括大豆等积极控制，以确认细胞是可行的，能够发光，并且提取物浓度足以引起反应。
此检测检测与 ER+结合的化合物，但并非所有植物雌激素都有相同的作用机制。这种检测方案可以通过孵化细胞与雌二醇和植物化合物的组合来检测样品9，12中是否有抗雌激素活性来修改。雌二醇对ER有很大的亲和力，因此植物雌激素的存在可能具有抗雌二醇的存在，通过阻断受体，减少对雌激素的反应。随着植物提取物浓度的增加，将减少总活化，从而检测到抗雌激素活性。此检测不会检测其他操作方法，例如与膜绑定 RS19结合。此外，一些植物雌激素在被肠道微生物20代谢之前在生物学上并不活跃。有可能，一些植物，没有或低雌激素活性在其未代谢状态有较高的雌激素活性后代谢，这种检测不会检测。
ER+记者的检测被选为植物雌激素在植物中活性筛查的例证，因为植物雌激素与雌二醇的结合比对ER+21的结合更强烈。通过类似的检测可以筛查 ER+活动，其中细胞与 ER+基因而不是 ER+基因一起进行。
在对活性植物雌激素进行阳性筛选后，可以通过色谱方法识别活性化合物。事实上，在这一点上，孤立的化合物可以使用这种检测测试，半最大有效浓度（EC50）可以确定使用稀释系列作为化合物效力的测量。
这种检测是测试生物雌激素活性的可靠和简单方法，同时铭记其在雌激素活性机制广度的局限性。它比瞬态透变检测有几种改进，最明显的是易用性、细胞的稳定性和检测的灵敏度。
人们对于人类或野生动物食用的野生植物性食物中植物雌激素的流行程度知之甚少，但研究表明，在饮食中接触雌激素类SMS会产生持久的影响。有一个简单的强健的检测，检测这些化合物，结合研究评估吃量和何时食用，是确定在饮食中包括雌激素食品的功能和这些化合物对生理系统的影响的有力步骤。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢戴尔·莱特曼在使用瞬态透切检测来确定灵长类植物食物的雌激素活性方面进行了初步培训。感谢布拉德福德·韦斯特里奇和C·埃里克·约翰逊帮助建立实验室设备，并培训学生提取方法。最后，感谢印第安纳大学为这项研究提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000 µL pipette | |||
| 20 µL pipette | |||
| 200 µL pipette | |||
| 37 ° water bath | |||
| 37 °, humidified 5% CO2 incubator | |||
| 70% ethanol | |||
| analytical balance | |||
| cell culture-rated laminar flow hood | |||
| dimethyl sulfoxide | |||
| disposable media basin, sterile | |||
| drip filtration system | |||
| Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
| HPLC grade methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve |
| lyophilizer | |||
| multi-channel pipette | |||
| orbital shaker | |||
| plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
| rotory evaporator | |||
| round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
| sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
| sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
| Whatman grade 1 paper | |||
| whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
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