Summary
نحن نصف ونفصل استخدام نظام الحكم الذاتي عبرلامينار. يستخدم هذا النظام الجزء الخلفي البشري لتنظيم الضغط داخل الجزء (داخل العين) المحيط بالعصب البصري (داخل الجمجمة) بشكل مستقل لتوليد تدرج ضغط عبرلامينار يحاكي ميزات الاعتلال العصبي البصري الجلوكوماتو.
Abstract
هناك حاجة حالية غير ملباة لنموذج بشري جديد قبل السريري يمكنه استهداف مسببات الأمراض في الجسم الحي باستخدام الضغط داخل الجمجمة (ICP) والضغط داخل العين (IOP) الذي يمكنه تحديد النماذج المسببة للأمراض المختلفة المتعلقة بمسببات الأمراض الزرق. وقد سبق أن استخدمت نماذج ثقافة الأعضاء التشوية البشرية الحية بشكل ناجح وطبقت كتكنولوجيات فعالة لاكتشاف مسببات الأمراض الزرق واختبار العلاجات. يمكن أن يكون فحص الأدوية قبل السريرية والأبحاث التي أجريت على أجهزة الأعضاء البشرية السابقة للحيوية أكثر قابلية للترجمة إلى الأبحاث السريرية. تصف هذه المقالة بالتفصيل جيل وتشغيل نموذج ضغط عبرlaminar الإنسان الجديد في الجسم الحي يسمى النظام المستقل عبرlaminar (TAS). ويمكن لنموذج TAS أن ينظم بشكل مستقل برنامج المقارنات الدولية والمؤتمر الدولي للبراءات باستخدام شرائح بشرية من المانحين الخلفيين. يسمح النموذج لدراسة الإمراض بطريقة ما قبل السريرية. يمكن أن تقلل من استخدام الحيوانات الحية في أبحاث العيون. على النقيض من النماذج التجريبية في المختبر ، يمكن أيضا الحفاظ على بنية أنسجة رأس العصب البصري (ONH) وتعقيدها وسلامتها داخل نموذج EX vivo TAS.
Introduction
وتشير التقديرات العالمية في الدراسات الاستقصائية الأخيرة إلى أن 285 مليون شخص يعانون من ضعف البصر، بمن فيهم 39 مليون شخص مصابون بالعمى1. في عام 2010، وثقت منظمة الصحة العالمية أن ثلاثة من الأسباب الرئيسية التسعة المذكورة للعمى تحدث في الجزء الخلفي من العين1. أمراض العين الجزء الخلفي تنطوي على شبكية العين، المشيمية، والعصب البصري2. الشبكية والعصب البصري هما امتدادات الجهاز العصبي المركزي (CNS) للدماغ. تكون محاور عصبية خلية العقدة الشبكية (RGC) عرضة للتلف لأنها تخرج من العين من خلال رأس العصب البصري (ONH) لتشكيل العصب البصري3. يبقى ONH النقطة الأكثر عرضة للمكونات RGC بسبب شبكة ثلاثية الأبعاد من حزم الأنسجة الضامة تسمى cribrosa الصفيحة (LC)4. وONH هو الموقع الأولي للإهانة إلى محاور RGC في الزرق5,6,7, وقد درست التغيرات التعبير الجيني داخل ONH في ارتفاع ضغط الدم العيني والزرق models8,9,10. محاور RGC عرضة في ONH بسبب فروق الضغط بين المقصورة داخل العين، وتسمى الضغط داخل العين (IOP)، وداخل الفضاء الخارجي تحت العنكبوتية المحيطة بالبطانية، ودعا الضغط داخل الجمجمة (ICP)11. تفصل منطقة LC كلا المنطقتين، وتحافظ على فروق الضغط الطبيعية، حيث يتراوح معدل IOP بين 10-21 مم زئبق و ICP من 5 إلى 15 مم زئبق12. ويسمى فرق الضغط من خلال الصفيحة بين الغرفتين تدرج الضغط عبرلامينار (TLPG)13. عامل الخطر الرئيسي للزرق هو ارتفاع IOP14.
زيادة IOP يزيد من سلالة داخل وعبر المنطقة صفح6,15,16. تقدم الملاحظات التجريبية في البشر والنماذج الحيوانية ONH كموقع أولي للتلف المحوري17,18. النموذج الميكانيكي الحيوي للإجهاد والإجهاد المرتبط ب IOP الذي يسبب تلف الزرق في ONH يؤثر أيضا على الفيزيولوجيا المرضية للجلوكوما19،20،21. على الرغم من أن التغيرات الناجمة عن الضغط على البشر تلحق ضررا ميكانيكيا بمكونات RGC22 ، إلا أن القوارض التي تفتقر إلى الصفائح الكولاجينية داخل الصفيحة يمكن أن تتطور أيضا إلى الزرق 7،23. بالإضافة إلى ذلك ، لا يزال ارتفاع IOP عامل الخطر الأبرز في مرضى الزرق في الزاوية المفتوحة الأولية ، في حين أن مرضى الجلوكوما التوتر الطبيعي يصابون باعتلال الأعصاب البصرية الزرقاء حتى بدون IOP مرتفعة. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا مجموعة فرعية من مرضى ارتفاع ضغط الدم العيني التي تظهر أي تلف الأعصاب البصرية. وقد اقترح أيضا أن ضغط السائل النخاعي (CSFp) قد تلعب دورا في مسببات الأمراض الزرق. وتشير الأدلة إلى أن برنامج المقارنات الدولية يخفض إلى ~5 ملم زئبق في مرضى الزرق مقارنة بالأفراد العاديين، مما يسبب زيادة الضغط عبر اللمينر ويلعب دورا حاسما في المرض24,25. في السابق ، كان من الواضح في نموذج ال ، أنه من خلال التحكم في تغييرات IOP و CSFp ، يمكن أن يكون هناك إزاحات كبيرة من القرص البصري26. كما أظهر رفع CSFp في عيون البورسين زيادة السلالة الرئيسية داخل منطقة LC والأنسجة العصبية retrolaminar. وتساهم زيادة الضغط على RGCs ومنطقة LC في انسداد النقل المحوري وفقدان RGCs27. وقد ارتبط الانحطاط التدريجي ل RGCs بفقدان الدعم الغذائي28,29، وتحفيز العمليات الالتهابية/التنظيم المناعي30,31، والمؤثرات المبرمج29,32,33,34,35. بالإضافة إلى ذلك، تسبب الإصابة المحورية (الشكل 3) آثارا ضارة على RGCs، مما يؤدي إلى فشل تجديدي36,37,38,39. على الرغم من أن آثار IOP قد درست بشكل جيد، وقد أجريت الحد الأدنى من البحوث على تغيرات ضغط عبرlaminar غير طبيعية. تركز معظم علاجات الزرق على تثبيت IOP. ومع ذلك ، على الرغم من أن خفض IOP يبطئ تطور المرض ، فإنه لا يعكس فقدان المجال البصري ويمنع الخسارة الكاملة ل RGCs. سيكون فهم التغيرات العصبية المرتبطة بالضغط في الزرق أمرا حاسما لمنع وفاة RGC.
تشير الأدلة الحالية إلى أن تعديل الضغط عبرلامينار بسبب التغيرات الميكانيكية أو البيولوجية أو الفسيولوجية المختلفة في المرضى الذين يعانون من إعاقات بصرية مؤلمة أو عصبية يمكن أن يسبب فقدانا كبيرا للرؤية. حاليا، لا يوجد نموذج حقيقي الجزء الخلفي البشري قبل السريرية التي يمكن أن تسمح لدراسة الضرر الميكانيكا الحيوية الزرقاء داخل ONH الإنسان السابق فيفو. مراقبة وعلاج الجزء الخلفي من العين هو تحد كبير في طب العيون27. هناك حواجز جسدية وبيولوجية لاستهداف العين الخلفية، بما في ذلك ارتفاع معدلات الإزالة، حاجز الدم الشبكية، والاستجابات المناعية المحتملة40. يتم إنجاز معظم اختبارات الفعالية والسلامة لأهداف الأدوية الجديدة باستخدام النماذج الخلوية المختبرية وفي النماذج الحيوانية الحية41. تشريح العين معقد، والدراسات المختبرية لا تحاكي بدقة الحواجز التشريحية والفسيولوجية التي تقدمها أنظمة نموذج الأنسجة. على الرغم من أن النماذج الحيوانية هي ضرورة للدراسات الدوائية، قد تختلف فسيولوجيا العين بالعين الخلفية البشرية بين أنواع الحيوانات المختلفة، بما في ذلك التشريح الخلوي للشبكية، الأوعية الدموية، و ONH41،42.
يتطلب استخدام الحيوانات الحية لوائح أخلاقية مكثفة ومفصلة ، والتزاما ماليا عاليا ، وقابلية فعالة لإعادة الإنتاج43. وفي الآونة الأخيرة، تلت ذلك مبادئ توجيهية أخرى متعددة للاستخدام الأخلاقي للحيوانات في البحوث التجريبية44,45,46. البديل لاختبار الحيوانات هو استخدام نماذج العين البشرية في الجسم الحي السابق للتحقيق في مسببات الأمراض والتحليل المحتمل للأدوية لحماية أضرار ONH. الأنسجة البشرية بعد الوفاة هي مورد قيم لدراسة نماذج الأمراض البشرية ، خاصة في حالة الأمراض العصبية البشرية ، لأن تحديد الأدوية المحتملة التي تم تطويرها في النماذج الحيوانية يتطلب الحاجة إلى أن تكون قابلة للترجمة إلى humans47. وقد استخدمت الأنسجة المانحة البشرية في الجسم الحي على نطاق واسع لدراسة الاضطرابات البشرية47,48,49، وقد قدمت نظم زراعة الأعضاء الأمامية البشرية نموذج ا فريدا من نوعه لدراسة الفيزيولوجيا المرضية ل IOP50,51,52 المرتفعة.
لدراسة الضغط عبرlaminar المتعلقة IOP و ICP في عيون الإنسان، ونحن بنجاح تصميم وتطوير نظام مستقل عبرlaminar غرفتين (TAS) التي يمكن أن تنظم بشكل مستقل IOP و ICP باستخدام شرائح الخلفي من عيون المانحين الإنسان. هذا هو أول نموذج الإنسان في الجسم الحي لدراسة الضغط عبرlaminar واستغلال الآثار الميكانيكية الحيوية من TLPG على ONH.
يمكن استخدام هذا النموذج TAS الإنسان السابق فيفو لاكتشاف وتصنيف التعديلات الخلوية والوظيفية التي تحدث بسبب الارتفاع المزمن لل IOP أو ICP. في هذا التقرير، نقوم بتفصيل بروتوكول تشريح وإعداد ومراقبة نموذج الجزء الخلفي البشري TAS. سيسمح البروتوكول للباحثين الآخرين بإعادة إنتاج نموذج الجزء الخلفي البشري المضغوط الجديد بشكل فعال لدراسة مسببات الأمراض الميكانيكية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على العيون وفقا لأحكام إعلان هلسنكي للبحوث التي تنطوي على الأنسجة البشرية.
ملاحظة: تم حصاد عيون من بنوك العيون ذات السمعة الطيبة (على سبيل المثال، معهد ليونز للعيون للزراعة والبحوث وتامبا فلوريدا) في غضون 6-12 ساعة من الوفاة وتم اختبار مصل المتبرع لالتهاب الكبد B والتهاب الكبد C وفيروس نقص المناعة البشرية 1 و 2. وبمجرد استلامها، تم تشريح العينين وإقامة في نموذج TAS في غضون 24 ساعة. وشملت معايير الاستبعاد أي أمراض العين. لم يتم استبعاد العيون على أساس العمر أو العرق أو الجنس. ولضمان بقاء الشبكية عند استلامها، تم حصاد النباتات الشبكية من المتبرعين بالأنسجة وزرعت لمدة 7 أيام و 14 يوما (الشكل التكميلي 1). كما تم فصل هذه الشبكية ونمت RGCs صحية في الثقافة لمدة 7 أيام مع تلطيخ إيجابي لعلامة RGC، بروتين الحمض النووي الريبي ملزمة مع الربط متعددة (RBPMS)، فضلا عن سلسلة ضوء العصبية الإيجابية (NEFL) تلطيخ في الخيوط العصبية (الشكل التكميلي 2). .
1. إعداد وتعقيم المعدات واللوازم
- راجع جدول المواد للحصول على قائمة كاملة بالإمدادات المطلوبة بالإضافة إلى أرقام الموردين والفهارس.
- قبل الاستخدام، قم بتعقيم جميع المعدات والأدوات عن طريق الالاستعباد التلقائي أو استخدام أمبولات أكسيد الإيثيلين.
2. إعداد وسيطة التغلغل
- إضافة 1٪ ستريبتوميسين البنسلين (10،000 U/mL البنسلين، 10،000 ميكروغرام / مل ستريبتومايسين في 0.85٪ NaCl) و 1٪ L-الجلوتامين (200 mM) إلى 1،000 مل عالية الجلوكوز Dulbecco المعدلة النسر المتوسطة (DMEM).
- تعقيم وسيط التغلغل عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر.
3. نظام مستقل Translaminar (TAS) الإعداد
- إعداد المحاقن الداخلة (خزانات IOP و ICP).
- أضف 30 مل من وسيط التشوه (القسم 2) إلى حقنة سعة 30 مل. إرفاق stopcock 3-الاتجاه إلى حقنة 30 مل. إرفاق مرشح هيدروفيلي 0.22 ميكرومتر إلى stopcock 3-way. قم بتوصيل محول كعب روتين 15 G Luer بتصفية هيدروفيلية 0.22 ميكرومتر.
- إزالة فقاعات الهواء من إعداد حقنة. قم بتوصيل الأنابيب إلى محول كعب روتين 15 G Luer. أغلق المنفذ الجانبي للتوقف باستخدام غطاء قفل عالمي غير مفنن. كرر ما مجموعه اثنين من الاجهزة.
- تسمية حقنة واحدة على أنها ضغط داخل الجمجمة القناة 1 (CH1 ICP) والمحاقن الأخرى كضغط داخل العين القناة 2 (CH2 IOP).
- إعداد المحاقن الخارجة (خزانات IOP و ICP).
- إرفاق stopcock 3-الاتجاه إلى حقنة 30 مل. إرفاق محول كعب روتين 15 G Luer إلى stopcock ثلاثية الاتجاه. قم بتوصيل الأنابيب إلى محول كعب روتين 15 G Luer.
- أغلق المنفذ الجانبي للتوقف باستخدام غطاء قفل عالمي غير مفنن. كرر ما مجموعه اثنين من الاجهزة. تسمية حقنة واحدة باسم CH1 ICP والمحاقن الأخرى باسم CH2 IOP.
4. إعداد الإنسان الكرة الأرضية العين كله
ملاحظة: إذا تم تلقي عيون كاملة، اتبع الإجراء أدناه لفصل الجزء الأمامي من الجزء الخلفي من العين. إذا تم استلام العينين إلى قسمين، فابدأ من الخطوة 4.4.
- ضع العين بالكامل في محلول بوفيدوني اليود لمدة دقيقتين.
- شطف العين في محلول الفوسفات المعقم العازلة (PBS) لشطف قبالة بوفيدوني اليود. كرر 2 مرات.
- إزالة adnexa من الكرة الأرضية العين كله باستخدام ملقط ومقص. اقسم العين عند خط الاستواء لفصل الأجزاء الأمامية والخلفية للعين.
- إزالة غمد العصب البصري. إزالة الفكاهة الزجاجية من الجزء الخلفي.
- تقليم الصلبة إضافية من الجزء الخلفي، إذا لزم الأمر، لضمان تناسب جيد على القبة المستديرة للغرفة IOP (أسفل). باستخدام ملقط، تأكد من أن الشبكية تنتشر بالتساوي على الجزء الخلفي من الجزء.
- إعداد غرفة IOP (أسفل)
- ضع الجزء الخلفي البشري في غرفة IOP (السفلية) في TAS فوق القبة المستديرة مع العصب البصري المواجه للقمة.
- ختم الجزء الخلفي باستخدام الراتنج الايبوكسي O-حلقة مع أربعة مسامير، وضمان ختم ضيق.
- أدخل الأنابيب في منافذ IN و OUT في غرفة IOP (السفلي). يتم إدخال حقنة تدفق IOP مع أنابيب تحتوي على وسيطة في منفذ IN ويتم إدخال حقنة تدفق IOP الفارغة مع الأنابيب في منفذ OUT.
- استخدام طريقة الدفع / السحب لبث ببطء وسيطة التغلغل في ميناء التدفق لملء كأس العين الخلفية في حين سحب في وقت واحد ببطء وسيطة التغلغل من خلال حقنة تدفق لإزالة أي فقاعات الهواء من الخطوط. التوقف عن غرس المتوسطة مرة واحدة في كل من أنابيب IN و OUT خالية من فقاعات الهواء.
- قفل stopcocks في موقف قبالة. إزالة حقنة 30 مل من IOP IN ميناء تصفية التجمع وإعادة ملء مع ما مجموعه 30 مل من المتوسطة. استبدل المحاقن التي سعة 30 مل في تجميع الفلتر.
-
برنامج المقارنات الدولية (الأعلى) إعداد الغرفة
- ضع غرفة/غطاء ICP (العلوي) على الجزء الخلفي من الجزء الخلفي. تأكد من أن العصب البصري داخل الغرفة العليا. ختم الغرفة العلوية مع أربعة مسامير.
- أدخل الأنابيب في منافذ IN و OUT في غرفة ICP (العلوية). يتم إدخال حقنة تدفق برنامج المقارنات الدولية مع أنابيب تحتوي على وسيطة في منفذ IN ويتم إدخال حقنة تدفق برنامج المقارنات الدولية الفارغة مع أنابيب في منفذ OUT.
- غرس بلطف وببطء المتوسطة في منفذ IN لملء غرفة برنامج المقارنات الدولية وإزالة فقاعات الهواء من خطوط باستخدام طريقة دفع / سحب. التوقف عن غرس المتوسطة مرة واحدة في غرفة برنامج المقارنات الدولية، فضلا عن كل من أنابيب IN و OUT خالية من فقاعات الهواء.
- قفل stopcocks في موقف قبالة. إزالة حقنة 30 مل من برنامج المقارنات الدولية في تجميع مرشح الميناء وإعادة تعبئة مع ما مجموعه 30 مل من المتوسطة. استبدل المحاقن التي سعة 30 مل في تجميع الفلتر.
5. إعداد نظام تسجيل البيانات
ملاحظة: يتكون نظام تسجيل البيانات من مصدر طاقة مكون من 8 قنوات ومضخم جسور متعدد القنوات ومحولات الضغط الهيدروستاتيكي وكمبيوتر مزود ببرنامج الحصول على البيانات (انظر جدول المواد). يصف التالي كيفية إعداد ومعايرة النظام.
- قم بتوصيل سلك الطاقة بظهر مصدر الطاقة المكون من 8 قنوات وقم بتوصيل جهاز احتياطية للبطارية.
- قم بتوصيل كبل USB من مصدر الطاقة ذو القنوات ال 8 بظهر الكمبيوتر.
- قم بتوصيل مصدر الطاقة ذو القنوات ال 8 بمضخم جسر متعدد القنوات باستخدام سلك I2C المزود.
- قم بتوصيل كابلات Bayonet Neill-Concelman (BNC) بمدخلات القناة أمام مصدر الطاقة ذو القنوات ال 8 ونهاية الكابلات في القنوات المقابلة في الجزء الخلفي من مكبر الصوت متعدد القنوات.
- قم بتوصيل كبلات محول إلى الجزء الأمامي من مكبر للصوت متعدد القنوات.
- تثبيت برنامج الحصول على البيانات على الكمبيوتر.
- تشغيل مثبت إعداد برنامج الحصول على البيانات من القرص المضغوط للبرامج المتوفرة.
- اتبع الإرشادات الموجودة على شاشة الكمبيوتر.
- عند اكتمال التثبيت، حدد إنهاء.
- قم بتشغيل مصدر الطاقة ذو القنوات ال 8.
- قم بتشغيل الكمبيوتر وبدء برنامج الحصول على البيانات.
- تحديد | الملف الجديد.
- تحديد | الإعداد إعدادات القناة. حدد ثلاث قنوات (أسفل يسار الشاشة). في العمود عنوان القناة إعادة تسمية القنوات كما يلي: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
- حدد 2 mV للنطاق على جميع القنوات. في العمود الحساب حدد لا حساب للمقنيتين 1 و2.
- في العمود الحساب حدد الحساب للقناة 3. في المقطع الصيغة : حدد قنوات/CH2; حدد حسابي "-"; حدد قنوات/CH1. في قسم الإخراج حدد مم زئبق. حدد موافق. حدد موافق مرة أخرى.
- إعداد ومعايرة محولات الضغط الهيدروستاتيكي.
ملاحظة: يجب معايرة محولات الضغط الهيدروستاتيكي قبل إجراء التجارب باستخدام الطريقة التالية.- قم بتوصيل محولات الضغط الهيدروستاتيكي بخطوط محولات متصلة بمضخم الجسر متعدد القنوات.
- إرفاق حقنة 30 مل مليئة بالهواء إلى المنفذ الجانبي للمحول ضغط CH1 (ICP). إرفاق مقياس ضغط الدم إلى الجزء السفلي من محول ضغط CH1 (ICP).
- على المخطط، عرض صفحة برنامج الحصول على البيانات، تعيين سرعة أخذ العينات عن طريق النقر على السهم إلى جانب وقت أخذ العينات وحدد 100. ثم انقر بزر الماوس الأيمن في منطقة CH1 (ICP) من الصفحة.
- حدد بريدج أمبير. حدد عامل تصفية التيار الكهربائي. حدد صفر وانتظر النظام إلى الصفر، مع الحرص على عدم تحريك محول الضغط.
- قرصة علامات التبويب البيضاء من محول الضغط ودفع الهواء من خلال محول حتى يتم الحصول على 40 ملم زئبق على مقياس الاختناق. حرر علامات التبويب البيضاء وأزل الحقنة ومقياس الاختزال.
- في صفحة تحويل الوحدات ، حدد علامة 'ناقص (-)'. تسليط الضوء على أعلى هضبة للإشارة إلى 40 ملم زئبق. انقر فوق السهم للنقطة 1 وأدخل 40.
- تسليط الضوء على أدنى هضبة للإشارة إلى 0 مم زئبق. انقر فوق السهم للنقطة 2 وأدخل 0. حدد مم زئبق للوحدات. حدد موافق.
- حدد موافق (صفحة جسر أمبير). كرر الخطوات 9.1-9.7 ل CH2 (IOP) باستخدام 100 مم زئبق لأعلى هضبة و0 لأدنى هضبة.
- قم بتوصيل وحدة المقطع الخلفي/TAS بنظام الحصول على البيانات.
- ضع وحدة الجزء الخلفي من TAS في حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO2). إرفاق أنابيب برنامج المقارنات الدولية من منفذ OUT إلى محول ضغط CH1 (ICP).
- إرفاق أنابيب IOP من منفذ OUT إلى محول ضغط CH2 (IOP).
- إرفاق الإعداد syringe (ICP و IOP) مع وسيطة من منافذ IN إلى الحامل الحلقي.
- في الصفحة عرض المخطط حدد بدء أخذ العينات. تعيين سرعة أخذ العينات عن طريق اليسار النقر على السهم بجانب وقت أخذ العينات وحدد بطيئة و 1 دقيقة.
- ضبط المحاقن على الحلبة الوقوف أو أسفل لتنظيم برنامج المقارنات الدولية و IOP الضغوط لمتطلبات البروتوكول.
- إجراء تجديد نظامي للوسط في النظام كل 48-72 ساعة من خلال طريقة الدفع والسحب.
6. استرجاع البيانات وتحليلها
- افتح ملف البيانات في برنامج الحصول على البيانات.
- في المقطع لوحة البيانات ، انقر فوق رمز إضافة متعددة إلى لوحة البيانات . ستظهر نافذة جديدة.
- في المقطع بحث عن استخدام حدد الوقت من القائمة المنسدلة.
- في القسم تحديد حدد ساعة واحدة كل ساعة واحدة من القوائم المنسدلة.
- في المقطع الخطوة من خلال حدد ملف كامل ثم انقر فوق إضافة.
- في المقطع لوحة البيانات انقر فوق رمز عرض لوحة البيانات . تمييز كافة البيانات ونسخ / لصق في جدول بيانات.
- حساب متوسط والانحرافات المعيارية ل IOP، ICP، و TLPG لكل 24 ساعة. قم بتجميع البيانات باستخدام خيار الجدول المحوري في برنامج جدول بيانات ورسم بياني.
7. الكيمياء المناعية والهيماتوكسيلين وتلطيخ اليوسين من الشرائح الخلفية
- إزالة شرائح العين الخلفية بعد نقاط زمنية مختلفة من نموذج TAS وإصلاح في الفورماليين قبل paraffinizing.
- قسم العينين لإنتاج طائرات الأنسجة القوسية.
- إزالة البارافين الأجزاء المضمنة مع 100٪ xylene، 95٪ الإيثانول، 50٪ حل الإيثانول.
- غسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة وكتلة مع عازلة حجب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- أقسام التسمية مع الأجسام المضادة الأولية: مكافحة الكولاجين الرابع (مصفوفة خارج الخلية (ECM) علامة، NB120-6586، 1:100) ومكافحة النعناع (علامة ECM، NB300-144، 1:100، المضادة RBPMS (علامة RGC)، GTX118619، 1:50).
- الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور (اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للأرانب، A11008، 1:500).
- مكافحةالطازان نواة الخلية باستخدام DAPI المضادة للتلاشي الحل.
- التقط صورا للأقسام الملطخة وصور المرحلة باستخدام عدسات 4x و10x الموضوعية باستخدام مجهر مضان (انظر جدول المواد).
- للهيماتوكسيلين وeosin (H &؛ E) تلطيخ، معالجة المقاطع في نظام تلطيخ الآلي (انظر جدول المواد) لإزالة البارافينين باستخدام 100٪، xylene 95٪ الإيثانول، 50٪ محلول الإيثانول وصمة عار مع H &؛ E.
- التقط صورا باستخدام العدسات ذات العدسات ذات ال4x و10x باستخدام المجهر مع مصدر ضوء حقل ساطع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصميم وإنشاء نظام مستقل عبرلامينار
فرق ضغط عبرlaminar هو آلية رئيسية محتملة في الإمراض من الأمراض المختلفة، بما في ذلك الزرق. وتشمل استخدامات النموذج الموصوف، على سبيل المثال لا الحصر، دراسة الزرق (ارتفاع IOP، وربما انخفاض برنامج المقارنات الدولية)، وإصابات الدماغ الرضية (ICP مرتفعة)، والتعرض على المدى الطويل لضعف البصر المرتبط بالجاذبية الصغرى (ICP مرتفعة، IOP مرتفعة). للمساعدة في اكتشاف الإمراض الجزيئي الذي يستهدف الضغط عبر اللمينار في العين البشرية، قمنا بتصميم نموذج TAS وإنشاءه والتحقق من صحته. يعطي نموذجنا البشري الجديد السابق vivo نظاما فريدا قبل السريري لدراسة التغيرات المسببة للأمراض المرتبطة ببرنامج المقارنات الدولية و IOP بشكل مستقل. لمعالجة التطبيقات قبل السريرية البشرية، يوفر نموذجنا نموذجا لدراسة الإمراض بسبب تغيرات الضغط عبر اللالامينار. يصور تصميم النموذج المختوم مع واجهة صلبة وآراء شفافة (الشكل 1A، 1B) مع عرض تخطيطي مفصل للنموذج لتصوير جميع منافذ التدفق والتدفق (الشكل 1C). يتم عرض عرض شفاف اللون مع قطعة الخلفي البشري في نموذج مطبوع 3D الفعلي (الشكل 1D، 1E).
نظام مستقل عبرلامينار: نموذج جديد للضغط عبرلامينار الإنسان الحي
لقد قمنا بإنشاء نموذج TAS بغرفتين مستقلتين (أي غرف IOP و ICP). في القاعدة السفلية للنموذج ، تم وضع الكأس الخلفي البشري فوق الجزء العلوي من القبة المستديرة مع العصب البصري المواجه للقمة. بمجرد وضع الكأس الخلفية وختمها في غرفة IOP ، وضعنا غرفة برنامج المقارنات الدولية فوق العصب. حافظنا على استقلالية كلا الغرفتين وختم مثالي باستخدام حلقات O التي تناسب كل غرفة على وجه التحديد (الشكل 2A). الغرفة السفلية أو غرفة IOP ملأت ونظمت الضغط في الكأس ، في حين أن الغرفة العلوية تناسب حول العصب البصري وتنظيم برنامج المقارنات الدولية حول العصب من خلال خزانات الضغط الهيدروستاتيكي. باستخدام النموذج، قمنا بتنظيم IOP و ICP بشكل مستقل باستخدام الضغط الهيدروستاتيكي. وتم تحديد الفرق بين كلا المجلسين على أنه تغيير في تدرج الضغط عبر الخط (الشكل 2B). ويظهر النموذج المصور مع جميع التجهيزات النهائية في مكان بما في ذلك الحقن خزان التدفق والتدفق متصلة في الشكل 2C.
ثقافة ناجحة وصيانة الضغط في نظام مستقل translaminar
ولضمان عمل كلا المجلسين بشكل مستقل في النظام، قمنا بتنظيم العديد من فروق الضغط من خلال الحفاظ على غرفة IOP و ICP في فروق ضغط متوسطة مختلفة (TLPG العادي: IOP: ICP، 15:5 مم زئبق؛ TLPG مرتفع >10 ملم زئبق؛ TLPG مرتفعة >20 ملم زئبق). اختبرنا في البداية الحفاظ على متوسط فروق الضغط العادي في كلا الغرفتين (IOP/ICP) العادية من خلال معايير مختلفة مختلفة لظروف IOP و ICP: 1) IOP العادي: انخفاض برنامج المقارنات الدولية (الشكل 3A)؛ 1) IOP العادية (الشكل 3A)؛ 1) معدل الفائدة الطبيعي (IOP/ICP) (الشكل 3A)؛ IOP (الشكل 3A)؛ IOP (الشكل 3A)؛ IOP (الشكل 3A)؛ 2) ارتفاع معدل ال IOP: انخفاض برنامج المقارنات الدولية (الشكل 3B)؛ و3) IOP مرتفعة: برنامج المقارنات الدولية مرتفعة (الشكل 3C). ويتراوح متوسط معدل IOP الطبيعي من 10-21 مم زئبق (الضغط الوريدي الإكليكلي المراعي) و ICP العادي من 5-15 مم زئبق. بدلا من الحد من عدم وجود ضغط الأوعية الدموية، ونحن لا تزال تحافظ على الضغط على هذه المعدلات، كما كانت الفكرة لممارسة أقصى قدر من الضغط في ONH. نظمنا بشكل مستقل مستويات الضغط المختلفة في كلا المجلسين (برنامج المقارنات الدولية، 5-10 ملم زئبق؛ IOP، 20-40 ملم زئبق). ولضمان الحفاظ على الضغط بين الغرفتين، أبقينا IOP في ظل الظروف العادية (15 مم زئبق) وخفضنا ال ICP (4 مم زئبق) للحفاظ على TLPG (IOP-ICP) بين LC من 11 ملم زئبق (الشكل 3A). ثم رفعنا معدل ال IOP (43 مم زئبق) وخفضنا عدد المقارنات الدولية (3 مم زئبق) (الشكل 3B) وضغوط مرتفعة في النهاية في كليهما (IOP، 64 مم زئبق؛ برنامج المقارنات الدولية، 9 ملم زئبق) لتوليد أكبر مستوى من TLPG في 55 ملم زئبق (الشكل 3C). لضمان صلاحية الأنسجة (الشكل 4) ، تم تبادل الوسط في الأنسجة كل 48 ساعة عن طريق إرفاق حقنة فارغة إلى stopcock التدفق ودفع ببطء ما يقرب من 5 مل من وسيطة التغلغل من خلال منفذ التدفق باستخدام طريقة الدفع / السحب. حدثت زيادات الضغط الدنيا في وقت التبادل المتوسط (الشكل 4G) ولم تؤثر على مورفولوجيا ONH كما هو موضح في بيانات الكيمياء المناعية لمدة 14 و 30 يوما (الشكل 4A-F). للتأكد من أننا يمكن أن ثقافة شرائح الخلفي لأطر زمنية طويلة مع جدوى فعالة داخل نموذج TAS، قمنا بتحليل المقاطع العرضية من ONH بعد الحفاظ على IOP العادية و ICP لمدة 14 و 30 يوما. تمكنا من زراعة هذه الشرائح بنجاح في النموذج لمدة 14 يوما (الشكل 4A ، 4B) مع خلايا ONH السليمة والتعبير المصفوفة خارج الخلية من الكولاجين الرابع (COLIV) في رأس العصب البصري (الشكل 4C). ولوحظ أيضا استمرارية وصيانة الجزء الخلفي لمدة 30 يوما (الشكل 4D، 4E) مع التعبير عن COLIV وDAPI (الشكل 4F). يصور التمثيل الرسومي لقيم TLPG (IOP-ICP) (الشكل 4G) صيانة مستمرة لقيم IOP بمرور الوقت عند 15.6 ± 4.6 مم زئبق و I متوسط الكمية في 11.0 ± 4.6 مم زئبق لمدة 30 يوما مع TLPG من 4.6 ± 1.3 ملم زئبق (الجدول 1).
التغيرات المورفولوجية إلى ONH آخر ارتفاع تدرج الضغط عبرlaminar
ومن السمات السريرية الشائعة للمرض العصبي المرتبط بالعمر الزرق هو الحجامة ONH. تتميز الحجامة مقدمات الولامينار بالخسارة التدريجية للأنسجة العصبية قبللامينار ، مما يزيد من عمق وعرض الكأس وبالتالي يزيد من نسبة الكوب إلى القرص. الحجامة اللامينار هو الضام القائم على الأنسجة، مع LC تتحرك تدريجيا والتنقيب. الجلوكوماتو الحجامة هو مزيج من هذين العنصرين، مما يعكس كل من الضرر وإعادة عرض الأنسجة الضامة صفح. ارتفاع في IOP يؤدي إلى سماكة LC بسبب زيادة في الكولاجين الفيبريل mass53. باستخدام نموذج TAS، أنشأنا TLPG مرتفعة عن طريق زيادة IOP أو خفض برنامج المقارنات الدولية على مدى نقاط زمنية مختلفة. حافظنا على مجموعة من TLPG مرتفعة لمدة 7 أيام مع متوسط قيم IOP مع مرور الوقت في 22.8 ± 18.6 ملم زئبق و ICP يعني في 6.9 ± 7.6 ملم زئبق مع TLPG من 15.9 ± 11.8 ملم زئبق (الجدول 2). وقد تم توثيق أعلى درجات TLPG عند 36 مم زئبق. ثم تم تحليل الأجزاء الخلفية البشرية بشكل شكلي للسماكة التدريجية للعوارض الخشبية والحجامة في ONH في أقسام H &؛ E الملطخة مع تقدم الوقت بين التحكم ، يوم واحد ، 3 أيام ، و 7 أيام تحت TLPG مرتفعة (الشكل 5A-D). تمت ملاحظة الحجامة وسماكة في 7 أيام من TLPG مرتفعة (الشكل 5D). علاوة على ذلك ، أظهر تعبير COLIV بمرور الوقت بين التحكم ، يوما واحدا و3 أيام و7 أيام حزما سميكة وزيادة التعبير بمقدار 7 أيام (الشكل 5E-H). صور المرحلة مقارنة أنسجة التحكم غير المستزرعة في نموذج TAS (الشكل 5I) و 7 أيام (الشكل 5J) من TLPG مرتفعة داخل نموذج TAS تظهر RGCs صحية داخل GCL (الشكل 5I) مع عدم وجود الحجامة (الشكل 5I) للسيطرة، بينما في ظل ظروف TLPG مرتفعة الصور تظهر الحجامة واسعة النطاق مع عدم وجود RGCs المتبقية (RBPMS-RGC علامة) في RNFL (الشكل 5J) وزيادة إعادة عرض ECM كما هو مبين من قبل COLIV مرتفعة داخل 10 - الهيئة (الشكل 5ج).
الشكل 1: نظام ترانسلامينار المستقل. تصوير النموذج. (أ) منظر أمامي صلب. (ب) عرض شفاف. (ج) طريقة عرض تخطيطية. (D) عرض شفاف للألوان. (ه) النموذج المطبوع ثلاثي الأبعاد الفعلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: آليات النظام المستقل عبرلامينار. (أ) نموذج TAS مع غرف برنامج المقارنات الدولية و IOP لتنظيم فروق الضغط عبر اللمنار. (ب) تصوير نموذج TAS مع تنظيم مستقل للضغط الهيدروستاتيكي في كلا الغرفتين من خلال رفع الخزانات. (ج) صورة لنموذج TAS مع جميع التجهيزات في مكان وتمثيل الحقن خزان التدفق والتدفق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صيانة الضغط المستقلة داخل النظام المستقل عبرلامينار. تمثيل رسومي للضغوط التي يجري تشكيلها بشكل مستقل، والضغوط المستقرة التي يجري الحفاظ عليها في أعلى (برنامج المقارنات الدولية) وقاع (IOP) الغرف مع (A) IOP العادي / انخفاض برنامج المقارنات الدولية (B) IOP مرتفعة / انخفاض برنامج المقارنات الدولية، و (C) IOP مرتفعة / برنامج المقارنات الدولية مرتفعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صيانة وحيوية الأجزاء الخلفية داخل النظام المستقل عبر اللمنار. وقد تم استزراع الشرائح الخلفية البشرية باستخدام نموذج TAS لمدة 14 و 30 يوما في ظل الظروف العادية ل IOP و ICP. H &؛ E الملون المقاطع العرضية من ONH الإنسان في 14 يوما في (أ) انخفاض التكبير (40x) و (ب) التكبير عالية (100x). (ج) COLIV المناعية مع التعبير DAPI (100x). صور مماثلة من تلطيخ H &؛ E في 30 يوما في (D) 40x و (E) 100x ميكروجرافس و (F) COLIV المناعية مع التعبير DAPI (100x). G) عرض رسومي من Δ في مم زئبق من IOP-ICP (TLPG) لشرائح الخلفي البشرية الحفاظ عليها لمدة 30 يوما في الثقافة. COLIV = أخضر; DAPI = الأزرق; (A, inset B); (دال، inset E)؛ H &؛ E = وصمة عار الهيماتوكسيلين واليوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: إعادة الهيكلة الشكلية لرأس العصب البصري بعد ارتفاع تدرج الضغط عبرلامينار في النظام المستقل عبرلامينار. تم استزراع الشرائح الخلفية البشرية باستخدام نموذج TAS لمختلف النقاط الزمنية في ظل ظروف TLPG مرتفعة. مقاطع عرضية من ONH الإنسان تصور تلطيخ H &؛ E من (A) السيطرة (ب) 1 يوم في TAS (C) 3 أيام في TAS، و (D) 7 أيام من الثقافة. التعبير عن COLIV مع DAPI في ONH من (ه) السيطرة (واو) 1 يوم في TAS (G) 3 أيام في TAS، و (H) 7 أيام في الثقافة. المرحلة التباين ONH صور المقطع العرضي من (I) مراقبة ONH تصور (I') شبكية العين تلطيخ RBPMS و (I'') ONH تلطيخ مع COLIV وDAPI. مرحلة التباين من (J) 7 أيام من TLPG مرتفعة في TAS مع insets تصور (J') شبكية العين تلطيخ RBPMS و (J') ONH تلطيخ مع COLIV وDAPI. COLIV، RBPMS = الأخضر؛ DAPI = الأزرق; (A-D) 40x التكبير؛ (E-H) 100x التكبير؛ (I و J) 200x التكبير؛ (J') 400x التكبير؛ (J') 100x التكبير؛ (J, inset J' و J'); H & E = وصمة عار الهيماتوكسيلين واليوسين؛ TAS = نظام مستقل ترانسلامينار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أيام | متوسط IOP من 24 ساعة | متوسط برنامج المقارنات الدولية من 24 ساعة | يعني TLPG (IOP-ICP) |
| 1 | 17.7 | 12.1 | 5.7 |
| 2 | 20.0 | 15.0 | 5.0 |
| 3 | 13.4 | 9.6 | 3.7 |
| 4 | 15.1 | 10.5 | 4.5 |
| 5 | 11.6 | 8.3 | 3.3 |
| 6 | 14.0 | 9.5 | 4.5 |
| 7 | 17.2 | 13.8 | 3.4 |
| 8 | 19.3 | 16.1 | 3.2 |
| 9 | 17.7 | 15.0 | 2.8 |
| 10 | 10.9 | 8.0 | 2.9 |
| 11 | 16.3 | 10.2 | 6.1 |
| 12 | 14.7 | 11.8 | 2.9 |
| 13 | 7.5 | 4.5 | 3.0 |
| 14 | 5.5 | 1.4 | 4.1 |
| 15 | 13.5 | 8.3 | 5.2 |
| 16 | 15.4 | 10.3 | 5.1 |
| 17 | 11.7 | 4.5 | 7.3 |
| 18 | 13.3 | 9.3 | 4.0 |
| 19 | 23.5 | 19.7 | 3.8 |
| 20 | 20.3 | 14.5 | 5.7 |
| 21 | 12.8 | 5.8 | 7.0 |
| 22 | 25.8 | 19.9 | 5.9 |
| 23 | 19.3 | 13.5 | 5.8 |
| 24 | 18.8 | 15.1 | 3.7 |
| 25 | 14.4 | 8.9 | 5.5 |
| متوسط | 15.6 | 11.0 | 4.6 |
| الامراض المنقوله جنسيا | 4.6 | 4.6 | 1.3 |
الجدول 1: الحفاظ على TLPG العادي لمدة 30 يوما. قيم جدولية تصور قيم IOP و ICP و TLPG كل 24 ساعة مع متوسط انحراف معياري على مدار الوقت الكامل.
| أيام | متوسط IOP من 24 ساعة | متوسط برنامج المقارنات الدولية من 24 ساعة | متوسط TLPG من 24 ساعة |
| 1 | 4.1 | -1.0 | 5.1 |
| 2 | 6.3 | 1.1 | 5.3 |
| 3 | 13.4 | 4.0 | 9.4 |
| 4 | 19.0 | 1.1 | 17.9 |
| 5 | 55.6 | 19.5 | 36.2 |
| 6 | 39.5 | 12.8 | 26.7 |
| 7 | 21.5 | 10.8 | 10.6 |
| متوسط | 22.8 | 6.9 | 15.9 |
| الامراض المنقوله جنسيا | 18.6 | 7.6 | 11.8 |
الجدول 2: الحفاظ على مجموعة من TLPG مرتفعة لمدة 7 أيام. قيم جدولية تصور قيم IOP و ICP و TLPG كل 24 ساعة مع متوسط انحراف معياري على مدار الوقت الكامل.
الشكل التكميلي 1: زراعة استئصال الشبكية البشرية في الجسم الحي. تباين المرحلة، RGC ملطخة إيجابية (RBPMS-الأخضر)، والخلوية (DAPI-الأزرق) صور ملطخة من النباتات الشبكية في الثقافة لمدة (A-C) 7 أيام و (D-F) 14 يوما (200x التكبير). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: ثقافات RGC للبالغين الإنسان. علامة RGC (RBPMS-green) و DAPI (أزرق) ملون RGCs 7 أيام في الثقافة (A) 200x (B) 400x التكبير. (C) RGCs ملطخة NEFL (الأخضر) وDAPI (الأزرق) في التكبير 400x. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأنسجة البشرية بعد الوفاة هي مورد قيم بشكل خاص لدراسة الأمراض العصبية البشرية لأن تحديد الأدوية المحتملة التي تم تطويرها في النماذج الحيوانية يجب أن تكون قابلة للترجمة إلى humans47. آثار ارتفاع IOP الإنسان راسخة، ولكن تم إجراء الحد الأدنى من البحوث على تغييرات غير طبيعية في الضغط عبرلامينار ONH. على الرغم من وجود نماذج حيوانية متعددة ونمذجة محدودة ل ONH البشري ، لا يوجد نموذج بشري حي لدراسة تغيرات الضغط عبرلامينار41،54،55،56،57. وهناك حاجة حالية غير ملباة لنموذج بشري جديد قبل السريري يمكن أن يستهدف مسببات الأمراض في الجسم الحي باستخدام IOP و ICP ويمكنه تحديد مختلف النماذج المسببة للأمراض المتعلقة بمسببات الأمراض الزرقاء. سيكون فهم التغيرات المرضية المرتبطة بالضغط في ONH أمرا حاسما لمنع وفاة RGC. الاستخدام المشترك ل IOP و ICP و TLPG ضمن نموذج TAS هو نهج فريد لدراسة الانحطاط المعتمد على الضغط بطريقة ما قبل السريرية باستخدام أنسجة الجزء الخلفي البشري. في نموذج TAS ، يمكننا زراعة الأجزاء الخلفية من أكواب العين البشرية لدراسة تغييرات الضغط عبرlaminar من خلال التنظيم المستقل لغرف IOP و ICP. وهو يوفر أساسا لتطوير مجموعة جديدة من العلاجات التي تركز على الضغط عبرlaminar كآلية للانحطاط.
إعداد نموذج TAS يتطلب الاهتمام بالتفاصيل في العديد من الجوانب: تشريح الصحيح للشرائح الخلفية البشرية، وضمان أن شبكية العين سليمة وتنتشر على الكأس الخلفي، ووضع السليم للجزء فوق قبة غرفة IOP، ووضع بدقة غرفة برنامج المقارنات الدولية على ON، وختم فعال من كلا الغرفتين، والحفاظ على الضغوط الهيدروستاتيكية بشكل مستقل من خلال تنظيم ارتفاع خزانات IOP و ICP. تشريح يحتاج إلى أن يتم في العيون التي لا تزيد عن 24-36 ساعة بعد الوفاة، وذلك لأن شبكية العين تتدهور تدريجيا إذا لم يتم تجديد المتوسطة ثقافة فعالة. تم إجراء تجديد منهجي للوسط في نظامنا كل 48-72 ساعة. وثمة جانب حاسم آخر من جوانب النظام هو طول برنامج تشغيل الطبيعة. من المهم التأكد من ترك ما لا يقل عن 0.5-1 سم من ON على العين الجثث. لا ينبغي استخدام عيون المانحين إذا كان لديهم ال ONs قصيرة، وتضررت ON، يتم اختراق الكرة الأرضية ونفخها، أو يتم فصل غمد ON. علاوة على ذلك ، عند وضع الجزء الخلفي فوق القبة ، يجب أن يكون O-ring مناسبا بإحكام في مكانه وغرفة ICP العلوية مختومة بشكل صحيح بالمسامير. التجهيزات pushpin حيث تعلق أنابيب على كل جانب من القاعدة العلوية والسفلية للنموذج تحتاج أيضا إلى اختبار للتأكد من أن الأنابيب يناسب والأقفال في مكان. إذا لم يكن الأنابيب في مكانه بشكل صحيح ، سيتم ملاحظة فقاعات الهواء داخل الأنابيب وتضر بقياسات الضغط داخل كل غرفة.
كانت صيانة وحيوية الأجزاء الخلفية بعد الوفاة في نموذج TAS الخاص بنا مصدر قلق بالغ لهذا البروتوكول. وقد سبق أن درست الأنسجة البشرية بعد الوفاة على نطاق واسع48,49، مع دراسة تحليل الحمض النووي الريبي الأخيرة من 1068 الأنسجة المانحة بعد الوفاة تؤكد أن أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة التي تم جمعها على مدى عقود يمكن أن تكون بمثابة مواد عالية الجودة لدراسة الاضطرابات البشرية47. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تنميط التعبير الناجح سابقا لأنسجة العين المانحة البشرية العينية بعد الوفاة58. كانت قيم التعبير الجيني PLIER لجينات موت الخلايا المبرمج ضئيلة أو غير موجودة في مجموعة البيانات هذه لأنسجة الشبكية 6 ساعة بعد الوفاة58. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن تخزين انخفاض حرارة الجسم من أنسجة العين يمكن أن يؤديها على نحو فعال59. وقد تبين أن نشاط خلايا العقدة يتم الحفاظ عليه لمدة 50 ساعة عندما يتم تخزين عيون صغيرة في ظروف نقص التروية وانخفاض حرارة الجسم41,60. لذلك، استخدمنا نقطة التوقيت 6 ساعة كمعيار إدراج لجمع عين المانحة. سرعة تدهور ما بعد الوفاة من الأجزاء الخلفية وانفصال الشبكية تفتقر في الأدب، ولكن لدينا التعليم داخل 6 ساعة، والتسليم على الجليد، وإعداد الثقافة من أقصى 36 ساعة هو جيد ضمن نطاق صلاحية الأنسجة كما هو مبين في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2. باستخدام نموذج TAS، حققنا بنجاح صيانة صحية للأنسجة لمدة 30 يوما.
وثمة قيد آخر على نموذج TAS هو عدم قدرتنا الحالية على نمذجة الإيقاعات الإيقاعية الدورية لبرنامج المقارنات الدولية وOP التي لوحظت في ظل الظروف الفسيولوجية العادية. ويمكن معالجة هذا في المستقبل باستخدام مضخة التي يمكن تنظيم IOP الإيقاعي وضخ برنامج المقارنات الدولية. علاوة على ذلك ، هناك تحذير آخر للنموذج هو عدم وجود الدورة الدموية داخل العين الجثة. وبالتالي، لا يمكن دراسة آثار ضغط الدم، ولكن هذا يسمح لنا أيضا بتحديد الآثار المسببة للأمراض على وجه التحديد من التغييرات TLPG فقط، بما في ذلك IOP و ICP.
ومن شأن نطاق النموذج في المستقبل أن يتضمن أتمتة نظم الخزانات للتغيرات الهيدروستاتيكية وتشويش المتوسط من خلال مضخة ضخ مع حقنة فارغة خروج على محول بدلا من جولات متعددة من التغيير المتوسط التي تم تنفيذها في هذا البروتوكول. ويمكن أيضا جمع السوائل من خزان IOP و ICP وتحليلها. يمكن جمع متوسطة للتعبير عن العلامات الحيوية لاستهداف العلاجات المستقبلية. يمكننا أيضا تحديد المسارات أو الجزيئات التي يمكن علاجها بالأدوية أو العلاج الجيني واختبار هذه العلاجات في نماذج حيوانية مختلفة لبرنامج المقارنات الدولية قبل ترجمتها إلى التجارب السريرية البشرية.
في الختام، نموذجنا لا يوفر فقط أساس الإنسان للاختبار، ولكن يمكن أيضا استخدامه للتحقق من صحة العلاجات التي يمكن أن تستهدف تغيرات الضغط عبرلامينار في العين. وهو يفتح سبيلا لإجراء الطب الدقيق من خلال زرع الخلايا الجذعية المريض على تيكوبس المانحة البشرية والضغط عليها في نموذج TAS. وهذا يسمح لنا باختبار العلاجات في الجسم الحي مع القدرة على أن تكون قابلة للترجمة إلى العيادة وذات الصلة بالأفراد الأحياء. مع نموذجنا يمكننا الآن تقييم التغيرات التي تحدث في الضغط عبرلامينار وكيف يلعب دورا حاسما في مسببات الأمراض المرتبطة بالأمراض المؤلمة والعصبية المختلفة. وسيؤدي ذلك إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية المسببة للأمراض في المكتب الوطني للتحقق من صحة المعلومات المرتبطة ببرنامج المقارنات الدولية وال IOP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد لدى مؤلفي المخطوطة أي تضارب محتمل في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
وكان تمويل هذا المشروع من خلال الأموال التقديرية للدكتورة كولين م. ماكدويل. وقد دعم هذا العمل جزئيا بمنحة غير مقيدة من مؤسسة البحوث لمنع العمى، إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية في جامعة ويسكونسن ماديسون. نشكر الدكتورين أبوت ف. كلارك ووايمينغ ماو على مساعدتهما التقنية في نموذج ثقافة الأعضاء التغلغلية. نشكر معهد ليونز للعيون لزراعة الأعضاء والبحوث (تامبا، فلوريدا) على توفير عيون المتبرعين البشريين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack |
Amazon | B07DRGPPZJ | |
| 114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100) | Amazon | B000FMYRHK | |
| 30 mL Syringes without Needle | Vitality Medical | 302832 | |
| 3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap | QOSINA | 2C6201 | |
| 4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver | Brikksen Stainless Steel Fastners | PPMSSSCH4C.5 | |
| ANPROLENE 16 LARGE AMPULE | Fisher Scientific | NC9085343 | |
| Betadine | Purdue | PUR1815001EACH | |
| Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167-100EA | |
| Corning L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS | Med Plus Medical Supply | COV-3033-CS | |
| Dressing Forceps Delicate Curved (serrated) | Katena | K5-4010 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | F.S.T. | 11254-20 | |
| Eye Scissors Standard Curved | Katena | K4-7410 | |
| Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes | Capitol Scientific | 351058 | |
| Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-55 | |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher Scientific | 01-812-58 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium | Fisher Scientific | SH3024302 | |
| HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear | Qosina | 28217 | |
| Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate | AD instruments | DPT-200 | |
| JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box | Jenson Global | JG15-0.5HPX 15 | |
| Keyence B2?X710 microscope | Keyence | B2-X710 | |
| LabChart 8 | AD instruments | LabChart 8 | |
| Leica ST5020 Multi-stainer | Leica | ST5020 | |
| Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White | QOSINA | 65811 | |
| Octal Bridge Amp (Model # FE228) | AD instruments | FE228 | |
| Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF | Fisher Scientific | NC1675398 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| PowerLab 8/35 (Model # PL3508) | AD instruments | PL3508 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher | P36935 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male | McMAster-Carr | 7880T113 | |
| Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe | McMAster-Carr | 51235K101 | |
| Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft. | Fisher Scientific | 14-171-268 | |
| Superblock T20 | Fisher Scientific | PI37536 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T. | 14001-14 | |
| Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved | Katena | K5-4110 | |
| Translaminar Autonomous System (TAS) | University of North Texas Health Science Center | N/A | |
| USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna) |
Marco Rubber & Plastics | B1000-030 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
- Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
- Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
- Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
- Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
- Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
- Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
- Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
- Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
- Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
- Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
- Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
- Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
- Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
- Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
- Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
- Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
- Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
- Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
- Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
- Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
- Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
- Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
- Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
- Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
- Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
- Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
- Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
- Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
- de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
- Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
- Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
- Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
- White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
- Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
- Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
- Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
- Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
- Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
- Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
- Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
- Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
- Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
- Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
- Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).
