Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61005

Summary

We hebben geoptimaliseerd een commercieel beschikbare oestrogeen receptor β reporter test voor het screenen van menselijk en niet-menselijk primaat voedsel voor oestrogene activiteit. We valideerden deze test door aan te tonen dat de bekende oestrogene soja voor menselijke voeding hoog registreert, terwijl andere voedingsmiddelen geen activiteit vertonen.

Abstract

Planten zijn een bron van voedsel voor veel dieren en ze kunnen duizenden chemicaliën produceren. Sommige van deze verbindingen beïnvloeden fysiologische processen in de gewervelde dieren die ze consumeren, zoals endocriene functie. Fyto-oestrogenen, de meest bestudeerde endocriene actieve fytochemicaliën, interageren direct met de hypothalamo-hypofyse gonadale as van het gewervelde endocriene systeem. Hier presenteren we het nieuwe gebruik van een celgebaseerde test om plantenextracten te screenen op de aanwezigheid van verbindingen die oestrogene biologische activiteit hebben. Deze test maakt gebruik van zoogdiercellen die zijn ontworpen om oestrogeenreceptor bèta (ERβ) sterk uit te drukken en die zijn getransfecteerd met een luciferase-gen. Blootstelling aan verbindingen met oestrogene activiteit resulteert in de cellen die licht produceren. Deze test is een betrouwbare en eenvoudige manier om te testen op biologische oestrogene activiteit. Het heeft verschillende verbeteringen ten opzichte van voorbijgaande transfectietests, met name het gebruiksgemak, de stabiliteit van de cellen en de gevoeligheid van de test.

Introduction

Planten zijn een noodzakelijke bron van voedsel voor veel dieren en leveren calorieën en voedingsstoffen die van cruciaal belang zijn voor overleving, voortplanting, groei, ontwikkeling en gedrag1. Planten produceren duizenden chemicaliën, veel als aanpassingen voor hun eigen groei, stomatisch onderhoud en reproductie. Andere verbindingen, beschouwd als secundaire metabolieten (PSM's) van planten, hebben functies die minder duidelijk zijn, hoewel sommige giftig zijn en waarschijnlijk worden gebruikt als verdediging tegen herbivoren en parasitisme (bijv. alkaloïden, tannines)2,3. Sommige van deze chemische stoffen hebben het vermogen om fysiologische processen op lange termijn bij dieren te beïnvloeden, zoals endocriene werking, hoewel waarom deze endocriene actieve fytochemicaliën interageren met het gewervelde endocriene systeem nog steeds onduidelijk is2,4.

Fyto-oestrogenen, de meest bestudeerde endocriene actieve fytochemicaliën, zijn polyfenolische PSM's die structureel en functioneel oestrogenen nabootsen, direct interagerend met de hypothalomo-hypofyse gonadale as van het gewervelde endocriene systeem5. Inname van fyto-oestrogenen in het menselijke dieet wordt geassocieerd met bescherming tegen sommige kankers, hartaandoeningen en menopauzesymptomen, hoewel andere effecten vruchtbaarheidsproblemen omvatten. In feite werden de fysiologische effecten van deze verbindingen ontdekt in de jaren 1940 toen onvruchtbaarheid bij schapen werd toegeschreven aan hun begrazing op fyto-oestrogeenrijke klaver (Trifolium subterrareum)6. Bij inname kunnen fyto-oestrogenen in cellen overgaan en de effecten van oestrogeen nabootsen. Hoewel fyto-oestrogenen negatieve effecten hadden op de vruchtbaarheid van schapen, is de relatie tussen fyto-oestrogenen en fysiologie niet eenvoudig. Net als schapen vertonen zuidelijke witte neushoorns gevoeligheid voor oestrogene verbindingen in voer afkomstig van grote hoeveelheden soja en luzerne. Dochters van vrouwen die dit dieet tijdens de zwangerschap krijgen, hebben minder kans om zich voort te planten7. Andere studies hebben echter aangetoond dat fyto-oestrogenen ook positieve effecten kunnen hebben, waaronder rijping van eierstokfollikels bij oudere muizen8, preventie van bepaalde kankers, antioxiderende activiteit en antiproliferatieve effecten9.

De breedte van de effecten van fyto-oestrogenen is niet verrassend, aangezien oestrogenen een breed scala aan biologische functies beïnvloeden, waaronder groei, ontwikkeling en regulering van het voortplantings- en centrale zenuwstelsel10. Hoewel er veel werkingsmechanismen zijn, hebben fyto-oestrogenen vaak het vermogen om oestrogeensignalering te wijzigen, te verbeteren of te verstoren door hun vermogen om te fungeren als liganden voor de intranucleaire oestrogeenreceptoren alfa en bèta (ERα en ERβ). Veel fyto-oestrogenen hebben een fenolische ringstructuur vergelijkbaar met oestrogenen waarmee ze oestrogeenreceptoren kunnen binden. Degenen met agonistische oestrogene activiteit functioneren zoals oestrogeen en vormen een geactiveerd ER-ligandcomplex dat kan dimmen en binden aan een oestrogeenresponselement (ERE) en gentranscriptie kan activeren11. Zo reguleren oestrogenen en fyto-oestrogenen celactiviteit en systeemfuncties door hun acties als transcriptiefactoren.

Hier presenteren we het nieuwe gebruik van een celgebaseerde test om plantenextracten te screenen op de aanwezigheid van verbindingen die oestrogene biologische activiteit hebben. Deze test maakt gebruik van Chinese hamster eierstok CHO cellen ontworpen om zeer express ERβ, die zijn getransfecteerd met de vuurvlieg (Photinus pyralis) luciferase gen gekoppeld aan een ERE promotor12. Wanneer oestrogene verbindingen aanwezig zijn, binden ze zich aan de ER, dimmen ze en binden ze zich aan de ERE, wat leidt tot transcriptie van het luciferase-gen. Bij toevoeging van een substraatoplossing katalyseert de luciferase een reactie die leidt tot fotonuitstoot. Daarom produceren positieve monsters lichte en negatieve monsters niet.

Deze commercieel beschikbare test elimineert de noodzaak voor laboratoria om de zoogdiercellen te transfecteren met het reporter-gen en oestrogeenreceptor13,14, die onstabiel en variabel was in werkzaamheid. De test biedt een stabiel transfectieplatform waarmee snel en eenvoudig kan worden bepaald of een plant oestrogene activiteit heeft via receptorbinding.

We testen de hypothese dat sojabonen een hogere oestrogene activiteit hebben dan alle andere voedingsmiddelen gezien hun bekende concentraties oestrogene isoflavonen15 met behulp van menselijk voedsel van lokale kruideniers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van plantaardige materialen

  1. Vries droge plantitems in die vers zijn verzameld met behulp van een lyofiel.
    1. Om monsters te beschermen tegen licht, dek kamers af met aluminiumfolie tijdens het droogproces.
    2. Om ervoor te zorgen dat monsters volledig droog zijn, lyophiliseer totdat kamers niet langer koud aanvoelen om aan te raken en plantaardige materialen geen massa meer verliezen wanneer ze worden gewogen.
    3. Bewaar gedroogde planten in steriele zakken met weinig residu bij afwezigheid van licht tot het malen.
  2. Slijp monsters fijn met behulp van een slijpmolen met 0,85 mm gaasscherm.
    1. Bewaar de grondmonsters in de zakken bij afwezigheid van licht tot de extractie.

2. Extractie van secundaire metabolieten van planten

  1. Om de secundaire plantmetabolieten te extraheren, gebruikt u een verhouding van 1 g gedroogd monster tot 10 ml HPLC-kwaliteit methanol.
    1. Weeg het monster af op een analytische balans en voeg het toe aan een erlenmeyer van de juiste grootte (125 – 250 ml). Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid methanol toe. Noteer de massa van het geëxtraheerde monster.
    2. Bedek de plant-methanoloplossing met aluminiumfolie en draai vervolgens gedurende 3 dagen met 100 tpm snelheid bij kamertemperatuur (RT) op een orbitale shaker, waardoor de potentieel oestrogene verbindingen in het methanol kunnen oplossen.
    3. Decanteer het supernatant met filterpapier (125 mm) in een druppelfiltratiesysteem.
    4. Droog met behulp van een roterende verdamper het plantenextract totdat het monster is verdikt, maar gietbaar, in een kolf met ronde bodem van 300 ml. Giet het monster in een kolf met ronde bodem van 50 ml en spoel de grote kolf af met een kleine hoeveelheid methanol. Blijf het monster in de kleine kolf drogen totdat de methanol volledig is verdampt.
    5. Weeg het monsterresidu af met behulp van een analytische balans. Residumassa registreren.
    6. Los het plantenextract op in dimethylsulfoxide (DMSO) bij een concentratie van 0,1 g extract tot 2 ml DMSO. Vortex tot het gehomogeniseerd is.
    7. Bewaar de plantextract-DMSO-oplossing bij 4 °C in amberkleurige glazen flacons tot de test.

LET OP: Planten kunnen onbekende biologisch actieve chemicaliën produceren en DMSO is een voertuig dat ze over celmembranen kan transporteren. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en zorg bij het hanteren van deze monsters.

3. Menselijke oestrogeenreceptor β transfectietest12

OPMERKING: Voor dag 1 van het testprotocol is een aseptische techniek en een laminaire stroomkap vereist.

  1. Bereid verdunningen van 17β-Estradiol voor op de standaardcurve.
    1. Breng het Cell Recovery Medium and Compound Screening Medium (CSM) over uit de vriesopslag en ontdooi in een waterbad van 37 °C.
    2. Label microcentrifuge buizen Intermediate 1 en 2 (INT1, INT2) en 1-8.
    3. Vul INT1 met 995 μL CSM, INT2 met 615 μL CSM, buis 1 met 900 μL CSM en buizen 2-8 met 600 μL CSM. Zet buis 8 opzij.
    4. Breng 5 μL van 100 μM 17β-Estradiol Stock over in INT1. Gooi de punt weg. Vortex.
    5. Spoel voor elke overdracht pipet 3 keer en breng vervolgens 10 μL over van INT1 naar INT2. Gooi de punt weg.
    6. Spoel pipet 3 keer en breng vervolgens 100 μL van INT2 over in buis 1. Gooi de tip weg. Breng 300 μL van buis 1 over in buis 2. Herhaal dit voor de buizen 3 tot en met 7. Gooi 300 μL uit buis 7 weg in de afvalcontainer. Buis 8 is een Nul en ontvangt geen estradiol. De uiteindelijke concentraties van geplateerde normen zijn: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 en 0 pM estradiol.
  2. Bereid monsterverbindingen voor.
    1. Vortex monsters.
    2. Neem 4 μL van elk plantenmonster in DMSO en voeg toe aan 496 μL CSM om een 0,8% DMSO-oplossing op te leveren.
  3. Ontdooi snel Reporter Cells.
    1. Haal de buis van Cell Recovery Medium uit het waterbad van 37 °C. Desinfecteer het buitenoppervlak met 70% ethanol.
    2. Haal Reporter Cells op uit -80 °C opslag en dooi door 10 ml van de voorverwarmde CRM over te brengen in de buis van bevroren cellen.
    3. Sluit de buis van Reporter Cells en breng over naar een waterbad van 37 °C gedurende 5-10 minuten.
    4. Haal de tube Reporter Cell Suspension uit het waterbad. Keer de buis van cellen meerdere keren voorzichtig om om aggregaten van cellen te breken en een homogene suspensie te produceren. Reinig het oppervlak van de buis met 70% ethanol.
  4. Assay plating
    1. Doseer 100 μL van de Reporter Cell Suspension in elke put met behulp van een multichannel pipet.
    2. Doseer 100 μL monsters in drievoud in geschikte testputten.
    3. Breng de plaat gedurende 22-24 uur over in een 37 °C, bevochtigde5% CO 2 incubator.
  5. Ontdooi detectiesubstraat en detectiebuffer 's nachts in een donkere koelkast ter voorbereiding op dag 2.
  6. Verwijder vlak voor het einde van de plaatincubering het detectiesubstraat en de detectiebuffer uit de koelkast en plaats deze in een gebied met weinig licht totdat u in evenwicht bent met RT. Eenmaal bij RT, draai elke buis voorzichtig meerdere keren om om oplossingen grondig te mengen.
    1. Vlak voordat de incubatie is voltooid, giet de volledige inhoud van de detectiebuffer in de buis van detectiesubstraat om Luciferase Detection Reagent te maken. Meng voorzichtig om geen schuim te produceren.
    2. Zodra de incubatie is voltooid, draait u de plaat om om inhoud in een geschikte afvalcontainer te gooien. Tik voorzichtig op de plaat op een schone absorberende keukenpapier om de laatste druppels uit de putten te verwijderen.
    3. Voeg 100 μL van het Luciferase Detection Reagens toe aan elke put. Laat de testplaat 15 minuten rusten bij RT. Schud de plaat niet.
  7. Kwantificeer luminescentie met behulp van een 96-put plaat-lezen luminometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tweeëntwintig extracten van groenten en fruit die vaak in menselijke diëten worden gevonden, werden gescreend op de aanwezigheid van oestrogene verbindingen. Een verscheidenheid aan voedingsmiddelen werd onderzocht, waaronder peulvruchten, zoals sojabonen, peultjes en snaperwten, omdat de erwtenfamilie een bekende bron is van fyto-oestrogenen16, evenals vijgen, dadels, maïs, wortels, appels, bananen, aardbeien, tomaat, boerenkool en kool. Hormoonontregelende verbindingen worden aangetroffen in gemeenschappelijke stoffen (bv. kunststoffen en pesticiden) en sommige zijn biologisch actief via ERs17. Indien mogelijk werden zowel biologische als niet-anorganisch geteelde producten onderzocht om rekening te houden met de mogelijkheid dat pesticiden met oestrogene activiteit de resultaten hadden kunnen beïnvloeden.

Elk plantaardig voedselartikel was in drievoud geplateerd en de luminometer rapporteerde de activiteit van elke put in Relatieve Lichteenheden (UTU's). Achtergrondniveaus van RDU's worden bepaald in de standaardcurve met standaard 8, de nulconcentratie, en gebruikt voor referentie.  De vouwactiveringswaarde, de vermenigvuldigingsfactor boven de RLU voor het nulpunt op de curve, wordt berekend door de vergelijking:

Vouwactivering = Onbekend (RLU) ÷ Standaard 8 (RLU)

Voor interpretatieve doeleinden wordt oestrogene activiteit gepresenteerd op een ordinale, kwalitatieve manier van High, Med, Low of No Activity. Hoge niveaus van activiteit registreren boven de Standaard 4 voudige activeringswaarde. Medium valt tussen Standaard 5 en Standaard 4, en Lage waarden liggen tussen Standaard 6 en Standaard 5. Monsters met vouwactiveringswaarden onder standaard 7 worden beschouwd als geen activiteit. Onder verwijzing naar tabel 1worden sojabonen, zowel biologische als niet-biologische, gescreend op een hoog activiteitsniveau, terwijl alle andere groente- en fruitproducten geen activiteit registreerden. Het vergelijken van sojabonenresultaten met de standaardcurve (figuur 1) toont aan dat ze, al dan niet organisch geteeld, hoog scoren op estradiolactiviteitsniveaus in deze concentratie. Soja-extract, een bekende krachtige bron van de isoflavonen daidzein en genistein9, werd verder gebruikt om de verdunning te bepalen die een signaal van 50% tot het maximum opleverde (figuur 2). Dit extract vereist 422 keer meer verdunning om de helft van het signaal van ons standaard verdunningsprotocol te produceren.

Artikel produceren Biologisch/ Niet-biologisch Relatieve lichteenheden (Lum) Vouwactivering Vouwactivering (gemiddeld) Fyto-oestrogeenactiviteit
Sojabonen Organische 1687 29.016 31.06 Hoge
2023 34.796
1706 29.353
Sojabonen Niet-biologisch 2041 35.106 32.05 Hoge
1956 33.647
1593 27.399
De Erwten van de sneeuw Niet-biologisch 53 0.919 0.92 Geen activiteit
59 1.015
49 0.836
Snap Erwten Niet-biologisch 66 1.142 1.21 Geen activiteit
60 1.032
85 1.462
Maïs Niet-biologisch 29 0.502 0.53 Geen activiteit
30 0.513
33 0.575
Aardbei Niet-biologisch 35 0.609 0.77 Geen activiteit
47 0.808
51 0.884
Aardbei Organische 56 0.956 0.88 Geen activiteit
59 1.015
39 0.678
Banaan Organische 32 0.544 0.52 Geen activiteit
28 0.489
31 0.533
Banaan Niet-biologisch 33 0.564 0.60 Geen activiteit
41 0.712
31 0.533
Weegbree Niet-biologisch 37 0.64 0.70 Geen activiteit
39 0.667
47 0.805
Boerenkool Organische 26 0.447 0.47 Geen activiteit
26 0.444
30 0.519
Boerenkool Niet-biologisch 40 0.685 0.63 Geen activiteit
28 0.485
42 0.719
Kool Organische 33 0.568 0.54 Geen activiteit
27 0.468
34 0.588
Kool Niet-biologisch 44 0.757 0.66 Geen activiteit
34 0.585
36 0.626
Apple Organische 30 0.523 0.49 Geen activiteit
25 0.437
30 0.509
Apple Niet-biologisch 41 0.705 0.62 Geen activiteit
31 0.53
37 0.63
Tomaat Organische 51 0.874 0.87 Geen activiteit
57 0.974
44 0.76
Tomaat Niet-biologisch 61 1.056 1.19 Geen activiteit
81 1.386
66 1.128
Wortel Organische 33 0.575 0.51 Geen activiteit
33 0.561
22 0.382
Wortel Niet-biologisch 31 0.53 0.52 Geen activiteit
21 0.365
38 0.657
Fig Niet-biologisch 29 0.506 0.61 Geen activiteit
42 0.716
36 0.619
Datums Niet-biologisch 29 0.495 0.59 Geen activiteit
39 0.667
35 0.602

Tabel 1. Representatieve resultaten van het ERβ Reporter Assay System voor de screening van groente- en fruitproducten op fyto-oestrogeenactiviteit. Positieve activiteit wordt aangegeven door High, Med, Low of No Activity.

Figure 1
Figuur 1. Seriële verdunning van 17β-Estradiol standaard (standaard 1 tot en met 8 concentraties = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 en 0 pM, respectievelijk) met behulp van het ERβ Reporter Assay System. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. De ERβ Reporter Assay met behulp van een seriële verdunning van soja-extract om de verdunning te bepalen die een signaal-achtergrondverhouding opleverde die 50% van het maximale signaal is. Van de standaard extractiemethode die het plantenextract in dimethylsulfoxide (DMSO) oplost bij een concentratie van 0,1 g extract tot 2 ml DMSO, moet sojabonen 422 keer worden verdund om een signaal van 50% van de maximale respons op te wekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ERβ-reportertest die is ontwikkeld om farmaceutische agentia individueel te screenen, is ook geschikt voor het screenen van plantaardig voedsel op fyto-oestrogenen die biologisch actief zijn via de ERβ. Belangrijke overwegingen in het protocol zijn onder meer het voorzichtig behandelen van de plantenmonsters: vers plantmateriaal moet snel worden gedroogd om schimmelvorming of andere biologische afbraak te voorkomen, en het moet uit de buurt van licht worden gehouden om fotolyse van de verbindingen te voorkomen18. Het door de fabrikant verstrekte testprotocol12 is duidelijk en heeft zeer weinig wijzigingen nodig voor screeningsdoeleinden. De standaardcurve die door de fabrikant wordt voorgesteld, is in dit protocol gewijzigd om het aantal punten te verhogen dat in het exponentiële bereik van de curve valt (figuur 1), met behoud van de bovenste en onderste plateaus. Het is mogelijk om deze test te gebruiken voor kwantitatieve analyse, maar ons doel is om planten met hoge activiteit te associëren met biologische effecten, voedselkeuze en ander gedrag bij de dieren die ze consumeren.

Om de effectiviteit van de extractie en test verder te illustreren, hebben we een dosisresponscurve met soja-extract opgenomen (figuur 2) en vastgesteld dat, gezien de potentie van het normale extractieprotocol, soja uitgebreid moet worden verdund voordat het signaal tot maximaal 50% daalt. Dit benadrukt het feit dat bij hoge concentraties fyto-oestrogenen de signaalplateaus op een stabiel maximumsignaal staan. Bij zeer lage concentraties is het signaal mogelijk niet sterk genoeg om van de achtergrond te worden onderscheiden. Het is belangrijk om te werken met hoge concentraties extracten, om fyto-oestrogenen aanwezig in lage hoeveelheden in een monster te detecteren, het minimaliseren van valse negatieven. Aanvankelijk gebruikte het laboratorium een groter volume DMSO ten opzichte van het plantenresidu van de methanolextractie (d.w.z. 10 ml DMSO tot 0,1 g plantenresidu). De monsters waren te verdund om een sterke luminescentie in positieve monsters te induceren. Vanwege een maximaal DMSO-percentage voor de levensvatbaarheid van de reportercellen en volumebeperkingen in de putten op de plaat, moet de concentratie van monsterextracten worden geoptimaliseerd bij het toevoegen van DMSO aan de plantenresiduen. Een positieve controle zoals soja moet op elke plaat worden opgenomen om te bevestigen dat cellen levensvatbaar zijn en in staat zijn tot luminescentie, en dat de extractconcentratie voldoende is om een reactie uit te lokken.

Deze test detecteert verbindingen die zich binden aan ERβ, maar niet alle fyto-oestrogenen hebben hetzelfde werkingsmechanisme. Dit testprotocol kan worden gewijzigd door de cellen te incuberen met een combinatie van oestradiol en de plantaardige verbindingen om te detecteren of er anti-oestrogeenactiviteit is in een monster9,12. Oestradiol heeft grote affiniteit met ER, dus de aanwezigheid van fyto-oestrogenen kan anti-oestrogene biologische activiteit hebben in de aanwezigheid van oestradiol door de receptoren te blokkeren, wat de reactie op oestrogenen vermindert. Anti-oestrogene activiteit zou worden gedetecteerd door een vermindering van de totale activering met toenemende concentratie plantenextract. Deze test detecteert geen andere werkingsmethoden, zoals binding aan membraangebonden EPD 's19. Bovendien zijn sommige fyto-oestrogenen niet biologisch actief totdat ze zijn gemetaboliseerd door darmmicroben20. Het is mogelijk dat sommige planten die geen of lage oestrogene activiteit in hun ongemetaboliseerde toestand hebben hogere oestrogene activiteit na metabolisatie die deze test niet zou detecteren.

De ERβ-reportertest is gekozen om een voorbeeld te zijn van de screening van fyto-oestrogenen op activiteit in planten, omdat fyto-oestrogenen concurreren om zich sterker aan ERβ te binden dan aan ERα21. Screening op ERα-activiteit is mogelijk door middel van een vergelijkbare test, waarbij de cellen worden getransfecteerd met het ERα-gen in plaats van ERβ.

Na een positieve screening op actieve fyto-oestrogenen kunnen de actieve verbindingen worden geïdentificeerd met chromatografiemethoden. Op dat moment kunnen de geïsoleerde verbindingen met deze test worden getest en kunnen de halfmaximaal effectieve concentraties (EC50) worden bepaald met behulp van een verdunningsreeks als maat voor de potentie van de verbinding.

Deze test is een betrouwbare en eenvoudige manier om te testen op biologische oestrogene activiteit, rekening houdend met de beperkingen ervan in de breedte van mechanismen van oestrogene activiteit. Het heeft verschillende verbeteringen ten opzichte van voorbijgaande transfectietests, met name het gebruiksgemak, de stabiliteit van de cellen en de gevoeligheid van de test.

Er is weinig bekend over de prevalentie van fyto-oestrogenen in wilde plantaardige voedingsmiddelen die door mensen of wilde dieren worden geconsumeerd22, maar studies tonen aan dat blootstelling aan oestrogene PSM 's in voeding langdurige effecten kan hebben23. Het hebben van een eenvoudige robuuste test die deze verbindingen detecteert, in combinatie met studies die de gegeten hoeveelheden beoordelen en wanneer ze worden gegeten, is een krachtige stap in het bepalen van de functie van het opnemen van oestrogene voedingsmiddelen in het dieet en de effecten van deze verbindingen op fysiologische systemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Auteurs zijn Dale Leitman dankbaar voor de initiële training in het gebruik van voorbijgaande transfectietests om oestrogene activiteit van primatenplantaarde te bepalen. Met dank aan Bradford Westrich en C. Eric Johnson voor het helpen opzetten van laboratoriumapparatuur en het trainen van studenten in extractiemethoden. Tot slot, bedankt aan de Indiana University voor het financieren van dit onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL pipette
20 µL pipette
200 µL pipette
37 ° water bath
37 °, humidified 5% CO2 incubator
70% ethanol
analytical balance
cell culture-rated laminar flow hood
dimethyl sulfoxide
disposable media basin, sterile
drip filtration system
Erlenmeyer flasks 125 mL and 250 mL
HPLC grade methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays Indigo Biosciences IB00411 Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve
lyophilizer
multi-channel pipette
orbital shaker
plate-reading luminometer ex. Bioteck Synergy HTX
rotory evaporator
round bottom flasks 50 mL and 300 mL
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins
sterile tips 200 µL and 1000 µL
Whatman grade 1 paper
whirl-pak bags sterile polyethylene bags

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
  2. Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
  3. DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
  4. Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
  5. Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
  6. Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
  7. Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
  8. Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
  9. Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
  10. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  11. Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
  12. Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
  13. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
  14. Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
  15. Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
  16. Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
  17. Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
  18. Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
  19. Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
  20. Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
  21. Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
  22. Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
  23. Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).

Tags

Biochemie Plantaardige secundaire verbindingen Fytosteroïde Oestrogene activiteit Herbivoor Milieu endocrinologie Estradiol
Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chester, E. M., Fender, E.,More

Chester, E. M., Fender, E., Wasserman, M. D. Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor β Reporter Assay. J. Vis. Exp. (160), e61005, doi:10.3791/61005 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter