Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Screening for fytoøstrogener ved hjælp af en cellebaseret østrogenreceptor β Reporter Assay

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61005

Summary

Vi har optimeret en kommercielt tilgængelig østrogen receptor β reporter analyse for screening menneskelige og ikke-menneskelige primat fødevarer til østrogen aktivitet. Vi validerede denne analyse ved at vise, at den kendte østrogene menneskelige fødevarer soja registre høj, mens andre fødevarer viser ingen aktivitet.

Abstract

Planter er en fødekilde for mange dyr, og de kan producere tusindvis af kemikalier. Nogle af disse forbindelser påvirker fysiologiske processer i hvirveldyrene, der forbruger dem, såsom endokrine funktion. Phytoøstrogener, de mest velundersøgte endokrine-aktive fytokemikalier, interagerer direkte med den hypothalamo-hypofyse gonadal akse i hvirveldyr endokrine system. Her præsenterer vi den nye brug af en cellebaseret analyse til at screene planteekstrakter for tilstedeværelsen af forbindelser, der har østrogen biologisk aktivitet. Denne analyse bruger pattedyrsceller, der er konstrueret til at udtrykke østrogenreceptor beta (ERβ), og som er blevet transfected med et luciferase gen. Eksponering for forbindelser med østrogen aktivitet resulterer i, at cellerne producerer lys. Denne analyse er en pålidelig og enkel måde at teste for biologisk østrogen aktivitet. Det har flere forbedringer i forhold til forbigående transfekt assays, især brugervenlighed, stabiliteten af cellerne, og følsomheden af analysen.

Introduction

Planter er en nødvendig fødekilde for mange dyr, der giver kalorier og næringsstoffer, der er kritiske for overlevelse, reproduktion, vækst, udvikling og adfærd1. Planter producerer tusindvis af kemikalier, mange som tilpasninger til deres egen vækst, stomatisk vedligeholdelse og reproduktion. Andre forbindelser, anses plante sekundære metabolitter (PSMs), har funktioner, der er mindre klare, selv om nogle er giftige og sandsynligvis anvendes som et forsvar mod planteædende og parasitisme (f.eks alkaloider, tanniner)2,3. Nogle af disse kemikalier har evnen til at påvirke langsigtede fysiologiske processer hos dyr, såsom endokrine funktion, selv om hvorfor disse endokrine-aktive fytokemikalier interagerer med hvirveldyr endokrine system er stadig uklart2,4.

Fytoøstrogener, de mest velundersøgte endokrine-aktive fytokemikalier, er polyphenoliske PSM'er, der strukturelt og funktionelt efterligner østrogener, der direkte interagerer med hypothalomo-hypofyse-gonadal aksen i hvirveldyrets endokrine system5. Indtagelse af fytoøstrogener i den menneskelige kost er forbundet med beskyttelse mod nogle kræftformer, hjertesygdomme, og overgangsalderen symptomer, selv om andre virkninger omfatter fertilitetsproblemer. Faktisk blev de fysiologiske virkninger af disse forbindelser opdaget i 1940'erne, da infertilitet hos får blev tilskrevet deres græsning på fytoøstrogen-rige kløver (Trifolium subterrareum)6. Når de indtages, kan fytoøstrogener passere ind i cellerne og efterligne virkningerne af østrogen. Mens fytoøstrogener havde negative virkninger på fårefertiliteten, er forholdet mellem fytoøstrogener og fysiologi ikke enkelt. Ligesom får udviser sydlige hvide næsehorn følsomhed over for østrogenforbindelser i foder, der stammer fra store mængder soja og lucerne. Døtre af kvinder fodret denne kost under graviditeten er mindre tilbøjelige til at reproducere7. Andre undersøgelser har imidlertid vist, at fytoøstrogener også kan have positive virkninger, herunder modning af æggestokkenes follikler hos ældre mus8, forebyggelse af visse kræftformer, antioxidantaktivitet og antiproliferative virkninger9.

Bredden af virkninger af fytoøstrogener er ikke overraskende, da østrogener påvirker en bred vifte af biologiske funktioner, herunder vækst, udvikling og regulering af reproduktions- og centralnervesystemet10. Selv om der er mange virkningsmekanismer, phytoestrogens ofte har evnen til at ændre, forbedre eller forstyrre østrogen signalering gennem deres evne til at fungere som ligands for intranukleare østrogen receptorer alfa og beta (ERα og ERβ). Mange fytoøstrogener har en phenol ring struktur svarende til østrogener, der giver dem mulighed for at binde østrogen receptorer. Dem med agonistisk østrogen aktivitet fungerer som østrogen, danner en aktiveret ER-ligand kompleks, der kan dæmpe og binde sig til en østrogen respons element (ERE) og udløse gen transskription11. Således regulerer østrogener og fytoøstrogener celleaktivitet og systemfunktioner gennem deres handlinger som transskriberingsfaktorer.

Her præsenterer vi den nye brug af en cellebaseret analyse til at screene planteekstrakter for tilstedeværelsen af forbindelser, der har østrogen biologisk aktivitet. Denne analyse bruger kinesiske hamster æggestokke CHO celler manipuleret til meget udtrykke ERβ, som er blevet transfected med firefly (Photinus pyralis) luciferase gen knyttet til en ERE promotor12. Når østrogene forbindelser er til stede, binder de sig til ER, dimerize og binder sig til ERE, hvilket fører til transskription af luciferase-genet. Ved tilsætning af en substratopløsning katalyserer luciferase en reaktion, der fører til fotonemission. Derfor producerer positive prøver lys, og negative prøver producerer ikke.

Denne kommercielt tilgængelige analyse eliminerer behovet for laboratorier til at transfektere pattedyrcellerne med reportergenet og østrogenreceptoren13,14, som var ustabil og variabel i effekt. Analysen giver en stabil transfektplatform, der giver mulighed for hurtigt og enkelt at afgøre, om en plante har østrogen aktivitet via receptorbinding.

Vi tester hypotesen om, at sojabønner har højere østrogen aktivitet end alle andre fødevarer i betragtning af deres kendte koncentrationer af østrogen isoflavoner15 ved hjælp af menneskelige fødevarer fra lokale købmænd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tilberedning af plantematerialer

  1. Frys tørre planteelementer, der blev indsamlet frisk ved hjælp af en lyophilizer.
    1. For at beskytte prøver mod lys skal du dække kamre med aluminiumsfolie under tørringsprocessen.
    2. For at sikre, at prøverne er helt tørre, lyophilize indtil kamre ikke længere føler koldt at røre ved og plantematerialer ikke længere mister masse, når vejes.
    3. Opbevar tørrede planter i sterile poser med lavt restprodukt i mangel af lys indtil slibning.
  2. Finslib prøver ved hjælp af en slibemølle med 0,85 mm netskærm.
    1. Jordprøverne opbevares i poserne uden lys indtil udsugning.

2. Udvinding af sekundære plantemetabolitter

  1. For at udvinde de sekundære plantemetabolitter skal der anvendes et forhold på 1 g tørret prøve til 10 mL methanol af HPLC-kvalitet.
    1. Prøven vejes på en analytisk balance, og den tilsættes til en erlenmeyerkolbe af passende størrelse (125 – 250 mL). Derefter tilsættes passende volumen methanol. Registrer massen af den udtrukne prøve.
    2. Dæk planten-methanol løsning med aluminiumsfolie, og derefter indstillet til at rotere ved 100 omdrejninger i minuttet hastighed ved stuetemperatur (RT) i 3 dage på en orbital shaker, så de potentielt østrogene forbindelser til at opløses i methanol.
    3. Supernatanten dekanteres til et drypfiltreringssystem ved hjælp af filterpapir (125 mm).
    4. Ved hjælp af en roterende fordamper tørres planteekstraktet, indtil prøven er fortykket, men kan hældes i en 300 mL rundbundet kolbe. Der hældes en prøve i en 50 mL rundbundet kolbe, hvor den store kolbe skylles med en lille mængde methanol. Prøven tørres fortsat i den lille kolbe, indtil methanolen er helt fordampet.
    5. Prøveresterne vejes ved hjælp af en analytisk vægt. Registrer restkoncentrationens masse.
    6. Planteekstraktet opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) i en koncentration på 0,1 g ekstrakt til 2 mL DMSO. Vortex indtil homogeniseret.
    7. Plantens ekstrakt-DMSO-opløsning opbevares ved 4 °C i ravglasglas, indtil analysen er analyseret.

ADVARSEL: Planter kan producere ukendte biologisk aktive kemikalier, og DMSO er et køretøj, der kan transportere dem på tværs af cellemembraner. Brug passende personlige værnemidler og pleje ved håndtering af disse prøver.

3. Human østrogen receptor β transfekt assay12

BEMÆRK: Aseptisk teknik og en laminar flow hætte er påkrævet for Dag 1 i analysen protokollen.

  1. Forbered fortyndinger af 17β-Østradiol til standardkurven.
    1. Cell Recovery Medium and Compound Screening Medium (CSM) overføres fra fryselageret og optøes i et 37 °C vandbad.
    2. Label mikrocentrifuge rør Intermediate 1 og 2 (INT1, INT2) og 1-8.
    3. INT1 fyldes med 995 μL CSM, INT2 med 615 μL CSM, rør 1 med 900 μL CSM og rør 2-8 med 600 μL CSM. Sæt rør 8 til side.
    4. 5 μL af 100 μM 17β-østradiollager overføres til INT1. Kassér spidsen. Vortex.
    5. Før hver overførsel skylles pipetten 3 gange, og derefter overføres 10 μL fra INT1 til INT2. Kassér spidsen.
    6. Skyl pipetten 3 gange, og overfør derefter 100 μL fra INT2 til rør 1. Kassér drikkepenge. 300 μL overføres fra rør 1 til rør 2. Gentag for rør 3 til 7. 300 μL kasseres fra rør 7 i affaldsbeholderen. Tube 8 er et nul og modtager ikke østradiol. De endelige koncentrationer af belagte standarder er: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 og 0 pM østradiol.
  2. Forbered prøveforbindelser.
    1. Vortex prøver.
    2. Der udtages 4 μL af hver planteprøve i DMSO, og der tilsættes 496 μL CSM for at give en 0,8% DMSO-opløsning.
  3. Tø hurtigt reporterceller op.
    1. Rekvirer røret af cellgenvindingsmediet fra vandbadet på 37 °C. Desinficer den udvendige overflade ved hjælp af 70% ethanol.
    2. Hent Reporter Cells fra -80 °C opbevaring og optøning ved at overføre 10 mL af den forvarmede CRM til røret af frosne celler.
    3. Luk røret af Reporter Celler og overføre til en 37 ° C vandbad i 5-10 min.
    4. Hent røret af Reporter Cell Suspension fra vandbadet. Invertere røret af celler flere gange forsigtigt at bryde op aggregater af celler og producere en homogen suspension. Rengør overfladen af røret med 70% ethanol.
  4. Assay plating
    1. Dispenser 100 μL af Reporter Cell Suspension i hver brønd ved hjælp af en multikanalpipette.
    2. 100 μL prøver i tre eksemplarer udleveres til passende analysebrønde.
    3. Pladen overføres til en 37 °C, befugtet 5% CO2 inkubator i 22-24 timer.
  5. Tø detektionssubstrat og detektionsbuffer op i et mørkt køleskab natten over for at forberede dag 2.
  6. Lige før afslutningen af pladeinkubationen skal du fjerne detektionssubstrat og detektionsbuffer fra køleskabet og placere det i svagt lysområde, indtil det er ekvilibreret til RT. Når du er på RT, skal du forsigtigt vende hvert rør flere gange for grundigt at blande opløsninger.
    1. Umiddelbart før inkubationen er færdig, hældes hele indholdet af detektionsbufferen i detektionssubstratet for at skabe Luciferase Detection Reagens. Bland forsigtigt for ikke at producere skum.
    2. Når inkubationen er færdig, skal pladen vendes om for at kassere indholdet i en passende affaldsbeholder. Bank forsigtigt på pladen på et rent absorberende køkkenrulle for at fjerne de sidste dråber fra brøndene.
    3. Der tilsættes 100 μL Luciferase-detektionsreagens til hver brønd. Lad analysepladen hvile ved RT i 15 minutter. Pladen må ikke rystes.
  7. Kvantificer luminescens ved hjælp af et 96-brønds pladeaflæsningslysometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

22 ekstrakter af frugt og grøntsager, der almindeligvis findes i menneskelig kost, blev screenet for tilstedeværelsen af østrogenforbindelser. En række fødevarer blev analyseret, herunder bælgfrugter, såsom sojabønner, sne ærter, og snap ærter, som ærten familien er en kendt kilde til fytoøstrogener16, samt figner, datoer, majs, gulerødder, æbler, bananer, jordbær, tomat, grønkål og kål. Hormonforstyrrende forbindelser findes i almindelige stoffer (f.eks. plast og pesticider), og nogle er biologisk aktive gennem ER17. Når det var muligt, blev både økologiske og uorganisk dyrkede genstande analyseret for at tage højde for muligheden for, at pesticider med østrogen aktivitet kunne have påvirket resultaterne.

Hver plantefødevare var belagt med tre eksemplarer, og lystælleren rapporterede hver brønds aktivitet i relative lysenheder (RLUs). Baggrundsniveauerne for RLU'er bestemmes i standardkurven med standard 8, nulkoncentrationen og bruges som reference.  Foldaktiveringsværdien, som er multiplikatoren over RLU'en for nulpunktet på kurven, beregnes af ligningen:

Fold aktivering = Ukendt (RLU) ÷ Standard 8 (RLU)

Til fortolkningsformål præsenteres østrogen aktivitet på en ordenel, kvalitativ måde af Høj, Med, Lav eller Ingen aktivitet. Høje aktivitetsniveauer registreres over standard 4-foldaktiveringsværdien. Mellemfald mellem standard 5 og standard 4 og lave værdier ligger mellem Standard 6 og Standard 5. Alle prøver med foldaktiveringsværdier under standard 7 betragtes som Ingen aktivitet. Med henvisning til tabel 1, sojabønner, både økologiske og ikke-økologiske, screenet ved høje aktivitetsniveauer, mens alle andre frugt- og grøntsagsartikler ikke registrerede nogen aktivitet. En sammenligning af sojabønneresultaterne med standardkurven (figur 1) viser, at uanset om de dyrkes organisk eller ej, scorer de højt fra kurven for østradiolaktivitetsniveauer ved denne koncentration. Sojabønneekstrakt, en kendt potent kilde til isoflavonerne daidzein og genistein9, blev yderligere brugt til at bestemme fortyndingen, der gav et 50% signal til maksimum (Figur 2). Dette ekstrakt kræver 422 gange mere fortynding for at producere halvdelen af signalet i vores standard fortyndingsprotokol.

Fremstil vare Økologisk/ikke-økologisk Relative lysenheder (Lum) Fold aktivering Fold aktivering (middelværdi) Phytoøstrogen Aktivitet
Sojabønner Økologisk 1687 29.016 31.06 Høj
2023 34.796
1706 29.353
Sojabønner Ikke-økologisk 2041 35.106 32.05 Høj
1956 33.647
1593 27.399
Sne ærter Ikke-økologisk 53 0.919 0.92 Ingen aktivitet
59 1.015
49 0.836
Snap ærter Ikke-økologisk 66 1.142 1.21 Ingen aktivitet
60 1.032
85 1.462
Majs Ikke-økologisk 29 0.502 0.53 Ingen aktivitet
30 0.513
33 0.575
Jordbær Ikke-økologisk 35 0.609 0.77 Ingen aktivitet
47 0.808
51 0.884
Jordbær Økologisk 56 0.956 0.88 Ingen aktivitet
59 1.015
39 0.678
Banan Økologisk 32 0.544 0.52 Ingen aktivitet
28 0.489
31 0.533
Banan Ikke-økologisk 33 0.564 0.60 Ingen aktivitet
41 0.712
31 0.533
Vejbred Ikke-økologisk 37 0.64 0.70 Ingen aktivitet
39 0.667
47 0.805
Grønkål Økologisk 26 0.447 0.47 Ingen aktivitet
26 0.444
30 0.519
Grønkål Ikke-økologisk 40 0.685 0.63 Ingen aktivitet
28 0.485
42 0.719
Kål Økologisk 33 0.568 0.54 Ingen aktivitet
27 0.468
34 0.588
Kål Ikke-økologisk 44 0.757 0.66 Ingen aktivitet
34 0.585
36 0.626
Apple Økologisk 30 0.523 0.49 Ingen aktivitet
25 0.437
30 0.509
Apple Ikke-økologisk 41 0.705 0.62 Ingen aktivitet
31 0.53
37 0.63
Tomat Økologisk 51 0.874 0.87 Ingen aktivitet
57 0.974
44 0.76
Tomat Ikke-økologisk 61 1.056 1.19 Ingen aktivitet
81 1.386
66 1.128
Gulerod Økologisk 33 0.575 0.51 Ingen aktivitet
33 0.561
22 0.382
Gulerod Ikke-økologisk 31 0.53 0.52 Ingen aktivitet
21 0.365
38 0.657
Fig Ikke-økologisk 29 0.506 0.61 Ingen aktivitet
42 0.716
36 0.619
Datoer Ikke-økologisk 29 0.495 0.59 Ingen aktivitet
39 0.667
35 0.602

Tabel 1. Repræsentative resultater af ERβ Reporter Assay System til screening af frugt- og grøntsagsartikler til fytoøstrogenaktivitet. Positiv aktivitet angives med Høj, Med, Lav eller Ingen aktivitet.

Figure 1
Figur 1. Seriel fortynding af 17β-Østradiol-standard (standard 1 til 8 koncentrationer = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 og 0 pM) ved hjælp af ERβ Reporter Assay System. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. ERβ Reporter Assay ved hjælp af en seriel fortynding af sojabønneekstrakt for at bestemme fortyndingen, der gav et signal-til-baggrund-forhold, der er 50% af det maksimale signal. Fra standardekstraktionsmetoden, der opløser planteekstraktet i dimethylsulfoxid (DMSO) i en koncentration på 0,1 g ekstrakt til 2 mL DMSO, skal sojabønner fortyndes 422 gange for at fremkalde et signal 50% af den maksimale respons. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ERβ reporter assay udviklet til individuelt screene farmaceutiske agenser er også egnet til screening plantefødevarer for fytoøstrogener biologisk aktive gennem ERβ. Vigtige overvejelser i protokollen omfatter behandling af planteprøverne med omhu: Frisk plantemateriale skal tørres hurtigt for at forhindre støbning eller anden biologisk nedbrydning, og det skal holdes væk fra lys for at forhindre fotolyse af forbindelserne18. Analysen protokol12 fra producenten er klar og har brug for meget få ændringer til screening formål. Den standardkurve, som producenten har foreslået, er blevet ændret i denne protokol for at øge antallet af punkter, der falder i kurvens eksponentielle område (figur 1), samtidig med at top- og bundplateauerne bevares. Det er muligt at bruge denne analyse til kvantitativ analyse, men vores formål er at forbinde planter med høj aktivitet til biologiske virkninger, valg af mad og anden adfærd hos de dyr, der forbruger dem.

For yderligere at illustrere effektiviteten af ekstraktion og analyse inkluderede vi en dosisresponskurve med sojabønneekstrakt (figur 2) og fastslog, at soja i betragtning af styrken af den normale ekstraktionsprotokol skal fortyndes meget, før signalet falder til 50% maksimum. Dette understreger det faktum, at signalplateauerne ved høje koncentrationer af fytoøstrogener ved et stabilt maksimalt signal. Ved meget lave koncentrationer er signalet måske ikke stærkt nok til at kunne skelnes fra baggrunden. Det er vigtigt at arbejde med høje koncentrationer af ekstrakter for at opdage fytoøstrogener, der er til stede i små mængder i en prøve, hvilket minimerer falske negativer. I første omgang anvendte laboratoriet en større mængde DMSO i forhold til planteresterne fra methanoludvindingen (dvs. 10 mL DMSO til 0,1 g planterester). Prøverne var for fortyndede til at fremkalde en stærk luminescens i positive prøver. På grund af en maksimal DMSO-procentdel for reportercelles levedygtighed og volumenbegrænsninger i brøndene på pladen skal koncentrationen af prøveekstrakt optimeres, når der tilsættes DMSO til planteresterne. En positiv kontrol som soja bør medtages på hver plade for at bekræfte, at cellerne er levedygtige og i stand til luminescens, og at ekstraktkoncentrationen er tilstrækkelig til at fremkalde et respons.

Denne analyse registrerer forbindelser, der binder sig til ERβ, men ikke alle fytoøstrogener har samme virkningsmekanisme. Denne analyseprotokol kan ændres ved at inkubere cellerne med en kombination af østradiol og planteforbindelserne for at detektere , om der er antiestrogenaktivitet i en prøve9,12. Østradiol har stor affinitet til ER, så tilstedeværelsen af fytoøstrogener kan have antiøstrogen biologisk aktivitet i nærværelse af østradiol ved at blokere receptorerne, hvilket reducerer reaktionen på østrogener. Antiøstrogen aktivitet ville blive opdaget ved en reduktion i den samlede aktivering med stigende koncentration af planteekstrakt. Denne analyse vil ikke opdage andre virkningsmetoder, såsom binding til membranbundne ER'er19. Desuden er nogle fytoøstrogener ikke biologisk aktive, før de er blevet metaboliseret af tarmmikrober20. Det er muligt, at nogle planter, der ikke har nogen eller lav østrogen aktivitet i deres ikke-metaboliserede tilstand har højere østrogen aktivitet efter metabolisering, at denne analyse ikke ville opdage.

ERβ reporter assay er blevet valgt til at eksemplificere screening af fytoøstrogener for aktivitet i planter, fordi fytoøstrogener konkurrerer om binding med østradiol stærkere til ERβ end de gør til ERα21. Screening for ERα-aktivitet er mulig gennem en lignende analyse, hvor cellerne transs smittes med ERα-genet i stedet for ERβ.

Efter en positiv screening for aktive fytoøstrogener kan de aktive forbindelser identificeres med kromatografimetoder. På det tidspunkt kan de isolerede forbindelser testes ved hjælp af denne analyse, og de halve maksimale effektive koncentrationer (EF50) kan bestemmes ved hjælp af en fortyndingsserie som et mål for forbindelsens styrke.

Denne analyse er en pålidelig og enkel måde at teste for biologisk østrogen aktivitet, idet man tager hensyn til dens begrænsninger i bredden af mekanismer for østrogen aktivitet. Det har flere forbedringer i forhold til forbigående transfekt assays, især brugervenlighed, stabiliteten af cellerne, og følsomheden af analysen.

Der vides ikke meget om forekomsten af fytoøstrogener i vilde plantefødevarer, der indtages af mennesker eller vilde dyr22, men undersøgelser viser , at eksponering for østrogene PSM'er i kosten kan have langvarige virkninger23. At have en simpel robust analyse, der registrerer disse forbindelser, sammen med undersøgelser, der vurderer de mængder, der spises, og når de spises, er et stærkt skridt i fastsættelsen af funktionen af at inkludere østrogene fødevarer i kosten og virkningerne af disse forbindelser på fysiologiske systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfattere er taknemmelige for Dale Leitman for grunduddannelse i brug af forbigående forbigående assays at bestemme østrogen aktivitet primat plantefødevarer. Tak til Bradford Westrich og C. Eric Johnson for at hjælpe med at oprette laboratorieudstyr og uddanne studerende i ekstraktionsmetoder. Endelig tak til Indiana University for at finansiere denne forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL pipette
20 µL pipette
200 µL pipette
37 ° water bath
37 °, humidified 5% CO2 incubator
70% ethanol
analytical balance
cell culture-rated laminar flow hood
dimethyl sulfoxide
disposable media basin, sterile
drip filtration system
Erlenmeyer flasks 125 mL and 250 mL
HPLC grade methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays Indigo Biosciences IB00411 Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve
lyophilizer
multi-channel pipette
orbital shaker
plate-reading luminometer ex. Bioteck Synergy HTX
rotory evaporator
round bottom flasks 50 mL and 300 mL
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins
sterile tips 200 µL and 1000 µL
Whatman grade 1 paper
whirl-pak bags sterile polyethylene bags

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
  2. Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
  3. DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
  4. Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
  5. Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
  6. Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
  7. Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
  8. Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
  9. Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
  10. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  11. Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
  12. Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
  13. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
  14. Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
  15. Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
  16. Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
  17. Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
  18. Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
  19. Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
  20. Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
  21. Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
  22. Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
  23. Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).

Tags

Biokemi Plant sekundære forbindelser Phytosteroid østrogen aktivitet Planteædende Miljø endokrinologi Østradiol
Screening for fytoøstrogener ved hjælp af en cellebaseret østrogenreceptor β Reporter Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chester, E. M., Fender, E.,More

Chester, E. M., Fender, E., Wasserman, M. D. Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor β Reporter Assay. J. Vis. Exp. (160), e61005, doi:10.3791/61005 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter