Summary
Descrevemos e detalhamos o uso do sistema autônomo translaminar. Este sistema utiliza o segmento posterior humano para regular independentemente a pressão dentro do segmento (intraocular) e ao redor do nervo óptico (intracraniano) para gerar um gradiente de pressão translaminar que imita características de neuropatia óptica glaucomatosa.
Abstract
Há uma necessidade atual não atendida de um novo modelo humano pré-clínico que possa atingir a etiologia da doença ex vivo usando pressão intracraniana (ICP) e pressão intraocular (IOP) que pode identificar vários paradigmas patogênicos relacionados à patogênese de glaucoma. Modelos de cultura de órgãos de perfusão do segmento anterior ex vivo têm sido previamente utilizados e aplicados como tecnologias eficazes para a descoberta de patogênese de glaucoma e testes de terapêutica. A triagem pré-clínica de medicamentos e pesquisas realizadas em sistemas de órgãos humanos ex vivo podem ser mais traduzíveis para a pesquisa clínica. Este artigo descreve em detalhes a geração e o funcionamento de um novo modelo de pressão translaminar humano ex vivo chamado sistema autônomo translaminar (TAS). O modelo TAS pode regular independentemente o ICP e o IOP utilizando segmentos posteriores de doadores humanos. O modelo permite estudar a patogênese de forma pré-clínica. Pode reduzir o uso de animais vivos em pesquisas oftálmicas. Em contraste com modelos experimentais in vitro, a estrutura tecidual da cabeça do nervo óptico (ONH) a complexidade e a integridade também podem ser mantidas dentro do modelo ex vivo TAS.
Introduction
Estimativas globais em pesquisas recentes sugerem que 285 milhões de pessoas vivem com deficiência visual, incluindo 39 milhões que são cegos1. Em 2010, a Organização Mundial da Saúde documentou que três das nove principais causas de cegueira listadas ocorrem no segmento posterior do olho1. As doenças oculares posteriores do segmento envolvem a retina, o coroide e o nervo óptico2. A retina e o nervo óptico são extensões do sistema nervoso central (SNC) do cérebro. Os axônios da célula gânglio da retina (RGC) são vulneráveis a danos porque saem do olho através da cabeça do nervo óptico (ONH) para formar o nervo óptico3. O ONH continua sendo o ponto mais vulnerável para os axônios RGC devido ao trabalho de malha 3D de feixes de tecido conjuntivo chamado lamina cribrosa (LC)4. O ONH é o local inicial de insulto aos axônios RGC em glaucoma5,6,7, e alterações na expressão genética dentro do ONH têm sido estudadas nos modelos de hipertensão ocular e glaucoma8,9,10. Os axônios RGC são suscetíveis no ONH devido a diferenciais de pressão entre o compartimento intraocular, chamado de pressão intraocular (IOP), e dentro do espaço subaracnóide perióptico externo, chamado de pressão intracraniana (ICP)11. A região da LC separa ambas as áreas, mantendo diferenciais normais de pressão, com IOP variando de 10 a 21 mmHg e ICP de 5 a 15 mmHg12. A diferença de pressão através da lâmina entre as duas câmaras é chamada de gradiente de pressão translaminar (TLPG)13. Um dos principais fatores de risco de glaucoma é o IOP14 elevado.
O aumento do IOP aumenta a tensão dentro e em toda a região laminar6,15,16. Observações experimentais em humanos e modelos animais apresentam o ONH como sendo o local inicial de danos axonais17,18. O paradigma biomecânico do estresse e da tensão relacionada ao IOP que causam danos glaucososos no ONH também influencia a fisiopatologia do glaucoma19,20,21. Embora em humanos alterações induzidas por pressão dano mecanicamente Axônios 22, roedores sem placas colágenas dentro da lâmina também podem desenvolver glaucoma7,23. Além disso, o IOP elevado continua sendo o fator de risco mais proeminente em pacientes com glaucoma de ângulo aberto primário, enquanto pacientes com glaucoma de tensão normal desenvolvem neuropatia óptica glaucoma mesmo sem IOP elevado. Além disso, há também um subconjunto de hipertensos oculares que não apresentam danos nos nervos ópticos. Também foi sugerido que a pressão do fluido cefalorraquidiano (CSFp) pode desempenhar um papel na patogênese do glaucoma. Evidências indicam que a ICP é reduzida para ~5 mmHg em pacientes com glaucoma em comparação com indivíduos normais, causando assim aumento da pressão translaminar e desempenhando um papel crucial na doença24,25. Anteriormente, foi demonstrado em um modelo canino, que ao controlar as alterações de IOP e CSFp, pode haver grandes deslocamentos do disco óptico26. A elevação do CSFP nos olhos suínos também mostrou aumento da tensão principal dentro da região da LC e do tecido neural retrolaminar. O aumento da tensão nos RGCs e na região da LC contribui para o bloqueio do transporte axonal e perda de RGCs27. A degeneração progressiva dos RGCs tem sido associada à perda de suporte trófico28,29, estimulação de processos inflamatórios/regulação imunológica30,31 e efeitos apoptóticos29,32,33,34,35. Além disso, a lesão axal (Figura 3) causa efeitos prejudiciais sobre os RGCs, desencadeando falhas regenerativas36,37,38,39. Embora os efeitos do IOP tenham sido bem estudados, pesquisas mínimas foram realizadas sobre alterações anormais de pressão translaminar. A maioria dos tratamentos para glaucoma se concentra na estabilização do IOP. No entanto, embora a redução do IOP desacelere a progressão da doença, ela não reverte a perda visual do campo e previne a perda completa de RGCs. A compreensão de alterações neurodegenerativas relacionadas à pressão no glaucoma será crucial para prevenir a morte do RGC.
As evidências atuais indicam que modulações de pressão translaminar devido a várias alterações mecânicas, biológicas ou fisiológicas em pacientes que sofrem de deficiências visuais traumáticas ou neurodegenerativas podem causar perda significativa de visão. Atualmente, não existe um verdadeiro modelo de segmento posterior humano pré-clínico que possa permitir o estudo de danos biomecânicos glaucomatosos dentro do ONH humano ex vivo. A observação e o tratamento do segmento posterior do olho é um grande desafio na oftalmologia27. Existem barreiras físicas e biológicas para atingir o olho posterior, incluindo altas taxas de eliminação, barreira hemorrística e respostas imunológicas potenciais40. A maioria dos testes de eficácia e segurança para novos alvos de drogas são realizados utilizando modelos celulares in vitro e in vivo animal41. A anatomia ocular é complexa, e estudos in vitro não imitam com precisão as barreiras anatômicas e fisiológicas apresentadas pelos sistemas de modelos teciduais. Embora os modelos animais sejam uma necessidade para estudos farmacocinéticos, a fisiologia ocular do olho posterior humano pode variar entre várias espécies animais, incluindo anatomia celular da retina, vasculatura e ONH41,42.
O uso de animais vivos requer regulamentações éticas intensivas e detalhadas, alto compromisso financeiro e reprodutibilidade efetiva43. Recentemente, várias outras diretrizes se seguiram para o uso ético de animais em pesquisas experimentais44,45,46. Uma alternativa ao teste em animais é o uso de modelos de olhos humanos ex vivo para investigar a patogênese da doença e a análise potencial de medicamentos para proteger os danos do ONH. O tecido pós-morte humano é um recurso valioso para estudar paradigmas da doença humana, especialmente no caso de doenças neurodegenerativas humanas, pois a identificação de potenciais drogas desenvolvidas em modelos animais requer a necessidade de ser traduzível para os seres humanos47. O tecido doador humano ex vivo tem sido amplamente utilizado para o estudo de distúrbios humanos47,48,49, e os sistemas de cultura de órgãos de perfusão do segmento anterior humano já forneceram um modelo único ex vivo para estudar a fisiopatologia de IOP50,51,52 elevados.
Para estudar a pressão translaminar relacionada ao IOP e iCP aos olhos humanos, projetamos e desenvolvemos com sucesso um sistema autônomo translaminar de duas câmaras (TAS) que pode regular independentemente o IOP e o ICP usando segmentos posteriores a partir de olhos de doadores humanos. É o primeiro modelo humano ex vivo a estudar a pressão translaminar e explorar os efeitos biomecânicos do TLPG no ONH.
Este modelo TAS humano ex vivo pode ser usado para descobrir e classificar modificações celulares e funcionais que ocorrem devido à elevação crônica de IOP ou ICP. Neste relatório, detalhamos o protocolo passo a passo de dissecar, configurar e monitorar o modelo de segmento posterior humano do TAS. O protocolo permitirá que outros pesquisadores reproduzam efetivamente esse novo modelo de segmento posterior humano pressurizado ex vivo para estudar a patogênese da doença biomecânica.
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Protocol
Os olhos foram obtidos de acordo com as disposições da Declaração de Helsinque para pesquisas envolvendo tecido humano.
NOTA: Olhos de bancos oculares respeitáveis (por exemplo, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) foram colhidos dentro de 6-12 h de morte e o soro de doadores foi testado para hepatite B, hepatite C e vírus da imunodeficiência humana 1 e 2. Uma vez recebidos, os olhos foram dissecados e configurados no modelo TAS dentro de 24 horas. Os critérios de exclusão incluíam qualquer patologia ocular. Os olhos não foram excluídos com base na idade, raça ou gênero. Para garantir a viabilidade da retina após o recebimento, as explanações da retina foram colhidas dos doadores de tecidos e cultivadas por 7 e 14 dias (Figura Suplementar 1). Essas retinas também foram dissociadas e cresceram RGCs saudáveis na cultura por 7 dias com coloração positiva para marcador RGC, proteína de ligação de RNA com splicing múltiplo (RBPMS), bem como coloração positiva da cadeia de luz de neurofilamento (NEFL) em seus neurofilamentos (Figura Suplementar 2). .
1. Preparação e esterilização de equipamentos e suprimentos
- Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista completa de suprimentos necessários, bem como números de fornecedores e catálogos.
- Antes de usar, esterilize todos os equipamentos e instrumentos por autoclaving ou usando ampolas de óxido de etileno.
2. Preparação do meio de perfusão
- Adicione 1% de estreptomicina de penicilina (10.000 penicilina U/mL, 10.000 μg/mL estreptomicina em 0,85% NaCl) e 1% L-glutamina (200 mM) a 1.000 mL de alta glicose Dulbecco's médio de Águia modificada (DMEM).
- Esterilize o meio de perfusão passando por um filtro de 0,22 μm.
3. Configuração do sistema autônomo Translaminar (TAS)
- Configurar seringas de entrada (reservatórios IOP e ICP).
- Adicione 30 mL do meio de perfusão (seção 2) a uma seringa de 30 mL. Conecte uma torneira de 3 vias à seringa de 30 mL. Conecte um filtro hidrofílico de 0,22 μm à torneira de 3 vias. Conecte um adaptador de stub Luer de 15 G ao filtro hidrofílico de 0,22 μm.
- Remova bolhas de ar da configuração da seringa. Conecte a tubulação ao adaptador de stub Luer de 15 G. Feche a porta lateral da torneira com uma tampa de bloqueio universal nãoventada. Repita para um total de duas configurações.
- Rotule uma seringa como pressão intracraniana do canal 1 (CH1 ICP) e a outra seringa como pressão intraocular do canal 2 (CH2 IOP).
- Configurar seringas de escoamento (reservatórios IOP e ICP).
- Conecte uma torneira de 3 vias a uma seringa de 30 mL. Conecte um adaptador de stub Luer de 15 G na torneira de 3 vias. Conecte a tubulação ao adaptador de stub Luer de 15 G.
- Feche a porta lateral da torneira com uma tampa de bloqueio universal nãoventada. Repita para um total de duas configurações. Rotule uma seringa como CH1 ICP e a outra seringa como CH2 IOP.
4. Preparação de globo ocular inteiro humano
NOTA: Se os olhos inteiros forem recebidos, siga o procedimento abaixo para separar o segmento anterior do segmento posterior do olho. Se os olhos forem recebidos bissecto, comece na etapa 4.4.
- Coloque um olho inteiro na solução povidone-iodo por 2 min.
- Enxágüe o olho em solução tamponada de fosfato estéril (PBS) para enxaguar o povidone-iodo. Repita duas vezes.
- Remova a adnexa de todo o globo ocular usando fórceps e tesouras. Bissecte o olho no equador para separar os segmentos anterior e posterior do olho.
- Remova a baia do nervo óptico. Remova o humor vítreo do segmento posterior.
- Apare a esclera adicional do segmento posterior, se necessário, para garantir um bom ajuste na cúpula redonda da câmara IOP (inferior). Usando fórceps, certifique-se de que a retina se espalhe uniformemente sobre o posterior do segmento.
- Configuração da câmara IOP (inferior)
- Coloque o segmento posterior humano na câmara IOP (inferior) do TAS sobre a cúpula redonda com o nervo óptico voltado para a parte superior.
- Sele o segmento posterior usando o anel O de resina epóxi com quatro parafusos, garantindo uma vedação apertada.
- Insira a tubulação nas portas DE ENTRADA e SAÍDA da câmara IOP (inferior). A seringa de entrada IOP com tubo contendo meio é inserida na porta IN e a seringa de saída IOP vazia com tubulação é inserida na porta OUT.
- Use o método push/pull para infundir lentamente o meio de perfusão na porta de entrada para preencher o copo ocular posterior, ao mesmo tempo em que puxa lentamente o meio de perfusão para fora através da seringa de saída para remover quaisquer bolhas de ar das linhas. Pare de infundir o meio uma vez que os tubos DE ENTRADA e SAÍDA estejam vazios de bolhas de ar.
- Tranque as torneiras na posição de fora. Remova a seringa de 30 mL do conjunto do filtro de porta IOP IN e reabaste nas proximidades com um total de 30 mL de meio. Substitua a seringa de 30 mL no conjunto do filtro.
-
Configuração da câmara ICP (superior)
- Coloque a câmara/tampa ICP (superior) sobre a parte de trás do segmento posterior. Certifique-se de que o nervo óptico está dentro da câmara superior. Sele a câmara superior com quatro parafusos.
- Insira a tubulação nas portas DE ENTRADA e SAÍDA da câmara ICP (superior). A seringa de entrada ICP com tubo contendo meio é inserida na porta IN e a seringa de saída ICP vazia com tubulação é inserida na porta OUT.
- Infundir suavemente e lentamente o meio na porta IN para encher a câmara ICP e remover bolhas de ar das linhas usando o método push/pull. Pare de infundir o meio uma vez que a câmara ICP, bem como a tubulação IN e OUT são vazias de bolhas de ar.
- Tranque as torneiras na posição de fora. Remova a seringa de 30 mL da ICP no conjunto do filtro de porta e reabastecida com um total de 30 mL de meio. Substitua a seringa de 30 mL no conjunto do filtro.
5. Configuração do sistema de gravação de dados
NOTA: O sistema de gravação de dados é composto por uma fonte de energia de 8 canais, amplificador de ponte multicanal, transdutores de pressão hidrostática e um computador com software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais). O seguinte descreve como configurar e calibrar o sistema.
- Conecte o cabo de alimentação na parte de trás da fonte de alimentação de 8 canais e conecte-se a um dispositivo de backup da bateria.
- Conecte o cabo USB da fonte de alimentação de 8 canais na parte de trás do computador.
- Conecte a fonte de energia de 8 canais ao amplificador de ponte multicanal usando o cabo I2C fornecido.
- Conecte os cabos Bayonet Neill-Concelman (BNC) nas entradas do canal em frente à fonte de energia de 8 canais e à extremidade dos cabos nos canais correspondentes na parte traseira do amplificador multicanal.
- Conecte os cabos transdutores à frente do amplificador multicanal.
- Instale o software de aquisição de dados no computador.
- Execute o instalador de configuração de software de aquisição de dados a partir do CD de software fornecido.
- Siga as instruções na tela do computador.
- Quando a instalação estiver concluída, selecione Terminar.
- Ligue a fonte de energia de 8 canais.
- Ligue o computador e inicie o software de aquisição de dados.
- Selecione | de arquivos Novo.
- Selecione | de configuração Configurações do canal. Selecione três canais (inferior esquerdo da tela). Na coluna Título do Canal renomeia os canais da seguinte forma: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- Selecione 2 mV para o Intervalo em todos os canais. Na coluna Cálculo selecione Não Cálculo para os canais 1 e 2.
- Na coluna Cálculo selecione Aritmética para o canal 3. Na seção Fórmula : Selecione canais/CH2; Selecione aritmética "-"; Selecione canais/CH1. Na seção Saída selecione mmHg. Selecione OK. Selecione OK novamente.
- Configure e calibrar os transdutores de pressão hidrostática.
NOTA: Os transdutores de pressão hidrostática devem ser calibrados antes dos experimentos usando o seguinte método.- Conecte os transdutores de pressão hidrostática às linhas transdutoras ligadas ao amplificador da ponte multicanal.
- Conecte uma seringa de 30 mL cheia de ar à porta lateral do transdutor de pressão CH1 (ICP). Conecte o esfigmomanômetro à parte inferior do transdutor de pressão CH1 (ICP).
- No gráfico, veja a página do software de aquisição de dados, defina a velocidade de amostragem à esquerda clicando na seta ao lado do tempo de amostragem e selecione 100. Em seguida, clique com o botão direito do mouse na área CH1 (ICP) da página.
- Selecione Bridge Amp. Selecione Filtro de rede. Selecione Zero e aguarde que o sistema zero, tomando cuidado para não mover o transdutor de pressão.
- Aperte as abas brancas do transdutor de pressão e empurre o ar através do transdutor até que 40 mmHg seja obtido no esfigmomanômetro. Solte as abas brancas e remova a seringa e o esfigmomanômetro.
- Na página Conversão de Unidades , selecione o sinal 'menos (-)'. Destaque o platô mais alto para indicar 40 mmHg. Clique na Seta para o ponto 1 e digite 40.
- Destaque o platô mais baixo para indicar 0 mmHg. Clique na Seta para o ponto 2 e digite 0. Selecione mmHg para as unidades. Selecione OK.
- Selecione OK (página Bridge Amp). Repita as etapas 9.1-9.7 para CH2 (IOP) usando 100 mmHg para o planalto mais alto e 0 para o planalto mais baixo.
- Conecte a unidade do segmento TAS/posterior ao sistema de aquisição de dados.
- Coloque a unidade do segmento TAS/posterior em uma incubadora (37 °C, 5% DE CO2). Conecte a tubulação ICP da porta OUT ao transdutor de pressão CH1 (ICP).
- Conecte a tubulação IOP da porta OUT ao transdutor de pressão CH2 (IOP).
- Conecte as configurações de seringa (ICP e IOP) com meio das portas IN ao suporte do anel.
- Na página de exibição do gráfico selecione Iniciar amostragem. Defina a velocidade de amostragem à esquerda clicando na seta ao lado do tempo de amostragem e selecione Lento e 1 min.
- Ajuste as seringas no suporte do anel para cima ou para baixo para regular as pressões ICP e IOP aos requisitos do protocolo.
- Realize a reposição sistêmica do meio no sistema a cada 48-72 h através do método push and pull.
6. Recuperação e análise de dados
- Abra o arquivo de dados no software de aquisição de dados.
- Na seção Data Pad , clique no ícone Adicionar várias vezes ao Data Pad . Uma nova janela aparecerá.
- Na seção Localizar usando o tempo do menu suspenso.
- Na seção Selecionar 1 hora a cada 1 hora nos menus suspensos.
- Na seção Passo através de arquivo inteiro , clique em Adicionar.
- Na seção Data Pad clique no ícone Data Pad View . Destaque todos os dados e copie/cole em uma planilha.
- Calcule os desvios médios e padrão para IOP, ICP e TLPG para cada 24 horas. Coleto os dados usando a opção de tabela dinâmica em um programa de planilha e gráfico.
7. Imunohistoquímica e hematoxilina e eosina de segmentos posteriores
- Remova os segmentos posteriores dos olhos seguindo vários pontos de tempo do modelo TAS e fixe em formalina antes da parafinação.
- Seção os olhos para produzir planos de tecido sagital.
- Desparafinar os segmentos embarcados parafina com uma solução 100% xileno, 95% etanol, 50% de etanol.
- Lave os slides com PBS por 10 minutos e bloqueie com um tampão de bloqueio à temperatura ambiente por 1h.
- Seções de rótulo com anticorpos primários: anti-colágeno IV (Marcador de Matriz Extracelular (ECM), NB120-6586, 1:100) e anti-laminina (marcador ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marcador RGC), GTX118619, 1:50).
- Detecte os anticorpos primários usando anticorpos secundários Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 anti-coelho de cabra, A11008, 1:500).
- Contra-retiver os núcleos celulares usando a solução anti-fade DAPI.
- Capture imagens das seções manchadas e imagens de fase com lentes objetivas de 4x e 10x usando um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais).
- Para a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), processe as seções em um sistema automatizado de coloração (ver Tabela de Materiais) para desparafinação utilizando 100%, xileno 95% etanol, solução de 50% etanol e mancha com H&E.
- Capture imagens com as lentes objetivas 4x e 10x usando um microscópio com uma fonte de luz de campo brilhante.
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Representative Results
Projeto e criação do sistema autônomo translaminar
O diferencial de pressão translaminar é um mecanismo-chave potencial na patogênese de várias doenças, incluindo o glaucoma. Os usos para o modelo descrito incluem, mas não se limitam a, o estudo do glaucoma (IOP elevado, talvez diminuição da ICP), lesão cerebral traumática (ICP elevada) e exposição a longo prazo à deficiência visual associada à microgravidade (ICP elevada, IOP elevada). Para ajudar a descobrir a patogênese molecular visando a pressão translaminar no olho humano, nós projetamos, criamos e validamos o modelo TAS. Nosso novo modelo humano ex vivo oferece um sistema pré-clínico único para estudar independentemente as alterações patogênicas associadas ao ICP e ao IOP. Para lidar com aplicações pré-políticas humanas, nosso modelo fornece um paradigma ex vivo de estudar patogênese devido a alterações de pressão translaminar. O design do modelo lacrado é retratado com vistas sólidas frontais e transparentes (Figura 1A, 1B) com uma visão diagramática detalhada do modelo para retratar todas as portas de entrada e saída (Figura 1C). A visão transparente de cor com um segmento posterior humano em um modelo impresso 3D real é mostrada (Figura 1D, 1E).
Sistema Autônomo Translaminar: Um novo modelo de pressão translaminar humano ex vivo
Geramos o modelo TAS com duas câmaras autônomas (ou seja, câmaras IOP e ICP). Na base inferior do modelo, o copo posterior humano foi colocado sobre a cúpula redonda com o nervo óptico voltado para a parte superior. Uma vez que o copo posterior foi colocado e selado na câmara IOP, colocamos a câmara ICP em cima do nervo. Mantivemos a independência de ambas as câmaras e um selo perfeito usando anéis O que se encaixam precisamente em cada câmara (Figura 2A). A câmara inferior ou a câmara IOP encheu e regularam a pressão no copo, enquanto a câmara superior se encaixa em torno do nervo óptico e regulava a ICP em torno do nervo através de reservatórios de pressão hidrostática. Usando o modelo, regulamos independentemente o IOP e o ICP usando pressão hidrostática. A diferença entre ambas as câmaras foi identificada como uma mudança no gradiente de pressão translaminar (Figura 2B). O modelo retratado com todos os encaixes finais no local, incluindo as seringas do reservatório de entrada e saída conectadas, é mostrado na Figura 2C.
Manutenção de cultura e pressão bem sucedidas no sistema autônomo translaminar
Para garantir que ambas as câmaras funcionassem de forma independente no sistema, regulamos vários diferenciais de pressão mantendo a câmara IOP e o ICP em diferentes diferenciais médios de pressão (TLPG normal: IOP: ICP, 15:5 mmHg; TLPG elevado >10 mmHg; TLPG elevado >20 mmHg). Testamos inicialmente a manutenção de diferenciais de pressão normais médios em ambas as câmaras (IOP/ICP normal) através de vários parâmetros diferentes das condições de IOP e ICP: 1) IOP normal: ICP reduzida (Figura 3A); 2) IOP elevado: ICP reduzida (Figura 3B); e 3) IOP elevado: ICP elevada (Figura 3C). O IOP normal médio varia de 10 a 21 mmHg (pressão venosa episcleral fatorada) e ICP normal de 5 a 15 mmHg. Em vez da limitação de não ter pressão vascular, ainda mantivemos a pressão para essas taxas, pois a ideia era exercer a pressão máxima no ONH. Regulamos independentemente vários níveis de pressão em ambas as câmaras (ICP, 5-10 mmHg; IOP, 20-40 mmHg). Para garantir a manutenção da pressão entre ambas as câmaras, mantivemos o IOP em condições normais (15 mmHg) e diminuímos a ICP (4 mmHg) para sustentar um TLPG (IOP-ICP) entre a LC de 11 mmHg (Figura 3A). Em seguida, elevamos iOP (43 mmHg) e diminuímos iCP (3 mmHg) (Figura 3B) e, finalmente, elevamos as pressões em ambas (IOP, 64 mmHg; ICP, 9 mmHg) para gerar o maior nível de TLPG a 55 mmHg (Figura 3C). Para garantir a viabilidade do tecido (Figura 4), o meio nos tecidos foi trocado a cada 48 horas, anexando uma seringa vazia à torneira de saída e empurrando lentamente aproximadamente 5 mL de meio de perfusão através da porta de entrada usando o método push/pull. Os aumentos mínimos de pressão ocorreram no momento da troca média (Figura 4G) e não afetaram a morfologia do ONH, como mostrado nos dados de imunohistoquímica de 14 e 30 dias (Figura 4A-F). Para confirmar que poderíamos cultivar segmentos posteriores para prazos estendidos com viabilidade efetiva dentro do modelo TAS, analisamos seções transversais do ONH após a manutenção de IOP e ICP normais por 14 e 30 dias. Conseguimos cultivar com sucesso esses segmentos no modelo por 14 dias (Figura 4A, 4B) com células ONH saudáveis e expressão de matriz extracelular de colágeno IV (COLIV) na cabeça do nervo óptico (Figura 4C). Viabilidade e manutenção semelhantes do segmento posterior também foram observadas durante 30 dias (Figura 4D, 4E) com expressão de COLIV e DAPI (Figura 4F). A representação gráfica dos valores TLPG (IOP-ICP) (Figura 4G) retrata uma manutenção constante dos valores de IOP ao longo do tempo em 15,6 ± média de 4,6 mmHg e ICP em 11,0 ± 4,6 mmHg por 30 dias com um TLPG de 4,6 ± 1,3 mmHg (Tabela 1).
Alterações morfológicas no pós ONH gradiente de pressão translaminar elevado
Uma característica clínica comum do glaucoma da doença neurodegenerativa relacionada à idade é o cupping ONH. O cupping pré-laminar é distinguido pela perda progressiva de tecidos neurais pré-laminares, o que aumenta tanto a profundidade quanto a largura do copo e, portanto, aumenta a relação copo-disco. O cupping laminar é baseado em tecido conjuntivo, com a LC movendo-se posteriormente progressivamente e escavando. O cupping glaucomatous é uma combinação desses dois componentes, refletindo tanto o dano quanto a remodelagem dos tecidos conjuntivos laminar. A elevação no IOP leva ao espessamento da LC devido ao aumento da massa fibrila do colágeno53. Utilizando o modelo TAS, criamos um TLPG elevado aumentando o IOP ou diminuindo a ICP ao longo de vários pontos de tempo. Mantivemos uma faixa de TLPG elevado por 7 dias com valores médios de IOP ao longo do tempo em 22,8 ± média de 18,6 mmHg e ICP em 6,9 ± 7,6 mmHg com um TLPG de 15,9 ± 11,8 mmHg (Tabela 2). Os TLPGs mais altos foram documentados em 36 mmHg. Os segmentos posteriores humanos foram então analisados morfologicamente para espessamento progressivo de feixes laminar e cupping no ONH em seções manchadas de H&E à medida que o tempo progredia entre o controle, 1 dia, 3 dias e 7 dias sob TLPG elevado (Figura 5A-D). O cupping e o espessamento foram observados em 7 dias de TLPG elevado (Figura 5D). Além disso, a expressão de COLIV ao longo do tempo entre controle, 1 dia, 3 dias e 7 dias mostrou feixes espessados e aumento da expressão em 7 dias (Figura 5E-H). Imagens de fase comparando tecido de controle não cultivado no modelo TAS (Figura 5I) e 7 dias (Figura 5J) de TLPG elevado dentro do modelo TAS mostram RGCs saudáveis dentro do GCL (Figura 5I) sem cupping (Figura 5I) para o controle, enquanto em condições de TLPG elevado as imagens mostram um cupping extenso sem RGCs restantes (marcador RBPMS-RGC) na RNFL (Figura 5J) e maior remodelação do ECM, como mostrado pelo COLIV elevado dentro do ONH (Figura 5J).
Figura 1: Sistema autônomo Translaminar. Representação de modelo. (A) Visão frontal sólida. (B) Visão transparente. (C) Visão diagramática. (D) Visualização transparente de cor. (E) Modelo impresso 3D real. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mecânica do sistema autônomo translaminar. (A) O modelo TAS com câmaras ICP e IOP para regulação de diferenciais de pressão translaminar. (B) Representação do modelo TAS com regulação autônoma da pressão hidrostática em ambas as câmaras através da elevação dos reservatórios. (C) Imagem do modelo TAS com todas as encaixes no lugar e representação das seringas do reservatório de entrada e saída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Manutenção independente de pressão dentro do sistema autônomo translaminar. Representação gráfica de pressões sendo moduladas independentemente, e pressões estáveis sendo mantidas nas câmaras superior (ICP) e inferior (IOP) com IOP/ICP (A) normal IOP/ICP (B) elevada IOP/DECREASED ICP, e (C) IOP elevado/ICP elevado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Manutenção e viabilidade de segmentos posteriores dentro do sistema autônomo translaminar. Os segmentos posteriores humanos foram cultivados utilizando-se o modelo TAS durante 14 e 30 dias em condições normais de IOP e ICP. Seções transversais manchadas de ONH humanas em 14 dias em (A) baixa ampliação (40x) e (B) alta ampliação (100x). (C) Imunostaining COLIV com expressão DAPI (100x). Representações similares de manchas de H&E em 30 dias em (D) 40x e (E) micrografos 100x e (F) COLIV imunostaining com expressão DAPI (100x). G) Apresentação gráfica de Δ em mmHg de IOP-ICP (TLPG) para segmentos posteriores humanos mantidos por 30 dias em cultura. COLIV = verde; DAPI = azul; (A, inset B); (D, inset E); H&E = hematoxilina e mancha de eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Reestruturação morfológica da cabeça do nervo óptico após gradiente elevado de pressão translaminar no Sistema Autônomo Translaminar. Os segmentos posteriores humanos foram cultivados utilizando-se o modelo TAS para vários pontos de tempo em condições elevadas de TLPG. Seções transversais do ONH humano representando a coloração H&E do controle (A) (B) 1 dia em TAS (C) 3 dias em TAS, e (D) 7 dias de cultura. Expressão de COLIV com DAPI no ONH de (E) controle (F) 1 dia em TAS (G) 3 dias em TAS, e (H) 7 dias em cultura. Contraste de fase Imagens de seção transversal ONH de (I) controle ONH representando (I') mancha de retina de RBPMS e (I'') mancha ONH com COLIV e DAPI. Contraste de fase de (J) 7 dias de TLPG elevado em TAS com insets representando (J') coloração de retina de RBPMS e (J'') onh colorindo com COLIV e DAPI. COLIV, RBPMS = verde; DAPI = azul; (A-D) ampliação de 40x; (E-H) 100x Ampliação; (I e J) ampliação de 200x; (J') ampliação de 400x; (J'') ampliação de 100x; (J, inset J' e J''); H&E = hematoxilina e mancha de eosina; TAS = Sistema Autônomo Translaminar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Dias | IOP médio de 24 h | ICP média de 24 h | TLPG médio (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| AVG | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| DST | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
Tabela 1: Manutenção de TLPG normal mantido por 30 dias. Os valores tabulares que retratam valores IOP, ICP e TLPG a cada 24 horas com desvio médio e padrão ao longo do curso de tempo completo.
| Dias | IOP médio de 24 h | ICP média de 24 h | TLPG médio de 24 h |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| AVG | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| DST | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
Tabela 2: Manutenção de uma gama de TLPG elevado mantido por 7 dias. Os valores tabulares que retratam valores IOP, ICP e TLPG a cada 24 horas com desvio médio e padrão ao longo do curso de tempo completo.
Figura suplementar 1: Ex vivo cultura de exproplantação de retina humana. Contraste de fase, RGC manchado positivo (RBPMS-verde) e imagens manchadas de celular (DAPI-azul) de explants retinais na cultura por (A-C) 7 dias e (D-F) 14 dias (ampliação de 200x). Clique aqui para baixar este número.
Figura Suplementar 2: Culturas de RGC adultos humanos. Marcador RGC (RBPMS-verde) e DAPI (azul) mancharam RGCs 7 dias na cultura (A) 200x (B) 400x de ampliação. (C) RGCs manchados para NEFL (verde) e DAPI (azul) a ampliação de 400x. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Os tecidos pós-morte humanos são um recurso especialmente valioso para estudar doenças neurodegenerativas humanas porque a identificação de potenciais drogas desenvolvidas em modelos animais precisa ser traduzível para humanos47. Os efeitos da elevação do IOP humano são bem estabelecidos, mas pesquisas mínimas foram realizadas sobre alterações anormais de pressão translaminar ONH. Embora existam múltiplos modelos animais e modelagem finita do ONH humano, não existem modelos humanos ex vivo para estudar mudanças de pressão translaminar41,54,55,56,57. Existe uma necessidade atual não atendida para um novo modelo humano pré-clínico que possa atingir a etiologia da doença ex vivo usando IOP e ICP e pode identificar vários paradigmas patogênicos relacionados à patogênese do glaucoma. Compreender as alterações patológicas relacionadas à pressão no ONH será crucial para evitar a morte do RGC. O uso combinado de IOP, ICP e TLPG dentro do modelo TAS é uma abordagem única para estudar a degeneração dependente da pressão de forma pré-clínica utilizando tecido do segmento posterior humano. No modelo TAS, podemos cultivar segmentos posteriores de copos oculares humanos para estudar mudanças de pressão translaminar através da regulação autônoma das câmaras IOP e ICP. Ele fornece uma base para o desenvolvimento de uma nova gama de terapêuticas que se concentram na pressão translaminar como um mecanismo de degeneração.
A configuração do modelo TAS requer atenção aos detalhes em muitos aspectos: a dissecção correta dos segmentos posteriores humanos, garantindo que a retina esteja intacta e espalhada sobre o copo posterior, colocação adequada do segmento sobre a cúpula da câmara IOP, situando com precisão a câmara ICP sobre o ON, vedação eficaz de ambas as câmaras, e manutenção de pressões hidrostáticas independentemente regulando a altura dos reservatórios IOP e ICP. A dissecção precisa ser realizada em olhos que não sejam mais do que 24-36 h após a morte, porque a retina se deteriora progressivamente se o meio de cultura eficaz não for reabastecido. A reposição sistêmica do meio foi realizada em nosso sistema a cada 48-72 h. Outro aspecto crucial do sistema é a duração do ON. É fundamental garantir que pelo menos 0,5-1 cm de ON seja deixado no olho cadavérico. Os olhos do doador não devem ser usados se tiverem ONs curtos, o ON estiver danificado, o globo estar comprometido e esvaziado, ou a bainha ON for destacada. Além disso, ao colocar o segmento posterior sobre a cúpula, o anel O deve estar bem encaixado no lugar e a câmara ICP superior selada corretamente com parafusos. Os encaixes de pinos onde o tubo se prende em cada lado da base superior e inferior do modelo também precisam ser testados para garantir que a tubulação se encaixe e bloqueie no lugar. Se a tubulação não estiver corretamente no lugar, bolhas de ar serão observadas dentro da tubulação e comprometerão as medidas de pressão dentro de cada câmara.
A manutenção e viabilidade dos segmentos posteriores pós-morte em nosso modelo TAS foi uma preocupação crítica para este protocolo. O tecido pós-morte humano já foi extensivamente estudado48,49, com um estudo recente de análise de RNA de 1.068 tecidos doadores pós-morte confirmando que o tecido cerebral humano pós-morte coletado ao longo de décadas pode servir como material de alta qualidade para estudo de distúrbios humanos47. Além disso, foi realizado o perfil de expressão anteriormente bem sucedido de tecidos oculares de doadores humanos após a morte. Expressões genéticas Os valores PLIER para genes de apoptose foram mínimos ou inexistentes neste conjunto de dados para tecido retiniano 6 h pós-morte58. Além disso, foi demonstrado que o armazenamento hipotérmico do tecido ocular pode ser realizado efetivamente59. Foi demonstrado que a atividade celular de gânglio é mantida por 50 h quando os olhos de miniporco são armazenados em condições isquêmicas e hipotérmicas41,60. Por isso, utilizamos o ponto de tempo de 6h como nossos critérios de inclusão para coleta de óculos de doador. A velocidade de deterioração pós-morte dos segmentos posteriores e do descolamento da retina está em falta na literatura, mas nossa enucleação dentro de 6h, entrega sobre gelo e configuração cultural de máxima de 36 h está bem dentro da faixa de viabilidade tecidual representada na Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2. Utilizando o modelo TAS, conseguimos com sucesso a manutenção saudável do tecido por 30 dias.
Outra limitação do modelo TAS é a nossa incapacidade atual de modelar os ritmos circadianos cíclicos de ICP e IOP que são observados em condições fisiológicas normais. Isso pode ser abordado no futuro usando uma bomba que pode regular a infusão rítmica de IOP e ICP. Além disso, outra ressalva ao modelo é a falta de circulação sanguínea dentro do olho cadavérico. Assim, os efeitos da pressão arterial não podem ser estudados, mas isso também nos permite delinear especificamente os efeitos patogênicos de apenas alterações de TLPG, incluindo IOP e ICP.
Um escopo futuro do modelo incorporaria a automação dos sistemas de reservatórios para alterações hidrostáticas e perfusão de médio através de uma bomba de infusão com uma seringa vazia de saída no transdutor em vez das múltiplas rodadas de mudança média que foram implementadas neste protocolo. O fluido do iop e do reservatório ICP também pôde ser coletado e analisado. O meio pode ser coletado para expressão biomarcadora para direcionar futuras terapias. Também podemos identificar caminhos ou moléculas que podem ser tratadas com drogas ou terapia genética e testar essas terapias em vários modelos animais de ICP antes da tradução para testes clínicos em humanos.
Em conclusão, nosso modelo não só fornece uma base humana de testes, mas também pode ser utilizado para validar terapias que podem direcionar mudanças de pressão translaminar no olho. Abre uma avenida para a realização da medicina de precisão através do transplante de células-tronco do paciente em óculos de doador humano e pressurizá-las no modelo TAS. Isso nos permite testar terapias ex vivo com capacidade de serem traduzíveis para a clínica e relacionáveis a indivíduos vivos. Com nosso modelo, podemos agora avaliar as mudanças que ocorrem na pressão translaminar e como ela desempenha um papel crucial na patogênese associada a várias doenças traumáticas e neurodegenerativas. Isso levará a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares patogênicos no ONH que estão associados ao IOP e ao ICP.
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Disclosures
Os autores do manuscrito não têm potenciais conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
O financiamento para este projeto foi através de fundos discricionários da Dra. Este trabalho foi apoiado em parte por uma subvenção irrestrita da Research to Prevent Blindness, Inc. ao UW Madison Department of Oftalmology and Visual Sciences. Agradecemos aos Drs. Abbot F. Clark e Weiming Mao por sua assistência técnica com o modelo de cultura de órgãos de perfusão. Agradecemos ao Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) por fornecer os olhos dos doadores humanos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
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