Summary
Wir haben einen kommerziell erhältlichen Östrogenrezeptor β Reporter-Assays für das Screening menschlicher und nichtmenschlicher Primatennahrung auf östrogene Aktivität optimiert. Wir validierten diesen Test, indem wir zeigten, dass die bekannten östrogene soja-Lebensmittel hoch registriert sind, während andere Lebensmittel keine Aktivität aufweisen.
Abstract
Pflanzen sind eine Nahrungsquelle für viele Tiere, und sie können Tausende von Chemikalien produzieren. Einige dieser Verbindungen beeinflussen physiologische Prozesse in den Wirbeltieren, die sie verbrauchen, wie endokrine Funktion. Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, interagieren direkt mit der Hypothalamo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Systems der Wirbeltiere. Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Assay verwendet Säugetierzellen, die entwickelt wurden, um Östrogenrezeptor-Beta (ER) hoch auszudrücken und die mit einem Luziferase-Gen transfiziert wurden. Die Exposition gegenüber Verbindungen mit östrogener Aktivität führt dazu, dass die Zellen Licht produzieren. Dieser Test ist eine zuverlässige und einfache Möglichkeit, auf biologische östrogene Aktivität zu testen. Es hat mehrere Verbesserungen gegenüber transienten Transfektionstests, vor allem, Benutzerfreundlichkeit, die Stabilität der Zellen und die Empfindlichkeit des Assays.
Introduction
Pflanzen sind eine notwendige Nahrungsquelle für viele Tiere und liefern Kalorien und Nährstoffe, die für Überleben, Fortpflanzung, Wachstum, Entwicklung und Verhalten entscheidend sind1. Pflanzen produzieren Tausende von Chemikalien, viele als Anpassungen für ihr eigenes Wachstum, stomatische Wartung und Reproduktion. Andere Verbindungen, als pflanzliche Sekundärmetaboliten (PSMs), haben Funktionen, die weniger klar sind, obwohl einige toxisch sind und wahrscheinlich als Schutz gegen Kraut und Parasitismus (z. B. Alkaloide, Tannine)2,3verwendet werden. Einige dieser Chemikalien haben die Fähigkeit, langfristige physiologische Prozesse bei Tieren zu beeinflussen, wie endokrine Funktion, obwohl, warum diese endokrin-aktiven Phytochemikalien mit dem Wirbeltier endokrinsystem interagieren ist noch unklar2,4.
Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, sind polyphenolische PSMs, die Östrogene strukturell und funktionell imitieren und direkt mit der Hypothalomo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Wirbeltiersystems interagieren5. Die Einnahme von Phytoöstrogenen in der menschlichen Ernährung ist mit dem Schutz gegen einige Krebsarten, Herzerkrankungen und Wechseljahrssymptome verbunden, obwohl andere Effekte Fruchtbarkeitsprobleme umfassen. Tatsächlich wurden die physiologischen Wirkungen dieser Verbindungen in den 1940er Jahren entdeckt, als Unfruchtbarkeit bei Schafen auf ihre Beweidung auf phytoöstrogenreichem Klee (Trifolium subterrareum)6zurückgeführt wurde. Bei der Verunstaltung können Phytoöstrogene in Zellen übergehen und die Wirkung von Östrogen imitieren. Während Phytoöstrogene negative Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit von Schafen hatten, ist die Beziehung zwischen Phytoöstrogenen und Physiologie nicht einfach. Wie Schafe zeigen südliche weiße Nashörner empfindlichkeit gegenüber östrogenen Verbindungen in Futtermitteln, die aus hohen Mengen an Soja und Luzerne gewonnen werden. Töchter von Frauen, die diese Diät während der Schwangerschaft gefüttert werden, sind weniger wahrscheinlich,7zu reproduzieren. Jedoch, andere Studien haben gezeigt, dass Phytoöstrogene können auch positive Effekte haben, einschließlich reifung der Eierstockfollikel bei älteren Mäusen8, Prävention bestimmter Krebsarten, antioxidative Aktivität, und antiproliferative Effekte9.
Die Breite der Wirkung von Phytoöstrogenen sind nicht überraschend, da Östrogene eine breite Palette von biologischen Funktionen beeinflussen, einschließlich Wachstum, Entwicklung, und Regulierung der reproduktiven und zentralen Nervensysteme10. Obwohl es viele Wirkmechanismen gibt, Phytoöstrogene haben oft die Fähigkeit, Östrogen-Signalisierung durch ihre Fähigkeit, als Liganden für die intranuklearen Östrogen-Rezeptoren Alpha und Beta (ER) zu modifizieren, zu verbessern oder zu stören. Viele Phytoöstrogene haben eine phenolische Ringstruktur ähnlich wie Östrogene, die es ihnen ermöglicht, Östrogenrezeptoren zu binden. Diejenigen mit agonistischer östrogener Aktivität funktionieren wie Östrogen und bilden einen aktivierten ER-Ligand-Komplex, der an ein Östrogen-Antwortelement (ERE) dimerieren und binden kann und die Gentranskription11auslösen kann. So, Östrogene und Phytoöstrogene regulieren Zellaktivität und Systemfunktionen durch ihre Aktionen als Transkriptionsfaktoren.
Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Test verwendet chinesische Hamster-Ovarial-CHO-Zellen, die entwickelt wurden, um ER hoch auszudrücken, die mit der Galle (Photinus pyralis) Luziferase-Gen in Verbindung mit einem ERE-Promotor12transfiziert wurden. Wenn östrogene Verbindungen vorhanden sind, binden sie an den ER, dimerisieren und binden an die ERE, was zur Transkription des Luziferase-Gens führt. Nach Zugabe einer Substratlösung katalysiert die Luziferase eine Reaktion, die zur Photonenemission führt. Daher produzieren positive Proben leichte und negative Proben nicht.
Dieser kommerziell erhältliche Assay eliminiert die Notwendigkeit für Laboratorien, die Säugetierzellen mit dem Reportergen und dem Östrogenrezeptor13,14zu transfekieren, was instabil und variabel in der Wirksamkeit war. Der Assay bietet eine stabile Transfektionsplattform, die es ermöglicht, schnell und einfach zu bestimmen, ob eine Pflanze über Rezeptorbindung östrogene Aktivität hat.
Wir testen die Hypothese, dass Sojabohnen eine höhere östrogene Aktivität haben als alle anderen Lebensmittel angesichts ihrer bekannten Konzentrationen von östrogeneisofen15 mit menschlichen Lebensmitteln von lokalen Lebensmittelhändlern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von Pflanzenmaterialien
- Einfrieren von trockenen Pflanzenartikeln, die frisch mit einem Lyophilizer gesammelt wurden.
- Um Proben vor Licht zu schützen, decken Sie Kammern mit Aluminiumfolie während des Trocknungsprozesses ab.
- Um sicherzustellen, dass die Proben vollständig trocken sind, lyophilisieren, bis sich die Kammern nicht mehr kalt anfühlen und Pflanzenmaterialien beim Wiegen nicht mehr an Masse verlieren.
- Trockene Pflanzen in sterilen Säcken mit geringem Rückstand lagern, wenn bis zum Mahlen kein Licht entsteht.
- Fein schleifen von Proben mit einer Schleifmühle mit 0,85 mm Maschensieb.
- Bewahren Sie die Bodenproben in den Säcken in Abwesenheit von Licht bis zur Extraktion auf.
2. Extraktion von pflanzlichen Sekundärmetaboliten
- Um die sekundären pflanzlichen Metaboliten zu extrahieren, verwenden Sie ein Verhältnis von 1 g getrockneter Probe zu 10 ml HPLC-Methanol.
- Proben auf einer analytischen Waage wiegen und zu einem entsprechend großen Erlenmeyerkolben (125 – 250 ml) hinzufügen. Fügen Sie dann das entsprechende Volumen Methanol hinzu. Zeichnen Sie die Masse der extrahierten Probe auf.
- Bedecken Sie die Pflanzen-Methanol-Lösung mit Aluminiumfolie und drehen Sie dann 3 Tage lang bei Raumtemperatur (RT) auf einem Orbital-Shaker mit 100 Umdrehungen bei 100 Umdrehungen, sodass sich die potenziell östrogene Verbindungen in das Methanol auflösen können.
- Dekantieren Sie den Überstand mit Filterpapier (125 mm) in ein Tropffiltersystem.
- Trocknen Sie den Pflanzenextrakt mit einem Rotationsverdampfer, bis die Probe verdickt, aber gießbar ist, in einem 300 ml Rundbodenkolben. Gießen Sie die Probe in einen 50 ml Rundbodenkolben und spülen Sie den großen Kolben mit einer kleinen Menge Methanol. Trocknen Sie die Probe im kleinen Kolben weiter, bis das Methanol vollständig verdampft ist.
- Wiegen Sie den Probenrückstand mit einem analytischen Gleichgewicht. Rekordrückstandmasse.
- Den Pflanzenextrakt in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 0,1 g Extrakt auf 2 ml DMSO auflösen. Wirbel bis homogenisiert.
- Bewahren Sie die Pflanzenextrakt-DMSO-Lösung bei 4 °C in Bernsteinglasfläschchen bis zum Test auf.
VORSICHT: Pflanzen können unbekannte biologisch aktive Chemikalien herstellen, und DMSO ist ein Fahrzeug, das sie über Zellmembranen transportieren kann. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und Pflege bei der Handhabung dieser Proben.
3. Humaner Östrogenrezeptor β Transfektionstest12
HINWEIS: Aseptische Technik und eine laminare Durchflusshaube sind für Tag 1 des Assay-Protokolls erforderlich.
- Bereiten Sie Verdünnungen von 17-Estradiol für die Standardkurve vor.
- Das Cell Recovery Medium und Compound Screening Medium (CSM) aus dem Gefrierlager übertragen und in einem 37 °C-Wasserbad auftauen.
- Mikrozentrifugenrohre Zwischen- und 2 (INT1, INT2) und 1-8 beschriften.
- Füllen Sie INT1 mit 995 l CSM, INT2 mit 615 l CSM, Tube 1 mit 900 l CSM und Rohre 2-8 mit 600 l CSM. Rohr 8 beiseite stellen.
- Übertragen Sie 5 l von 100 m 17-Estradiol-Bestand in INT1. Entsorgen Sie die Spitze. Vortex.
- Vor jeder Übertragung pipette 3 mal ausspülen und dann 10 l von INT1 in INT2 übertragen. Entsorgen Sie die Spitze.
- Spülen Sie die Pipette 3 Mal, und übertragen Sie dann 100 l von INT2 in Rohr 1. Entsorgen Sie die Spitze. Übertragen Sie 300 l von Rohr 1 in Rohr 2. Wiederholen Sie dies für Rohre 3 bis 7. Entsorgen Sie 300 l aus Rohr 7 in Abfallbehälter. Tube 8 ist eine Null und erhält kein Estradiol. Die Endkonzentrationen der beschichteten Normen sind: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 und 0 pM Estradiol.
- Bereiten Sie Probenverbindungen vor.
- Vortex-Proben.
- Nehmen Sie 4 l jeder Pflanzenprobe in DMSO und fügen Sie 496 L CSM hinzu, um eine 0,8% DMSO-Lösung zu ergeben.
- Schnell auftauen Reporterzellen.
- Rufen Sie das Rohr von Cell Recovery Medium aus dem 37 °C-Wasserbad auf. Desinfizieren Sie die Außenfläche mit 70% Ethanol.
- Holen Sie Reporterzellen aus -80 °C-Speicherung ab und tauen Sie auf, indem Sie 10 ml des vorgewärmten CRM in die Röhre gefrorener Zellen übertragen.
- Schließen Sie die Röhre der Reporterzellen und übertragen Sie sie für 5-10 min in ein 37°C Wasserbad.
- Holen Sie sich die Röhre der Reporter Cell Suspension aus dem Wasserbad. Invertieren Sie das Zellrohr mehrmals vorsichtig, um Aggregate von Zellen aufzubrechen und eine homogene Suspension zu erzeugen. Reinigen Sie die Oberfläche des Rohres mit 70% Ethanol.
- Assay-Beschichtung
- Geben Sie 100 l der Reporter Cell Suspension mit einer Mehrkanalpipette in jeden Brunnen.
- Geben Sie 100 l Proben in Dreifacharbeit in geeignete Assaybrunnen.
- Übertragen Sie die Platte in einen 37 °C, befeuchtet 5% CO2-Inkubator für 22-24 h.
- Tauenerkennungssubstrat und Detektionspuffer in einem dunklen Kühlschrank über Nacht, um sich auf Tag 2 vorzubereiten.
- Kurz vor dem Ende der Platteninkubation, entfernen Sie Detektionssubstrat und Detektionspuffer aus dem Kühlschrank und legen Sie sie in einen schwachen Lichtbereich, bis sie mit RT ausgeglichen werden. Einmal bei RT, invertieren Sie jedes Rohr vorsichtig mehrmals, um Lösungen gründlich zu mischen.
- Unmittelbar vor Abschluss der Inkubation den gesamten Inhalt des Detektionspuffers in das Rohr des Erkennungssubstrats gießen, um Einfeinerungsreagenz zu erstellen. Mischen Sie sanft, um keinen Schaum zu produzieren.
- Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, invertieren Sie die Platte, um den Inhalt in einen geeigneten Abfallbehälter zu entsorgen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte auf ein sauberes, saugfähiges Papiertuch, um die letzten Tröpfchen aus den Brunnen zu entfernen.
- Fügen Sie jedem Brunnen 100 L des Luciferase Detection Reagenz hinzu. Lassen Sie die Assayplatte bei RT für 15 min ruhen. Schütteln Sie die Platte nicht.
- Quantifizieren Sie die Lumineszenz mit einem 96-Well-Plattenlese-Luminometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
22 Extrakte von Obst und Gemüse, die häufig in der menschlichen Ernährung gefunden wurden, wurden auf das Vorhandensein von östrogene Verbindungen untersucht. Eine Vielzahl von Lebensmitteln wurden assayed, einschließlich Hülsenfrüchte, wie Sojabohnen, Schneeerbsen, und Schnapserbsen, wie die Erbsenfamilie ist eine bekannte Quelle von Phytoöstrogenen16, sowie Feigen, Datteln, Mais, Karotten, Äpfel, Bananen, Erdbeeren, Tomaten, Grünkohl und Kohl. Endokrine störende Verbindungen finden sich in gängigen Substanzen (z. B. Kunststoffe und Pestizide) und einige sind biologisch durch ERs17aktiv. Wenn möglich, wurden sowohl organische als auch nicht anorganisch angebaute Produkte als mögliche Mögliche angesehen, dass Pestizide mit östrogeneaktivität die Ergebnisse beeinflusst haben könnten.
Jedes pflanzliche Lebensmittel wurde in Dreifache plattiert und das Luminometer berichtete über die Aktivität jedes Brunnens in Relative Light Units (RLUs). Die Hintergrundebenen von RLUs werden in der Standardkurve mit Standard 8, der Nullkonzentration, bestimmt und als Referenz verwendet. Der Falzaktivierungswert, der der Multiplikator über der RLU für den Nullpunkt auf der Kurve ist, wird durch die Gleichung berechnet:
Faltenaktivierung = Unbekannt (RLU) ÷ Standard 8 (RLU)
Zu Dolmetschzwecken wird die östrogene Aktivität in einer ordinalen, qualitativen Weise von High, Med, Low oder No Activity dargestellt. Hohes Aktivitätsregister über dem Standard 4-fach-Aktivierungswert. Medium fällt zwischen Standard 5 und Standard 4, und niedrige Werte liegen zwischen Standard 6 und Standard 5. Alle Proben mit Faltenaktivierungswerten unter Standard 7 werden als "Keine Aktivität" betrachtet. Unter Bezugnahme auf Tabelle 1wurden Sojabohnen, sowohl biologische als auch nichtökologische, mit hohem Aktivitätsniveau geprüft, während alle anderen Obst- und Gemüseerzeugnisse keine Tätigkeit verzeichneten. Der Vergleich der Sojabohnenergebnisse mit der Standardkurve (Abbildung 1) zeigt, dass sie bei dieser Konzentration bei Estradiol-Aktivitätsniveaus, unabhängig davon, ob sie organisch angebaut werden oder nicht, bei estradiolen Aktivitätsniveaus hoch punkten. Sojabohnenextrakt, eine bekannte potente Quelle der Isoflavone daidzein und genistein9, wurde weiter verwendet, um die Verdünnung zu bestimmen, die ein 50%-Signal zum Maximum ergibt (Abbildung 2). Dieser Extrakt benötigt 422-mal mehr Verdünnung, um die Hälfte des Signals unseres Standard-Verdünnungsprotokolls zu erzeugen.
Artikel produzieren | Bio/ Nicht-bio | Relative Lichteinheiten (Lum) | Faltenaktivierung | Faltenaktivierung (Mittelwert) | Phytoöstrogen Aktivität |
Sojabohnen | Organische | 1687 | 29.016 | 31.06 | Hoch |
2023 | 34.796 | ||||
1706 | 29.353 | ||||
Sojabohnen | Nicht-biologisch | 2041 | 35.106 | 32.05 | Hoch |
1956 | 33.647 | ||||
1593 | 27.399 | ||||
Schneeerbsen | Nicht-biologisch | 53 | 0.919 | 0.92 | Keine Aktivität |
59 | 1.015 | ||||
49 | 0.836 | ||||
Snap Erbsen | Nicht-biologisch | 66 | 1.142 | 1.21 | Keine Aktivität |
60 | 1.032 | ||||
85 | 1.462 | ||||
Mais | Nicht-biologisch | 29 | 0.502 | 0.53 | Keine Aktivität |
30 | 0.513 | ||||
33 | 0.575 | ||||
Erdbeere | Nicht-biologisch | 35 | 0.609 | 0.77 | Keine Aktivität |
47 | 0.808 | ||||
51 | 0.884 | ||||
Erdbeere | Organische | 56 | 0.956 | 0.88 | Keine Aktivität |
59 | 1.015 | ||||
39 | 0.678 | ||||
Banane | Organische | 32 | 0.544 | 0.52 | Keine Aktivität |
28 | 0.489 | ||||
31 | 0.533 | ||||
Banane | Nicht-biologisch | 33 | 0.564 | 0.60 | Keine Aktivität |
41 | 0.712 | ||||
31 | 0.533 | ||||
Wegerich | Nicht-biologisch | 37 | 0.64 | 0.70 | Keine Aktivität |
39 | 0.667 | ||||
47 | 0.805 | ||||
Kale | Organische | 26 | 0.447 | 0.47 | Keine Aktivität |
26 | 0.444 | ||||
30 | 0.519 | ||||
Kale | Nicht-biologisch | 40 | 0.685 | 0.63 | Keine Aktivität |
28 | 0.485 | ||||
42 | 0.719 | ||||
Kohl | Organische | 33 | 0.568 | 0.54 | Keine Aktivität |
27 | 0.468 | ||||
34 | 0.588 | ||||
Kohl | Nicht-biologisch | 44 | 0.757 | 0.66 | Keine Aktivität |
34 | 0.585 | ||||
36 | 0.626 | ||||
Apfel | Organische | 30 | 0.523 | 0.49 | Keine Aktivität |
25 | 0.437 | ||||
30 | 0.509 | ||||
Apfel | Nicht-biologisch | 41 | 0.705 | 0.62 | Keine Aktivität |
31 | 0.53 | ||||
37 | 0.63 | ||||
Tomaten | Organische | 51 | 0.874 | 0.87 | Keine Aktivität |
57 | 0.974 | ||||
44 | 0.76 | ||||
Tomaten | Nicht-biologisch | 61 | 1.056 | 1.19 | Keine Aktivität |
81 | 1.386 | ||||
66 | 1.128 | ||||
Karotte | Organische | 33 | 0.575 | 0.51 | Keine Aktivität |
33 | 0.561 | ||||
22 | 0.382 | ||||
Karotte | Nicht-biologisch | 31 | 0.53 | 0.52 | Keine Aktivität |
21 | 0.365 | ||||
38 | 0.657 | ||||
Feige | Nicht-biologisch | 29 | 0.506 | 0.61 | Keine Aktivität |
42 | 0.716 | ||||
36 | 0.619 | ||||
Termine | Nicht-biologisch | 29 | 0.495 | 0.59 | Keine Aktivität |
39 | 0.667 | ||||
35 | 0.602 |
Tabelle 1. Repräsentative Ergebnisse des ER-Reporter-Assay-Systems zum Screening von Obst- und Gemüseartikeln auf Phytoöstrogen-Aktivität. Positive Aktivität wird durch High, Med, Low oder No Activity angezeigt.
Abbildung 1. Serielle Verdünnung des17-Estradiol-Standards(Standard 1 bis 8 Konzentrationen = 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 bzw. 0 pM) mit dem ER-Reporter-Assay-System. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Der ER-Reporter-Assay mit einer seriellen Verdünnung des Sojabohnenextrakts, um die Verdünnung zu bestimmen, die ein Signal-Hintergrund-Verhältnis ergab, das 50% des maximalen Signals beträgt. Von der Standardextraktionsmethode, die den Pflanzenextrakt in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 0,1 g Extrakt bis 2 ml DMSO auflöst, muss Sojabohnen 422-mal verdünnt werden, um ein Signal von 50% der maximalen Reaktion zu entlocken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der eR-Reporter-Assay, der entwickelt wurde, um pharmazeutische Wirkstoffe einzeln zu überprüfen, eignet sich auch für das Screening von pflanzlichen Lebensmitteln auf Phytoöstrogene, die biologisch durch die ER aktiv sind. Wichtige Überlegungen im Protokoll sind die behandlung der Pflanzenproben mit Sorgfalt: Frisches Pflanzenmaterial muss schnell getrocknet werden, um Schimmelbildung oder anderen biologischen Abbau zu verhindern, und es muss von Licht ferngehalten werden, um eine Photolyse der Verbindungen zu verhindern18. Das vom Hersteller zur Verfügung gestellte Assay-Protokoll12 ist klar und benötigt nur sehr wenige Änderungen zu Screening-Zwecken. Die vom Hersteller vorgeschlagene Standardkurve wurde in diesem Protokoll geändert, um die Anzahl der Punkte zu erhöhen, die in den exponentiellen Bereich der Kurve fallen (Abbildung 1), wobei die oberen und unteren Plateaus erhalten bleiben. Es ist möglich, diesen Test für quantitative Analysen zu verwenden, aber unser Ziel ist es, Pflanzen mit hoher Aktivität mit biologischen Effekten, Nahrungsauswahl und anderen Verhaltensweisen bei den Tieren, die sie konsumieren, zu assoziieren.
Um die Wirksamkeit der Extraktion und des Assays weiter zu veranschaulichen, haben wir eine Dosis-Antwort-Kurve mit Sojabohnenextrakt(Abbildung 2) aufgenommen und festgestellt, dass angesichts der Wirksamkeit des normalen Extraktionsprotokolls Soja ausgiebig verdünnt werden muss, bevor das Signal auf maximal 50 % fällt. Dies unterstreicht die Tatsache, dass bei hohen Konzentrationen von Phytoöstrogenen die Signalplateaus bei einem stabilen Maximalsignal. Bei sehr niedrigen Konzentrationen ist das Signal möglicherweise nicht stark genug, um vom Hintergrund unterschieden zu werden. Es ist wichtig, mit hohen Konzentrationen von Extrakten zu arbeiten, um Phytoöstrogene in geringen Mengen in einer Probe zu erkennen, falsche Negative zu minimieren. Ursprünglich verwendete das Labor ein größeres DmSO-Volumen im Verhältnis zu den Pflanzenrückständen aus der Methanolextraktion (d. h. 10 ml DMSO bis 0,1 g Pflanzenrückstand). Die Proben waren zu verdünnt, um eine starke Lumineszenz in positiven Proben zu induzieren. Aufgrund eines maximalen DMSO-Prozentsatzes für die Lebensfähigkeit der Reporterzellen und Volumeneinschränkungen in den Brunnen auf der Platte sollte die Probenextraktkonzentration bei Zugabe von DMSO zu den Pflanzenrückständen optimiert werden. Eine positive Kontrolle wie Soja sollte auf jeder Platte enthalten sein, um zu bestätigen, dass Zellen lebensfähig und lumineszenzfähig sind und dass die Extraktkonzentration ausreicht, um eine Reaktion auszulösen.
Dieser Test detektiert Verbindungen, die an ER binden, aber nicht alle Phytoöstrogene haben den gleichen Wirkmechanismus. Dieses Assay-Protokoll kann durch Inkubation der Zellen mit einer Kombination von Estradiol und den pflanzlichen Verbindungen modifiziert werden, um zu erkennen, ob es Antiöstrogen-Aktivität in einer Probe9,12. Estradiol hat eine große Affinität zu ER, so dass das Vorhandensein von Phytoöstrogenen antiöstrogene biologische Aktivität in Gegenwart von Estradiol durch Blockierung der Rezeptoren haben kann, die die Reaktion auf Östrogene reduziert. Antiöstrogene Aktivität würde durch eine Verringerung der Gesamtaktivierung mit zunehmender Konzentration von Pflanzenextrakt nachgewiesen werden. Dieser Test erkennt keine anderen Wirkmethoden, wie z. B. die Bindung an membrangebundene ERs19. Darüber hinaus sind einige Phytoöstrogene nicht biologisch aktiv, bis sie von Darmmikroben20metabolisiert wurden. Es ist möglich, dass einige Pflanzen, die keine oder niedrige östrogene Aktivität in ihrem unmetabolisierten Zustand haben höhere östrogene Aktivität nach der Metabolisierung, die dieser Assay nicht erkennen würde.
Der ER-Reporter-Assay wurde ausgewählt, um das Screening von Phytoöstrogenen auf Aktivität in Pflanzen zu veranschaulichen, da Phytoöstrogene um die Bindung mit Estradiol stärker an ER konkurrieren als anER. Das Screening auf die ER-Aktivität ist durch einen ähnlichen Assay möglich, bei dem die Zellen mit dem ER-Gen und nicht mit ER transfiziert werden.
Nach einem positiven Screening auf aktive Phytoöstrogene können die Wirkstoffe mit Chromatographiemethoden identifiziert werden. Tatsächlich können zu diesem Zeitpunkt die isolierten Verbindungen mit diesem Test getestet werden und die halbmaximal wirksamen Konzentrationen (EC50) können anhand einer Verdünnungsreihe als Maß für die Wirksamkeit der Verbindung bestimmt werden.
Dieser Test ist eine zuverlässige und einfache Möglichkeit, auf biologische östrogene Aktivität zu testen, unter Berücksichtigung seiner Grenzen in der Breite der Mechanismen der östrogene Aktivität. Es hat mehrere Verbesserungen gegenüber transienten Transfektionstests, vor allem Benutzerfreundlichkeit, die Stabilität der Zellen und die Empfindlichkeit des Assays.
Wenig ist über die Prävalenz von Phytoöstrogenen in wilden pflanzlichen Lebensmitteln von Menschen oder wilden Tieren konsumiert22bekannt, aber Studien zeigen, dass die Exposition gegenüber östrogene PSMs in der Ernährung langanhaltende Auswirkungen haben kann23. Mit einem einfachen robusten Assay, der diese Verbindungen erkennt, in Verbindung mit Studien zur Bewertung der gegessenen Mengen und wenn sie gegessen werden, ist ein mächtiger Schritt bei der Bestimmung der Funktion der Einbeziehung östrogene Lebensmittel in die Ernährung und die Auswirkungen dieser Verbindungen auf physiologische Systeme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dale Leitman für die Erstausbildung in der Verwendung von transienten Transfektions-Assays zur Bestimmung der östrogenen Aktivität von Primatenpflanzen. Vielen Dank an Bradford Westrich und C. Eric Johnson für die Unterstützung bei der Einrichtung von Laborgeräten und der Ausbildung von Studenten in Extraktionsmethoden. Abschließend möchte ich mich bei der Indiana University für die Finanzierung dieser Forschung bedanken.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1000 µL pipette | |||
20 µL pipette | |||
200 µL pipette | |||
37 ° water bath | |||
37 °, humidified 5% CO2 incubator | |||
70% ethanol | |||
analytical balance | |||
cell culture-rated laminar flow hood | |||
dimethyl sulfoxide | |||
disposable media basin, sterile | |||
drip filtration system | |||
Erlenmeyer flasks | 125 mL and 250 mL | ||
HPLC grade methanol | |||
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays | Indigo Biosciences | IB00411 | Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve |
lyophilizer | |||
multi-channel pipette | |||
orbital shaker | |||
plate-reading luminometer | ex. Bioteck Synergy HTX | ||
rotory evaporator | |||
round bottom flasks | 50 mL and 300 mL | ||
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins | |||
sterile tips | 200 µL and 1000 µL | ||
Whatman grade 1 paper | |||
whirl-pak bags | sterile polyethylene bags |
References
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
- DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
- Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
- Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
- Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
- Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
- Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
- Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
- Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
- Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
- Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
- Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
- Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
- Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
- Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
- Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
- Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
- Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
- Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).