Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay

Published: June 7, 2020 doi: 10.3791/61005

Summary

Мы оптимизировали коммерчески доступные рецепторы эстрогена β анализа для скрининга человеческих и нечеловеческих продуктов приматов для эстрогенной активности. Мы подтвердили этот анализ, показав, что известные эстрогенные человеческие пищевые сои регистрирует высокий, в то время как другие продукты не показывают никакой активности.

Abstract

Растения являются источником пищи для многих животных, и они могут производить тысячи химических веществ. Некоторые из этих соединений влияют на физиологические процессы у позвоночных, которые потребляют их, такие как эндокринная функция. Фитоэстрогены, наиболее хорошо изученные эндокринно-активные фитохимические вещества, непосредственно взаимодействуют с гипоталамо-гипофиза гонадальной оси позвоночных эндокринной системы. Здесь мы представляем новое использование клеточного анализа для проверки растительных экстрактов на наличие соединений, которые имеют эстрогенную биологическую активность. Этот анализ использует клетки млекопитающих, разработанные для высокого экспресс-бета рецептора эстрогена (ER) и которые были трансфицированы геном люциферазы. Воздействие соединений с эстрогенной активностью приводит к клеткам, производящим свет. Этот анализ является надежным и простым способом проверки на биологическую эстрогенную активность. Он имеет несколько улучшений по сравнению с переходными анализа трансфекции, прежде всего, простота использования, стабильность клеток, и чувствительность анализа.

Introduction

Растения являются необходимым источником пищи для многих животных, обеспечивая калории и питательные вещества, критически важные для выживания, воспроизводства, роста, развития иповедения 1. Растения производят тысячи химических веществ, многие из которых являются адаптацией для собственного роста, стоматического обслуживания и воспроизводства. Другие соединения, считающихся вторичными метаболитами растений (PSMs), имеют функции, которые менее ясны, хотя некоторые из них токсичны и, вероятно, используются в качестве защиты от травоядного и тунеядства (например, алкалоиды, танины)2,3. Некоторые из этих химических веществ имеют возможность влиять на долгосрочные физиологические процессы у животных, такие как эндокринное функционирование, хотя почему эти эндокринно-активные фитохимические вещества взаимодействуют с эндокринной системой позвоночныхдо сих пор неясно 2,4.

Фитоэстрогены, наиболее хорошо изученные эндокринно-активные фитохимические, являются полифенольными ПМС, которые структурно и функционально имитируют эстрогены, непосредственно взаимодействуя с гипоталомо-гипофиза гонадальной оси позвоночных эндокриннойсистемы 5. Прием фитоэстрогенов в рационе человека связан с защитой от некоторых видов рака, сердечных заболеваний и симптомов менопаузы, хотя другие эффекты включают проблемы фертильности. В самом деле, физиологические эффекты этих соединений были обнаружены в 1940-х годов, когда бесплодие у овец было связано с их выпаса на фитоэстроген богатых клевера (Trifolium subterrareum)6. При приеме внутрь, фитоэстрогены могут передаваться в клетки и имитировать эффекты эстрогена. Хотя фитоэстрогены негативно сказались на плодовитости овец, взаимосвязь между фитоэстрогенами и физиологией не проста. Как и овцы, южный белый носорог проявляет чувствительность к эстрогенным соединениям в кормах, полученных из большого количества сои и люцерны. Дочери женщин кормили эту диету во время беременности, менее вероятно, воспроизвести7. Тем не менее, другие исследования показали, что фитоэстрогены могут иметь положительный эффект, а также, в том числе созревание фолликуловяичников у пожилых мышей 8, профилактика некоторых видов рака, антиоксидантной активности и антипролиферативныхэффектов 9.

Широта воздействия фитоэстрогенов не удивительно, учитывая, что эстрогены влияют на широкий спектр биологических функций, в том числе роста, развития и регулирования репродуктивной и центральнойнервной систем 10. Хотя Есть много механизмов действия, фитоэстрогены часто имеют возможность изменять, повысить, или нарушить эстроген сигнализации через их способность выступать в качестве лигандов для внутриядерных рецепторов эстрогена альфа и бета (ER и ER). Многие фитоэстрогены имеют фенольные структуры кольца похож на эстрогены, что позволяет им связывать рецепторы эстрогена. Те, с агонистической эстрогенной функции активности, как эстроген, образуя активированный ER-лиганд комплекс, который может затемнить и связываться с эстрогеном ответ элемент (ERE) и вызватьтранскрипцию гена 11. Таким образом, эстрогены и фитоэстрогены регулируют активность клеток и функции системы через их действия в качестве транскрипционных факторов.

Здесь мы представляем новое использование клеточного анализа для проверки растительных экстрактов на наличие соединений, которые имеют эстрогенную биологическую активность. Этот анализ использует китайский хомяк яичников CHO клетки инженерии высоко выразить ER, которые были трансфицированы с светлячок (Photinus pyralis) luciferase ген, связанный спромоутером ERE 12. Когда эстрогенные соединения присутствуют, они связываются с ER, затемняют, и связываются с ERE, что приводит к транскрипции гена люциферазы. При добавлении раствора субстрата люцифераза катализует реакцию, ведущую к фотону. Таким образом, положительные образцы производят легкие и отрицательные образцы нет.

Этот коммерчески доступный анализ устраняет необходимость для лабораторий, чтобы трансфект клеток млекопитающих с геном репортераи рецептором эстрогена 13,14, который был нестабильным и переменной по эффективности. Анализ обеспечивает стабильную платформу трансфекции, которая позволяет быстро и просто определить, имеет ли растение эстрогенную активность через связывание рецепторов.

Мы тестируем гипотезу о том, что соевые бобы имеют более высокую эстрогенную активность, чем все другие продукты, учитывая их известные концентрации эстрогенных изофлавонов15 с использованием человеческих продуктов из местных бакалейных лавок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка растительных материалов

  1. Заморозить сухие растительные продукты, которые были собраны свежими с помощью лиофилизера.
    1. Для защиты образцов от света накройте камеры алюминиевой фольгой во время процесса сушки.
    2. Чтобы убедиться, что образцы полностью сухие, лиофилизировать, пока камеры больше не чувствовать себя холодно на ощупь и растительные материалы больше не теряют массу при взвешивании.
    3. Храните сушеные растения в стерильных мешках с низким содержанием остатков при отсутствии света до измельчения.
  2. Мелко измельчить образцы с помощью шлифовальной мельницы с 0,85 мм сетчатым экраном.
    1. Храните образцы грунта в мешках при отсутствии света до извлечения.

2. Добыча вторичных метаболитов растений

  1. Для извлечения вторичных метаболитов растений используйте соотношение 1 г сушеного образца к 10 мл метанола класса HPLC.
    1. Взвесь образец на аналитическом балансе и добавьте его в колбу Erlenmeyer надлежащего размера (125 - 250 мл). Затем добавьте соответствующий объем метанола. Запись массы извлеченного образца.
    2. Обложка растительно-метанол раствор алюминиевой фольгой, а затем установить для поворота на 100 об / мин скорость при комнатной температуре (RT) в течение 3 дней на орбитальной шейкер, что позволяет потенциально эстрогенных соединений растворяться в метанол.
    3. Врезать супернатант в систему капельной фильтрации с помощью фильтровальной бумаги (125 мм).
    4. Используя роторный испаритель, высушите растительный экстракт до тех пор, пока образец не загустеет, но не зальется, в колбу с круглым дном 300 мл. Налейте образец в 50 мл круглого дна колбы, полоскания большой колбы с небольшим количеством метанола. Продолжайте сушить образец в небольшой колбе, пока метанол полностью не испарится.
    5. Взвешивание остатков выборки с использованием аналитического баланса. Запись остатков массы.
    6. Растворите растительный экстракт в диметилсуфсиде (ДМСО) при концентрации 0,1 г экстракта до 2 мл ДМСО. Вихрь до однородной массы.
    7. Храните растительный экстракт-DMSO раствор при 4 градусов по Цельсию в янтарных стеклянных флаконах до анализа.

ВНИМАНИЕ: Растения могут производить неизвестные биологически активные химические вещества, и DMSO является транспортным средством, которое может транспортировать их через клеточные мембраны. Используйте соответствующее средства индивидуальной защиты и ухода при обработке этих образцов.

3. Рецептор эстрогена человека β трансфекции анализ12

ПРИМЕЧАНИЕ: Асептическая техника и ламинарный капюшон потока требуется для первого дня протокола анализа.

  1. Подготовка разбавления 17 -эстрадиола для стандартной кривой.
    1. Передача среднего и соединения клетки скрининга среднего (CSM) из морозильной камеры хранения и оттепели в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
    2. Этикетка микроцентрифуг трубки промежуточные 1 и 2 (INT1, INT2) и 1-8.
    3. Заполните INT1 995 МКЛ CSM, INT2 с 615 МКЛ CSM, трубка 1 с 900 МКЛ CSM, и трубки 2-8 с 600 МКЛ CSM. Установите трубку 8 в сторону.
    4. Передача 5 МКЛ из 100 МКМ 17 "-Эстрадиол фонда в INT1. Откажитесь от наконечника. Вихрь.
    5. Перед каждой передачей, промыть пипетку 3 раза, а затем передать 10 МКЛ из INT1 в INT2. Откажитесь от наконечника.
    6. Промыть пипетку 3 раза, а затем передать 100 мкл из INT2 в трубку 1. Откажитесь от чаевых. Перенесите 300 МКЛ из трубки 1 в трубку 2. Повторите для трубок от 3 до 7. Отбросьте 300 мкл из трубки 7 в контейнер для отходов. Трубка 8 является нулевой и не получает эстрадиола. Окончательные концентрации постриговых стандартов: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 и 0 pM эстрадиола.
  2. Подготовка образцов соединений.
    1. Образцы вортекса.
    2. Возьмите 4 МКЛ каждого образца растения в DMSO и добавьте к 496 МКЛ CSM, чтобы дать 0,8% раствор DMSO.
  3. Быстро оттепель Репортер клетки.
    1. Извлекит трубку cell Recovery Medium из водяной ванны с 37 градусами Цельсия. Дезинфекция внешней поверхности с использованием 70% этанола.
    2. Извлеките клетки репортеров из хранилища и оттепели от -80 градусов по Цельсию, передав 10 мл предварительно разогретого CRM в трубку замороженных клеток.
    3. Закройте трубку клетки репортера и перенесите на водяную баню при 37 градусов по Цельсию на 5-10 минут.
    4. Извлеки трубку подвески клетки репортера от ванны воды. Переверните трубку клеток несколько раз осторожно, чтобы разбить агрегаты клеток и произвести однородную подвеску. Очистите поверхность трубки 70% этанолом.
  4. Оссай покрытие
    1. Выпределите 100 йл подвески ячейки Reporter в каждую колодец с помощью многоканальной пипетки.
    2. Распределение 100 МКЛ образцов в три раза в соответствующие скважины анализа.
    3. Перенесите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию, увлажненные 5% CO2 инкубатор для 22-24 ч.
  5. Оттепель Обнаружения субстрата и обнаружения буфера в темном холодильнике на ночь, чтобы подготовиться к 2-й день.
  6. Незадолго до окончания инкубации пластины удалите субстрат обнаружения и буфер обнаружения из холодильника и поместите в зону низкой освещенности до тех пор, пока не будет уравновешена до RT. После того, как на RT, инвертировать каждую трубку осторожно несколько раз, чтобы тщательно перемешать решения.
    1. Непосредственно перед тем, как инкубация завершена, вылейте все содержимое буфера обнаружения в трубку подложки обнаружения для создания реагента обнаружения люциферазы. Смешайте осторожно, чтобы не производить пену.
    2. Как только инкубация завершена, инвертировать пластину, чтобы выбросить содержимое в соответствующий контейнер отходов. Аккуратно коснитесь пластины на чистом абсорбенте бумажном полотенце, чтобы удалить последние капли из колодцев.
    3. Добавьте 100 МКЛ реагента обнаружения люциферазы к каждой хорошо. Разрешить анализ пластины отдохнуть на RT в течение 15 минут. Не встряхивать тарелку.
  7. Количественная оценка люминесценции с помощью 96-ну пластины чтения люминометра.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Двадцать два экстракта фруктов и овощей, обычно встречающихся в рационе человека, были проверены на наличие эстрогенных соединений. Различные продукты были анализированы, в том числе бобовые, такие как соевые бобы, горох снега, и горох оснастки, как горох семьи является известным источникомфитоэстрогенов 16, а также инжир, финики, кукуруза, морковь, яблоки, бананы, клубника, помидоры, капуста и капуста. Эндокринные разрушающие соединения содержатся в общих веществах (например, пластмассах и пестицидах), а некоторые из них биологически активны через ERs17. Когда это возможно, как органические, так и неорганически выращенные предметы были анализированы с учетом возможности того, что пестициды с эстрогенной активностью могли повлиять на результаты.

Каждый растительный пищевой элемент был поцараплен в трилированных и люминометр сообщил о деятельности каждой из колодец в относительных световых единиц (RLUs). Фоновые уровни РЛУ определяются в стандартной кривой со стандартом 8, нулевой концентрацией и используются для справки.  Значение активации складок, которое является множительом выше RLU для нулевой точки на кривой, рассчитывается по уравнению:

Фолд Активация - Неизвестный (RLU) ÷ Стандарт 8 (RLU)

Для интерпретационных целей эстрогенная активность представлена в порядковой, качественной манере Высокой, Мед, Низкой или Нет Активности. Высокие уровни регистра активности выше значения активации Стандарта 4 раза. Среднее падение между стандартом 5 и стандартом 4, а низкие значения находятся между стандартом 6 и стандартом 5. Любые образцы со значениями активации складок ниже стандарта 7 считаются нет активности. Ссылаясь на таблицу 1, соевые бобы, как органические, так и неорганические, проверены на высоком уровне активности, в то время как все другие фрукты и овощи не зарегистрированы никакой деятельности. Сравнение результатов сои сои со стандартной кривой(рисунок 1), показывает, что, независимо от того, выращивается органически или нет, они оценка высоко от кривой для уровней активности эстрадиола в этой концентрации. Соевый экстракт, известный мощный источник изофлавонов даидзеин и генистеин9, был дополнительно использован для определения разбавления дает 50% сигнала к максимуму (Рисунок 2). Этот экстракт требует в 422 раза больше разбавления, чтобы произвести половину сигнала нашего стандартного протокола разбавления.

Продукция Пункт Органические/ Неорганические Относительные световые единицы (Lum) Активация складок Активация фолд (средняя) Фитоэстрогенная активность
Соевые бобы Органических 1687 29.016 31.06 Высокой
2023 34.796
1706 29.353
Соевые бобы Неорганические 2041 35.106 32.05 Высокой
1956 33.647
1593 27.399
Снежный горох Неорганические 53 0.919 0.92 Отсутствие активности
59 1.015
49 0.836
Snap Горох Неорганические 66 1.142 1.21 Отсутствие активности
60 1.032
85 1.462
Кукурузы Неорганические 29 0.502 0.53 Отсутствие активности
30 0.513
33 0.575
Клубника Неорганические 35 0.609 0.77 Отсутствие активности
47 0.808
51 0.884
Клубника Органических 56 0.956 0.88 Отсутствие активности
59 1.015
39 0.678
Банан Органических 32 0.544 0.52 Отсутствие активности
28 0.489
31 0.533
Банан Неорганические 33 0.564 0.60 Отсутствие активности
41 0.712
31 0.533
Подорожник Неорганические 37 0.64 0.70 Отсутствие активности
39 0.667
47 0.805
Кале Органических 26 0.447 0.47 Отсутствие активности
26 0.444
30 0.519
Кале Неорганические 40 0.685 0.63 Отсутствие активности
28 0.485
42 0.719
Капуста Органических 33 0.568 0.54 Отсутствие активности
27 0.468
34 0.588
Капуста Неорганические 44 0.757 0.66 Отсутствие активности
34 0.585
36 0.626
Apple Органических 30 0.523 0.49 Отсутствие активности
25 0.437
30 0.509
Apple Неорганические 41 0.705 0.62 Отсутствие активности
31 0.53
37 0.63
Томатный Органических 51 0.874 0.87 Отсутствие активности
57 0.974
44 0.76
Томатный Неорганические 61 1.056 1.19 Отсутствие активности
81 1.386
66 1.128
Морковь Органических 33 0.575 0.51 Отсутствие активности
33 0.561
22 0.382
Морковь Неорганические 31 0.53 0.52 Отсутствие активности
21 0.365
38 0.657
Рис Неорганические 29 0.506 0.61 Отсутствие активности
42 0.716
36 0.619
Даты Неорганические 29 0.495 0.59 Отсутствие активности
39 0.667
35 0.602

Таблица 1. Репрезентативные результаты системы анализа репортеров ЭРЗ для скрининга плодовых и овощных товаров на фитоэстрогенную деятельность. Положительная активность указывается high, Med, Low или No Activity.

Figure 1
Рисунок 1. Серийное разбавление стандарта«Эстрадиол» (Стандарт 1-8 концентраций, 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 и 0 pM, соответственно) с помощью системы анализа репортеров ER. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2. Репортер ER' Assay использует серийное разбавление экстракта сои для определения разбавления, которое дало соотношение сигнала к фону, которое составляет 50% от максимального сигнала. Из стандартного метода экстракции, растворяющий растительный экстракт в диметиловом сульфоксиде (ДМСО) при концентрации 0,1 г экстракта до 2 мл ДМСО, сою нужно разбавлять 422 раза, чтобы вызвать сигнал 50% от максимальной реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ репортеров ER, разработанный для индивидуального скрининга фармацевтических агентов, также подходит для скрининга растительных продуктов на фитоэстрогены, биологически активные через ER. Важные соображения в протоколе включают в себя лечение образцов растений с осторожностью: свежий растительный материал должен быть высушен быстро, чтобы предотвратить литье или другие биологические деградации, и она должна быть вдали от света, чтобы предотвратить фотолиз соединений18. Протокол анализа12, представленный производителем, ясен и требует очень мало изменений для целей скрининга. Стандартная кривая, предложенная производителем, была изменена в этом протоколе, чтобы увеличить количество точек, которые падают в экспоненциальномдиапазоне кривой (рисунок 1), сохраняя при этом верхние и нижние плато. Можно использовать этот анализ для количественного анализа, но наша цель состоит в том, чтобы связать растения с высокой активностью к биологическим эффектам, выбор пищи, и другие поведения у животных, которые потребляют их.

Для дальнейшего иллюстрации эффективности экстракции и анализа мы включили кривую реакции дозы сэкстрактом сои (рисунок 2) и определили, что с учетом потенции нормального протокола экстракции, соя должна быть разбавлена широко, прежде чем сигнал падает до 50% максимум. Это подчеркивает тот факт, что при высоких концентрациях фитоэстрогенов сигнал плато при стабильном максимальном сигнале. При очень низких концентрациях сигнал может быть недостаточно сильным, чтобы отличаться от фона. Важно работать с высокими концентрациями экстрактов, для того, чтобы обнаружить фитоэстрогены, присутствующие в низких количествах в образце, минимизируя ложные негативы. Первоначально лаборатория использовала больший объем ДМСО по отношению к растительным остаткам от добычи метанола (т.е. от 10 мл ДМСО до 0,1 г растительного остатка). Образцы были слишком разбавлены, чтобы вызвать сильное свечение в положительных пробах. В связи с максимальным процентом DMSO для жизнеспособности клеток репортера и ограничениями объема в скважинах на пластине, концентрация экстракта образца должна быть оптимизирована при добавлении DMSO к растительным остаткам. Положительный контроль, такой как соя, должен быть включен на каждой пластине, чтобы подтвердить, что клетки жизнеспособны и способны к люминесценции, и что концентрация экстракта достаточна для получения ответа.

Этот анализ обнаруживает соединения, которые связываются с ЭРЗ, но не все фитоэстрогены имеют один и тот же механизм действия. Этот протокол анализа может быть изменен путем инкубации клеток с сочетанием эстрадиола и растительных соединений, чтобы обнаружить, есть ли антиэстрогенная активностьв образце 9,12. Эстрадиол имеет большое сродство к ER, поэтому наличие фитоэстрогенов может иметь антиэстрогенную биологическую активность в присутствии эстрадиола, блокируя рецепторы, что снижает реакцию на эстрогены. Антистрогенная активность будет выявлена за счет снижения общей активации с увеличением концентрации растительного экстракта. Этот анализ не обнаружит других методов действия, таких как привязка к мембранным ERs19. Кроме того, некоторые фитоэстрогены не являются биологически активными, пока они не были метаболизированы кишечныхмикробов 20. Вполне возможно, что некоторые растения, которые не имеют или низкой эстрогенной активности в их неудовлетворенном состоянии имеют более высокую эстрогенную активность после метаболизма, что этот анализ не будет обнаруживать.

Анализ репортеров ER' был выбран, чтобы иллюстрифицировать скрининг фитоэстрогенов на активность в растениях, потому что фитоэстрогены конкурируют за привязку с эстрадиолом сильнее к ER, чем кER- 21. Скрининг на активность ЭРЗ возможен с помощью аналогичного анализа, в котором клетки трансфицированы геном ER, а не ER.

После положительного скрининга на активные фитоэстрогены, активные соединения могут быть определены с помощью методов хроматографии. Действительно, в этот момент изолированные соединения могут быть проверены с помощью этого анализа и половина максимально эффективных концентраций (EC50) может быть определена с помощью серии разбавления в качестве меры потенции соединения.

Этот анализ является надежным и простым способом проверки на биологическую эстрогенную активность, имея в виду его ограничения в широте механизмов эстрогенной активности. Он имеет несколько улучшений по сравнению с переходными анализа трансфекции, в первую очередь простота использования, стабильность клеток, и чувствительность анализа.

Мало что известно о распространенности фитоэстрогенов в диких растительных продуктов, потребляемыхлюдьми или дикими животными 22, но исследования показывают, что воздействие эстрогенных PSMs в диете может иметь долгосрочныепоследствия 23. Имея простой надежный анализ, который обнаруживает эти соединения, в сочетании с исследованиями оценки количества съеденных и когда они едят, является мощным шагом в определении функции включения эстрогенных продуктов в рационе и влияние этих соединений на физиологические системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарны Дейл Лейтман для первоначальной подготовки в использовании переходных анализов трансфекции для определения эстрогенной активности приматов растительных продуктов. Спасибо Брэдфорду Вестричу и К. Эрику Джонсону за помощь в настройке лабораторного оборудования и обучении студентов методам экстракции. Наконец, спасибо Университету Индианы за финансирование этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL pipette
20 µL pipette
200 µL pipette
37 ° water bath
37 °, humidified 5% CO2 incubator
70% ethanol
analytical balance
cell culture-rated laminar flow hood
dimethyl sulfoxide
disposable media basin, sterile
drip filtration system
Erlenmeyer flasks 125 mL and 250 mL
HPLC grade methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays Indigo Biosciences IB00411 Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve
lyophilizer
multi-channel pipette
orbital shaker
plate-reading luminometer ex. Bioteck Synergy HTX
rotory evaporator
round bottom flasks 50 mL and 300 mL
sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins
sterile tips 200 µL and 1000 µL
Whatman grade 1 paper
whirl-pak bags sterile polyethylene bags

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
  2. Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution. International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).
  3. DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal. Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).
  4. Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. Primate Diet & Nutrition. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).
  5. Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys. African Journal of Ecology. , (2019).
  6. Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).
  7. Tubbs, C. W., et al. Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility. General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).
  8. Shen, M., et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model. European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).
  9. Boué, S. M., et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).
  10. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  11. Nishikawa, J. -i, et al. New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator. Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).
  12. Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).
  13. Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda. American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).
  14. Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. Selective activation of estrogen receptor-β target genes by 3, 3'-diindolylmethane. Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).
  15. Whitten, P. L., Patisaul, H. B. Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action. Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).
  16. Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. Advances in Food and Nutrition Research. , Academic Press Inc. (2019).
  17. Lutz, I., Kloas, W. Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding. Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).
  18. Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).
  19. Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells. Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).
  20. Dixon, R. A. Phytoestrogens. Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).
  21. Kuiper, G. G. J. M., et al. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β. Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).
  22. Wasserman, M. D. Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , UC Berkeley. (2011).
  23. Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure. Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).

Tags

Биохимия выпуск 160 Растительные вторичные соединения Фитостероид Эстрогенная активность Травоядная Экологическая эндокринология Эстрадиол
Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chester, E. M., Fender, E.,More

Chester, E. M., Fender, E., Wasserman, M. D. Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor β Reporter Assay. J. Vis. Exp. (160), e61005, doi:10.3791/61005 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter