Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61005
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anthropology, Indiana University

Summary

יש לנו אופטימיזציה של קולטן אסטרוגן זמין מסחרית β הכתב assay עבור הקרנת מזונות פרימטים אנושיים ולא אנושיים לפעילות אסטרוגניים. אימתנו את ההסתעפות הזו בכך שהראינו שסויה ידועה של מזון אסטרוגניים רושמת גבוה, בעוד מזונות אחרים אינם מראים פעילות.

Abstract

צמחים הם מקור מזון לבעלי חיים רבים, והם יכולים לייצר אלפי כימיקלים. חלק מהתרכובות הללו משפיעות על תהליכים פיזיולוגיים בחולייתנים הצורכים אותם, כגון תפקוד אנדוקריני. Phytoestrogens, פיטוכימיקלים האנדוקרינית-פעילה הנחקרת ביותר, אינטראקציה ישירה עם ציר האשכים ההיפותלמו-יותרת המוח של המערכת האנדוקרינית החולייתנית. כאן אנו מציגים את השימוש החדשני של מבחנה מבוססת תאים כדי לסנן תמציות צמחים לנוכחות של תרכובות שיש להם פעילות ביולוגית אסטרוגניים. מבחנה זו משתמשת בתאי יונקים מהונדסים לבטא מאוד בטא קולטן אסטרוגן (ERβ) וכי כבר transfected עם גן לוציפראז. חשיפה לתרכובות עם פעילות אסטרוגניים גורמת לתאים לייצר אור. בדיקה זו היא דרך אמינה ופשוטה לבדוק פעילות אסטרוגניים ביולוגיים. יש לו מספר שיפורים על פני מבחנים חולפים חולפים, בעיקר, קלות השימוש, היציבות של התאים, ואת הרגישות של ההסתערות.

Introduction

צמחים הם מקור הכרחי של מזון עבור בעלי חיים רבים, מתן קלוריות וחומרים מזינים קריטיים להישרדות, רבייה, צמיחה, התפתחות, והתנהגות1. צמחים מייצרים אלפי כימיקלים, רבים כהתאמות לצמיחה שלהם, תחזוקה סטומטית, ורבייה. תרכובות אחרות, נחשב מטבוליטים משניים צמח (PSMs), יש פונקציות כי הם פחות ברורים, אם כי חלקם רעילים וסביר לשמש כהגנה מפני אוכלי עשב וטפילים (למשל, אלקלואידים, טאנינים)2,3. חלק מכימיקלים אלה יש את היכולת להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים ארוכי טווח בבעלי חיים, כגון תפקוד אנדוקריני, אם כי מדוע אלה פיטוכימיקלים האנדוקרינית פעיל אינטראקציה עם המערכת האנדוקרינית החולייתנית עדיין לא ברור2,4.

Phytoestrogens, פיטוכימיקלים האנדוקרינית-פעילה הנחקרת ביותר, הם PSMs פוליפנוליים המחקים אסטרוגנים מבניים ופונקציונליים, המקיימים אינטראקציה ישירה עם ציר האשכים ההיפותלומו-יותרת המוח של המערכת האנדוקרינית החולייתנית5. בליעה של phytoestrogens בתזונת האדם קשורה להגנה מפני כמה סוגי סרטן, מחלות לב, תסמיני גיל המעבר, אם כי השפעות אחרות כוללות בעיות פוריות. למעשה, ההשפעות הפיזיולוגיות של תרכובות אלה התגלו בשנות הארבעים כאשר פוריות בכבשים יוחסה למרעה שלהם על תלתן עשיר בפיטואסטרוגן (Trifolium subterrareum)6. כאשר לבלוע, phytoestrogens יכול לעבור לתאים ולחקות את ההשפעות של אסטרוגן. בעוד phytoestrogens היו השפעות שליליות על פוריות הכבשים, הקשר בין phytoestrogens ופיזיולוגיה אינה פשוטה. כמו כבשים, קרנף לבן דרומי להפגין רגישות תרכובות אסטרוגניים במזון נגזר כמויות גבוהות של סויה אספסת. בנות של נקבות האכילו דיאטה זו במהלך ההריון נוטים פחות להתרבות7. עם זאת, מחקרים אחרים הראו כי phytoestrogens עשוי להיות השפעות חיוביות גם כן, כולל התבגרות של זקיקי השחלות בעכברים מבוגרים8, מניעת סרטן מסוימים, פעילות נוגדת חמצון, ואפקטים antiproliferative9.

רוחב ההשפעות של phytoestrogens אינם מפתיעים בהתחשב בכך אסטרוגנים להשפיע על מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות, כולל צמיחה, פיתוח, ויסות של מערכת הרבייה ומערכת העצבים המרכזית10. למרות שיש מנגנונים רבים של פעולה, phytoestrogens לעתים קרובות יש את היכולת לשנות, לשפר, או לשבש איתות אסטרוגן באמצעות היכולת שלהם לפעול כמו ליגנדים עבור קולטני אסטרוגן תוך גרעיני אלפא בטא (ERα ו ERβ). פיטואסטרוגנים רבים יש מבנה טבעת פנולי דומה אסטרוגנים המאפשר להם לקשור קולטני אסטרוגן. אלה עם פעילות אסטרוגניים אגוניסטי לתפקד כמו אסטרוגן, יצירת קומפלקס פעיל ER-ligand שיכול לעמעם ולקשור אלמנט תגובת אסטרוגן (ERE) ולהפעיל שעתוקגנים 11. לכן, אסטרוגנים ופיטואסטרוגנים לווסת את פעילות התא ואת תפקודי המערכת באמצעות מעשיהם כגורמי שעתוק.

כאן אנו מציגים את השימוש החדשני של מבחנה מבוססת תאים כדי לסנן תמציות צמחים לנוכחות של תרכובות שיש להם פעילות ביולוגית אסטרוגניים. אסאי זה משתמש בתאי CHO השחלות אוגר סיניים מהונדסים לבטא מאוד ERβ, אשר כבר חצו עם גחלילית(Photinus pyralis)גן לוציפראז מקושר מקדם ERE12. כאשר קיימים תרכובות אסטרוגניים, הם נקשרים למיון, מצטמצמים ונקשרים ל- ERE, מה שמוביל לתעתיק של גן לוציפראז. עם הוספת פתרון מצע, לוציפראז מזרז תגובה המובילה לפליטת פוטון. לכן, דגימות חיוביות לייצר דגימות אור ושליליות לא.

זה מבחנים זמינים מסחרית מבטל את הצורך במעבדות כדי transfect את תאי היונקים עם הגן הכתב קולטןאסטרוגן 13,14, אשר היה יציב ומשתנה ביעילות. ה- Assay מספק פלטפורמת transfection יציבה המאפשרת לקבוע במהירות ופשוט אם לצמח יש פעילות אסטרוגניים באמצעות כריכת קולטן.

אנו בודקים את ההשערה כי פולי סויה יש פעילות אסטרוגניים גבוהה יותר מאשר כל מזונות אחרים בהתחשב בריכוזים הידועים שלהם של איזופלבונים אסטרוגניים15 באמצעות מזונות אנושיים ממכולת מקומית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חומרים צמחיים

  1. הקפאת פריטים צמחיים יבשים שנאספו טריים באמצעות ליופילייזר.
    1. כדי להגן על דגימות מפני אור, לכסות תאים עם רדיד אלומיניום במהלך תהליך הייבוש.
    2. כדי להבטיח כי דגימות יבשות לחלוטין, lyophilize עד התאים כבר לא מרגיש קר לגעת חומרים צמחיים כבר לא לאבד מסה כאשר שקל.
    3. יש לאחסן צמחים מיובשים בשקיות שאריות נמוכות סטריליות בהיעדר אור עד לטחינה.
  2. טוחנים דק דגימות בעזרת טחנת טחינה עם מסך רשת של 0.85 מ"מ.
    1. לאחסן את דגימות הקרקע בשקיות בהיעדר אור עד החילוץ.

2. מיצוי מטבוליטים משניים צמחיים

  1. כדי לחלץ את מטבוליטים הצמח המשני, להשתמש ביחס של 1 גרם של מדגם מיובש ל 10 מ"ל של מתנול כיתה HPLC.
    1. לשקול מדגם על איזון אנליטי ולהוסיף אותו בקבוק Erlenmeyer בגודל המתאים (125 – 250 מ"ל). לאחר מכן הוסף נפח מתאים של מתנול. רשום את המסה של המדגם שחולצה.
    2. לכסות את הפתרון הצמח מתנול עם רדיד אלומיניום, ולאחר מכן להגדיר לסובב במהירות 100 סל"ד בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 ימים על שייקר מסלולית, המאפשר תרכובות אסטרוגניים פוטנציאליים להתמוסס לתוך מתנול.
    3. מכניסים את הסופרנט למערכת סינון טפטוף באמצעות נייר סינון (125 מ"מ).
    4. באמצעות מאייד סיבובי, לייבש את תמצית הצמח עד המדגם הוא מעובה, אבל לשפוך, בבקבוק 300 מ"ל עגול התחתון. יוצקים דגימה לתוך בקבוק 50 מ"ל עגול התחתון, לשטוף את הבקבוק הגדול עם כמות קטנה של מתנול. ממשיכים לייבש את הדגימה בבקבוקון הקטן עד שהמתנול מתאדה לחלוטין.
    5. לשקול את שאריות המדגם באמצעות איזון אנליטי. רשום מסה של שאריות.
    6. ממיסים את תמצית הצמח בדמתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז של 0.1 גרם תמצית ל-2 מ"ל של DMSO. וורטקס עד הומוגני.
    7. אחסן את תמצית הצמח-פתרון DMSO ב 4 מעלות צלזיוס בבקבוקוני זכוכית ענבר עד לתסמין.

התראה: צמחים יכולים לייצר כימיקלים פעילים ביולוגית לא ידועים, ו- DMSO הוא רכב שיכול להעביר אותם על פני קרום התא. השתמש בציוד מגן אישי מתאים וטיפול בעת טיפול בדגימות אלה.

3. קולטן אסטרוגן אנושי β transfection assay12

הערה: טכניקה אספטית ומכסה המנוע לזרימה למינארית נדרשים ליום הראשון של פרוטוקול ההסתעפות.

  1. הכן דילולים של 17β-אסטרדיול עבור העקומה הסטנדרטית.
    1. מעבירים את מדיום ההקרנה הבינונית והתרכובת של שחזור התאים (CSM) מאחסון המקפיא ומפשירים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    2. תווית צינורות microcentrifuge ביניים 1 ו 2 (INT1, INT2) ו 1-8.
    3. מלא INT1 עם 995 μL של CSM, INT2 עם 615 μL של CSM, צינור 1 עם 900 μL של CSM, וצינורות 2-8 עם 600 μL של CSM. מניחים את צינור 8 בצד.
    4. העבר 5 μL של 100 מיקרומטר 17β-אסטרדיול מלאי לתוך INT1. השלך את הקצה. מערבולת.
    5. לפני כל העברה, לשטוף פיפטה 3 פעמים, ולאחר מכן להעביר 10 μL מ INT1 לתוך INT2. השלך את הקצה.
    6. לשטוף פיפטה 3 פעמים, ולאחר מכן להעביר 100 μL מ INT2 לתוך צינור 1. השלך עצה. העבר 300 μL מצינור 1 לתוך צינור 2. חזור על הפעולה עבור צינורות 3 עד 7. השלך 300 μL מצינור 7 לתוך מיכל פסולת. צינור 8 הוא אפס ואינו מקבל אסטרדיול. הריכוזים הסופיים של סטנדרטים מצופים הם: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ו 0 pM אסטרדיול.
  2. הכינו תרכובות לדוגמה.
    1. דגימות וורטקס.
    2. קח 4 μL של כל מדגם צמח DMSO ולהוסיף 496 μL של CSM להניב פתרון DMSO 0.8%.
  3. להפשיר במהירות תאי כתב.
    1. לאחזר את הצינור של תא התאוששות בינוני מאמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לחטא את המשטח החיצוני באמצעות 70% אתנול.
    2. אחזר תאי כתב מ- -80 °C (70 °F) אחסון והפשרה על-ידי העברת 10 מ"ל של CRM שחומם מראש לתוך הצינור של תאים קפואים.
    3. סגור את הצינור של תאי כתב ולהעביר לאמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 5 - 10 דקות.
    4. לאחזר את הצינור של השעיית תא כתב מאמבט המים. הפוך את הצינור של תאים מספר פעמים בעדינות כדי לשבור אגרגטים של תאים לייצר השעיה הומוגנית. לנקות את פני השטח של הצינור עם 70% אתנול.
  4. ציפוי מבחנים
    1. לוותר על 100 μL של השעיית תא הכתב לתוך כל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית.
    2. לוותר על 100 μL של דגימות משולש לתוך בארות assay המתאים.
    3. מעבירים את הצלחת לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס, לחות 5% CO2 עבור 22-24 שעות.
  5. הפשרת מצע זיהוי ומאגר זיהוי במקרר חשוך בן לילה כדי להתכונן ליום 2.
  6. רגע לפני סיום הדגירה, הסירו את מצע הגילוי ומאגר הגילוי מהמקרר והניחו באזור תאורה חלשה עד לשיווי משקל ל-RT. פעם אחת ב- RT, הפוך כל צינור בעדינות מספר פעמים כדי לערבב פתרונות ביסודיות.
    1. מיד לפני השלמת הדגירה, יוצקים את כל התוכן של מאגר הגילוי לתוך הצינור של מצע זיהוי כדי ליצור ריאגנט זיהוי לוציפראז. מערבבים בעדינות כדי לא לייצר קצף.
    2. לאחר הדגירה הושלמה, להפוך את הצלחת כדי להשליך תוכן לתוך מיכל פסולת מתאים. הקישו בעדינות על הצלחת על מגבת נייר נקייה סופגת כדי להסיר את הטיפות האחרונות מהבארות.
    3. הוסף 100 μL של ריאגנט זיהוי לוציפראז לכל באר. אפשר לצלחת ההסתעפות לנוח ב- RT במשך 15 דקות. אל תנער את הצלחת.
  7. לכמת זוהר באמצעות לומינומטר 96-טוב לקריאת צלחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עשרים ושתיים תמציות של פירות וירקות נפוץ למצוא דיאטות אנושיות הוקרנו לנוכחות של תרכובות אסטרוגניים. מגוון רחב של מזונות היו assayed, כולל קטניות, כגון פולי סויה, אפונה שלג, אפונה הצמד, כמו משפחת אפונה הוא מקור ידוע של phytoestrogens16, כמו גם תאנים, תמרים, תירס, גזר, תפוחים, בננות, תותים, עגבניות, כרוב, כרוב. תרכובות משבשות אנדוקריניות נמצאות בחומרים נפוצים (למשל, פלסטיק וחומרי הדברה) וחלקן פעילות ביולוגית באמצעותERs 17. במידת האפשר, הן פריטים אורגניים ולא אורגניים היו assayed להסביר את האפשרות כי חומרי הדברה עם פעילות אסטרוגניים יכול היה להשפיע על התוצאות.

כל פריט מזון צמחי היה מצופה משולשת והלומינומטר דיווח על פעילותה של כל באר ביחידות תאורה יחסית (RLUs). רמות הרקע של RLUs נקבעות בעקומה הסטנדרטית עם תקן 8, ריכוז אפס ומשמשות לעיון.  ערך הפעלת הקיפול, שהוא המכפיל שמעל ה- RLU עבור נקודת האפס בעקומה, מחושב על-ידי המשוואה:

הפעלת קיפול = לא ידוע (RLU) ÷ רגיל 8 (RLU)

למטרות פרשניות, פעילות אסטרוגניים מוצגת באופן סידורי ואיכותי של פעילות גבוהה, Med, Low או No Activity. רמות גבוהות של רישום פעילות מעל לערך ההפעלה הסטנדרטי של קיפול 4. המדיום נופל בין תקן 5 לתקן 4, וערכים נמוכים הם בין תקן 6 לתקן 5. כל הדגימות עם ערכי הפעלת קיפול מתחת לתקן 7 נחשבות ללא פעילות. בהתייחסו לטבלה 1, פולי סויה, אורגניים ולא אורגניים, מוקרנים ברמות פעילות גבוהות, בעוד שכל שאר פריטי הפירות והירקות לא נרשמו פעילות. השוואת תוצאות פולי הסויה לעקומה הסטנדרטית (איור 1), מראה כי, בין אם גדל באופן אורגני או לא, הם ציון גבוה מן העקומה עבור רמות פעילות אסטרדיול בריכוז זה. תמצית פולי סויה, מקור רב עוצמה ידוע של איזופלבונים daidzein ו genistein9, שימש עוד יותר כדי לקבוע את הדילול מניב אות 50% למקסימום (איור 2). תמצית זו דורשת 422 פעמים יותר דילול לייצר מחצית האות של פרוטוקול הדילול הסטנדרטי שלנו.

הפק פריט אורגני/ לא אורגני יחידות תאורה יחסיות הפעלת קיפול הפעלת קיפול (ממוצע) פעילות פיטואסטרוגן
סויה אורגני 1687 29.016 31.06 גבוהה
2023 34.796
1706 29.353
סויה לא אורגני 2041 35.106 32.05 גבוהה
1956 33.647
1593 27.399
אפונה שלג לא אורגני 53 0.919 0.92 ללא פעילות
59 1.015
49 0.836
הצמד אפונה לא אורגני 66 1.142 1.21 ללא פעילות
60 1.032
85 1.462
תירס לא אורגני 29 0.502 0.53 ללא פעילות
30 0.513
33 0.575
תות לא אורגני 35 0.609 0.77 ללא פעילות
47 0.808
51 0.884
תות אורגני 56 0.956 0.88 ללא פעילות
59 1.015
39 0.678
בננה אורגני 32 0.544 0.52 ללא פעילות
28 0.489
31 0.533
בננה לא אורגני 33 0.564 0.60 ללא פעילות
41 0.712
31 0.533
פלנטיין (לוח תכנון) לא אורגני 37 0.64 0.70 ללא פעילות
39 0.667
47 0.805
קייל אורגני 26 0.447 0.47 ללא פעילות
26 0.444
30 0.519
קייל לא אורגני 40 0.685 0.63 ללא פעילות
28 0.485
42 0.719
כרוב אורגני 33 0.568 0.54 ללא פעילות
27 0.468
34 0.588
כרוב לא אורגני 44 0.757 0.66 ללא פעילות
34 0.585
36 0.626
אפל אורגני 30 0.523 0.49 ללא פעילות
25 0.437
30 0.509
אפל לא אורגני 41 0.705 0.62 ללא פעילות
31 0.53
37 0.63
עגבניות אורגני 51 0.874 0.87 ללא פעילות
57 0.974
44 0.76
עגבניות לא אורגני 61 1.056 1.19 ללא פעילות
81 1.386
66 1.128
גזר אורגני 33 0.575 0.51 ללא פעילות
33 0.561
22 0.382
גזר לא אורגני 31 0.53 0.52 ללא פעילות
21 0.365
38 0.657
איור לא אורגני 29 0.506 0.61 ללא פעילות
42 0.716
36 0.619
התאריכים לא אורגני 29 0.495 0.59 ללא פעילות
39 0.667
35 0.602

שולחן 1. תוצאות מייצגות של מערכת הבדיקה של כתב ERβ להקרנת פריטי פירות וירקות לפעילות פיטואסטרוגן. פעילות חיובית מסומנת על-ידי פעילות גבוהה, Med, נמוכה או ללא פעילות.

Figure 1
איור 1. דילול סדרתי של תקן אסטרדיול 17β-אסטרדיול (סטנדרטי 1 עד 8 ריכוזים = 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ו- 0 עמ', בהתאמה) באמצעות מערכת Assay כתב ERβ.

Figure 2
איור 2. ERβ כתב Assay באמצעות דילול סדרתי של תמצית סויה כדי לקבוע את הדילול שהניב יחס אות לרקע כי הוא 50% של האות המרבי. משיטת החילוץ הסטנדרטית המסת תמצית הצמח בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז של 0.1 גרם של תמצית ל 2 מ"ל של DMSO, פולי סויה יש לדלל 422 פעמים כדי לעורר אות 50% מהתגובה המרבית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדיקת כתב ERβ שפותחה כדי לסנן בנפרד סוכני תרופות מתאים גם לסינון מזונות צמחיים עבור phytoestrogens פעיל ביולוגית באמצעות ERβ. שיקולים חשובים בפרוטוקול כוללים טיפול בדגימות הצמח בזהירות: יש לייבש במהירות חומר צמחי טרי כדי למנוע דפוס או השפלה ביולוגית אחרת, ויש להרחיקו מהאור כדי למנוע פוטוליזה של התרכובות18. פרוטוקול הבדיקה12 שסופק על ידי היצרן ברור וזקוק למעט מאוד שינויים למטרות סינון. העקומה הסטנדרטית שהציע היצרן שונתה בפרוטוקול זה כדי להגדיל את מספר הנקודות הנופלות בטווח המעריכי של העקומה (איור 1),תוך שמירה על הרמה העליונה והתחתונה. ניתן להשתמש בפקודה זו לניתוח כמותי, אך מטרתנו היא לקשר צמחים לפעילות גבוהה להשפעות ביולוגיות, לבחירת מזון ולהתנהגויות אחרות בבעלי החיים הצורכים אותם.

כדי להמחיש עוד יותר את יעילות החילוץ והבדיקה כללנו עקומת תגובת מינון עם תמצית סויה (איור 2) וקבענו כי בהתחשב בעוצמת פרוטוקול החילוץ הרגיל, יש לדלל את הסויה בהרחבה לפני שהאות יורד למקסימום של 50%. זה מדגיש את העובדה כי בריכוזים גבוהים של phytoestrogens את רמות האות באות מקסימלי יציב. בריכוזים נמוכים מאוד האות לא יכול להיות חזק מספיק כדי להיות נבדל מרקע. חשוב לעבוד עם ריכוזים גבוהים של תמציות, על מנת לזהות phytoestrogens נוכח בכמויות נמוכות במדגם, מזעור תשלילים כוזבים. בתחילה המעבדה השתמשה בנפח גדול יותר של DMSO ביחס לשאריות הצמח מיצוי מתנול (כלומר, 10 מ"ל של DMSO עד 0.1 גרם של שאריות צמחים). הדגימות היו מדוללות מדי כדי לגרום להערה חזקה בדגימות חיוביות. בשל אחוז DMSO מרבי עבור הכדאיות של תא הכתב ואילוצי נפח בתוך בארות על הצלחת, ריכוז תמצית מדגם צריך להיות ממוטב בעת הוספת DMSO לשאריות הצמח. שליטה חיובית כגון סויה צריכה להיכלל על כל צלחת, כדי לאשר כי התאים הם קיימא המסוגלים זוהר, וכי ריכוז התמצית מספיק כדי לעורר תגובה.

חקירה זו מזהה תרכובות להיקשר ERβ, אבל לא כל phytoestrogens יש את אותו מנגנון פעולה. פרוטוקול זה assay ניתן לשנות על ידי דגירה התאים עם שילוב של אסטרדיול ותרכובות הצמח כדי לזהות אם יש פעילות אנטי אסטרוגן במדגם9,12. אסטרדיול יש זיקה רבה למיון, ולכן נוכחות של phytoestrogens עשוי להיות פעילות ביולוגית אנטיאסטרוגנית בנוכחות אסטרדיול על ידי חסימת הקולטנים, אשר מפחית את התגובה אסטרוגנים. פעילות אנטי אסטרוגניים תזוהה על ידי ירידה בהפעלה הכוללת עם ריכוז הולך וגדל של תמצית הצמח. בדיקה זו לא תזהה שיטות פעולה אחרות, כגון כריכה ל- ERs19הקשורות לקרום . יתר על כן, כמה phytoestrogens אינם פעילים ביולוגית עד שהם כבר מטבוליזם על ידי חיידקיהמעיים 20. ייתכן כי צמחים מסוימים שאין להם פעילות אסטרוגניים או נמוכה במצבם unmetabolized יש פעילות אסטרוגניים גבוהה יותר לאחר חילוף החומרים כי זה assay לא יזהה.

הבדיקה כתב ERβ נבחרה כדי להדגים את ההקרנה של phytoestrogens לפעילות בצמחים כי phytoestrogens להתחרות על קשירה עם אסטרדיול חזק יותר ERβ ממה שהם עושים ERα21. הקרנה לפעילות ERα אפשרית באמצעות בדיקה דומה, שבה התאים מודבקים עם הגן ERα ולא ERβ.

לאחר הקרנה חיובית לפיטואסטרוגנים פעילים, ניתן לזהות את התרכובות הפעילות בשיטות כרומטוגרפיה. ואכן, בשלב זה ניתן לבדוק את התרכובות המבודדות באמצעות בדיקה זו ואת הריכוזים היעילים המקסימליים למחצה (EC50) ניתן לקבוע באמצעות סדרת דילול כמדד של העוצמה של המתחם.

בדיקה זו היא דרך אמינה ופשוטה לבדוק פעילות אסטרוגניים ביולוגיים, תוך התחשבות במגבלותיה בהיקף המנגנונים של פעילות אסטרוגניים. יש לו מספר שיפורים על פני מבחנים חולפים חולפים, בעיקר קלות השימוש, היציבות של התאים, ואת הרגישות של ההסתערות.

מעט ידוע על השכיחות של phytoestrogens במזונות צמחיים בר הנצרך על ידי בני אדם או חיות בר22, אבל מחקרים מראים כי חשיפה PSMs אסטרוגניים בתזריט יכול להיות השפעות ארוכות טווח23. לאחר בדיקה פשוטה וחזקה המזהה תרכובות אלה, בשילוב עם מחקרים להערכת כמויות אכלו וכאשר הם נאכלים, הוא צעד רב עוצמה בקביעת הפונקציה של הכללת מזונות אסטרוגניים בתזונה ואת ההשפעות של תרכובות אלה על מערכות פיזיולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לדייל לייטמן על אימון ראשוני בשימוש במבחני ארעי ארעיים כדי לקבוע פעילות אסטרוגניים של מזונות צמחיים פרימטים. תודה לברדפורד ווסטריץ' ואריק ג'ונסון שעזרו להקים ציוד מעבדה ולהכשיר סטודנטים בשיטות חילוץ. לבסוף, תודה לאוניברסיטת אינדיאנה על מימון המחקר הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL pipette
20 µL pipette
200 µL pipette
37 ° water bath
37 °, humidified 5% CO2 incubator
70% ethanol
analytical balance
cell culture-rated laminar flow hood
dimethyl sulfoxide
disposable media basin, sterile
drip filtration system
Erlenmeyer flasks 125 mL and 250 mL
HPLC grade methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays Indigo Biosciences IB00411 Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve
lyophilizer
multi-channel pipette
orbital shaker
plate-reading luminometer ex. Bioteck Synergy HTX
rotory evaporator
round bottom flasks 50 mL and 300 mL
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins
sterile tips 200 µL and 1000 µL
Whatman grade 1 paper
whirl-pak bags sterile polyethylene bags

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
  2. Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
  3. DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
  4. Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
  5. Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
  6. Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
  7. Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
  8. Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
  9. Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
  10. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  11. Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
  12. Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
  13. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
  14. Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
  15. Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
  16. Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
  17. Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
  18. Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
  19. Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
  20. Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
  21. Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
  22. Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
  23. Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).

Tags

ביוכימיה גיליון 160 תרכובות משניות צמחיות פיטוסטרופ פעילות אסטרוגניים אוכלי עשב אנדוקרינולוגיה סביבתית אסטרדיול
הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chester, E. M., Fender, E.,… More

Chester, E. M., Fender, E., Wasserman, M. D. Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor β Reporter Assay. J. Vis. Exp. (160), e61005, doi:10.3791/61005 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter