Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

新切除乳腺癌肿瘤的Terahertz成像和表征协议

Published: April 5, 2020 doi: 10.3791/61007
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Electrical Engineering, University of Arkansas, 2Oklahoma Animal Disease Diagnostic Laboratory, Oklahoma State University
* These authors contributed equally

Summary

新鲜切除的人类乳腺癌肿瘤的特点是使用太赫兹光谱和成像遵循新鲜的组织处理协议。组织定位被考虑在内，以实现有效的表征，同时及时为将来的术中应用提供分析。

Abstract

本手稿提供了一个协议，使用脉冲太赫兹成像和光谱技术处理、描述和成像新切除的人类乳腺肿瘤。该协议涉及在正常入射处的太赫兹传输模式和斜角为30°的太赫兹反射模式。收集的实验数据表示电场的时域脉冲。通过切除组织上的固定点传输的太赫兹电场信号通过分析模型进行处理，以提取组织的折射率和吸收系数。利用步进电机扫描仪，从肿瘤的每个像素反射出太赫兹发射脉冲，提供不同组织区域的平面图像。图像可以在时间或频域中显示。此外，利用每个像素的折射率和吸收系数的提取数据，提供肿瘤的图谱太赫兹图像。该协议表明癌组织和健康组织之间的明显区别。另一方面，由于肿瘤表面存在气泡和液体，不遵守协议可能会导致图像发出嘈杂或不准确。该协议提供了一种乳腺肿瘤的手术边缘评估方法。

Introduction

在过去的十年里，Terahertz （THz） 成像和光谱学一直是一个快速增长的研究领域。在 0.1-4 THz 范围内持续开发更高效、更一致的 THz 发射器，使得其应用显著增长1。THz 已显示出希望和显著增长的一个领域是生物医学领域2。THz辐射已被证明是非电离和生物安全在功率水平通常用于分析固定组织3。因此，THz成像和光谱学被用来分类和区分各种组织特征，如含水量，以指示烧伤损伤和愈合4，肝硬化5，和癌症在切除组织6,6，7。癌症评估特别涵盖广泛的潜在的临床和外科应用，并已调查脑8，肝脏9，卵巢10，胃肠道11，和乳房7，12，13，14，15，16，17，18，1912,13,14,15,16,17,18的19癌症。7

THz乳腺癌的应用主要侧重于通过保证金评估支持乳房保护手术或乳房切除术。乳房切除术的目的是切除肿瘤和周围健康组织的一小层，与切除整个乳房的全乳房切除术形成鲜明对比。切除组织的手术边缘通过病理学进行评估，一旦样品固定在正式内，切片，嵌入石蜡，并安装在显微镜幻灯片上的4 μm×5μm切片。这个过程可能非常耗时，如果观察到正差值20，则需要稍后进行二次外科手术。美国放射肿瘤学会目前的指导方针将这种正差定义为癌细胞接触表面边缘墨水21。高吸收水合组织的THz成像主要限于表面成像，根据组织类型进行一些不同的穿透，足以满足快速边缘评估的手术需求。快速分析手术设置期间的保证金条件将大大降低手术费用和后续手术率。迄今为止，THz已被证明在区分癌症和健康组织在正式固定，石蜡嵌入（FFPE）组织的有效，但需要额外的调查，以提供可靠的癌症检测在新鲜切除的组织7。

该协议详细介绍了对从生物库获得的新切除人体组织样本进行THz成像和光谱的步骤。建立在新鲜切除的人类乳腺癌组织的THz应用很少用于发表的研究77，18，22，23，18,22,23特别是由研究组不与医院整合。使用新切除组织在其他癌症应用中同样罕见，大多数非乳腺癌的例子都报道了结肠癌24，25。24,原因之一是FFPE组织块比新切除的组织更容易获得和处理，除非用于研究的THz系统是手术工作流程的一部分。同样，大多数商业实验室THz系统不准备处理新鲜组织，而那些确实还处于使用细胞系生长阶段或刚刚开始查看动物模型中切除的组织。要将 THz 应用于术中设置，需要提前为新鲜组织开发成像和表征步骤，以便分析不会干扰执行标准病理学的能力。对于并非本质上意味着术中应用的应用，新鲜组织的表征仍然是一个具有挑战性的步骤，必须加以解决，以在体内应用和分化方面发挥作用。

这项工作的目的是为使用商业 THz 系统的新切除组织 THz 应用提供指南。该协议是在THz成像和光谱系统26为鼠乳腺癌肿瘤13，17，19，17,并13扩展到人类手术组织从生物组197,7，18。虽然该协议是为乳腺癌生成的，但相同的概念可以应用于类似的THz成像系统和其他类型的固体肿瘤癌症，这些癌症在手术中得到治疗，而手术的成功取决于保证金评估27。由于新切除组织上已公布的 THz 结果相当少，这是作者所知的第一部专注于 THz 成像和表征新鲜组织处理协议的工作。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

该协议遵循阿肯色大学环境健康和安全部门制定的所有要求。

1. 设置组织处理区域

  1. 取一个不锈钢金属托盘，用生物危害袋盖住它，如图1所示。任何生物组织处理都将在托盘区域（即组织处理区域）内进行。
  2. 在托盘周围准备实验室钳、纸巾、纸巾、滤纸包、组织染料瓶、漂白瓶和乙醇瓶，以便在需要时方便携带。在生物危害物质表面保留任何用过的组织、湿巾和手套，在协议结束时处理。
  3. 将 50 mL 离心管填充高达 45 mL 的 10% 中性缓冲形式，并将其放入组织处理盘附近的离心机存储托盘中。

Figure 1
图1：组织处理区域的设置。请点击此处查看此图形的较大版本。

2. 处理用于THz透镜的新鲜乳腺癌肿瘤

注意事项：在处理任何活组织之前，戴上手套、护目镜、面罩和实验室外套。始终使用实验室钳子来处理组织，避免直接用手触摸它们。所有与密封容器外或扫描阶段外的新组织进行的工作都应在步骤 1.1 中确立的组织处理区域进行。

注：这项工作处理的所有组织都用Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）和生物库的抗生素溶液运出。

  1. 从 DMEM 溶液中取出散装肿瘤，并将其放入组织处理区域上的培养皿中（参见图 2A）。
  2. 从总检查，找出不同的肿瘤区域，从中切片小块进行传输表征。使用不锈钢薄型刀片从已识别的点切割一个0.5毫米厚的肿瘤段，如图2B所示。将此切片部分放在两个石英窗之间，间隔厚度为 0.1 mm 的液体样品支架中，如图2C所示。

Figure 2
图 2：用于 THz 透镜测量的肿瘤切片。（A） 大体肿瘤的照片。（B） 从大体积肿瘤切除肿瘤的小部分（0.5 毫米）的照片。（C） 切片肿瘤部分放置在两个石英窗之间的液体样品支架中，带有 0.1 mm 聚四氟乙烯垫片，用于光谱测量。图重新公布从T.鲍曼等人18在得到SPIE的许可。请点击此处查看此图形的较大版本。

3. THz透光测量

  1. 通过将模块手柄对准核心系统中的安装柱，并将舞台向下滑动到系统中，将变速箱光谱模块设置在 THz 芯室内。拧紧模块右上角和左下角的两个安装螺钉，如图3A所示。
  2. 在整个光谱过程中，用干氮气以 5 L/min （LPM） 的速度清除系统，从样品空间中去除水蒸气。
  3. 从连接到 THz 系统的桌面打开 THz 传输光谱测量软件。它将打开主窗口。
  4. 单击窗口顶部的"扫描"选项卡。将显示"光谱扫描设置"窗口。从窗口右上角的"测量模式"选项卡的下拉菜单中，选择"传输"以设置变速箱光谱。如果峰值不自动可见，请检查"手动峰值搜索"选项卡下的"启用"选项，并手动踩下光学延迟，使峰值进入视图。
  5. 清除 30 分钟后，按照以下步骤记录空气参考信号。
    1. 在光谱扫描设置窗口中的"扫描设置"选项卡下，为参考文件输入适当的名称，将数字扫描设置为 1，800，并将"开始延迟"（ss） 设置为 0。将其他设置保留为其默认值。
    2. 单击扫描设置窗口中的测量参考以进行空气参考测量。然后单击"测量样本"以测量通过空气的传输信号，采样平均 1，800 个信号，超过 ±1 分钟。

Figure 3
图3：THz透光模块设置。（A） 装有传输模块的 THz 型芯室。（B） 液体样品支架的照片。（C） 样品支架放置在芯腔内进行测量。请点击此处查看此图形的较大版本。

  1. 测量液体样品支架中的两个石英窗，如图3B所示。
    1. 将两个石英窗放在液体样品支架中，中间没有垫器。
    2. 打开 THz 芯室。将液体样品支架安装在透射光谱模块上，如图3C所示。关闭造型室。
    3. 单击主窗口中的"扫描"选项卡。对石英样品重复步骤 3.5.1_3.5.2，但将开始延迟（s） 更新为 900。这样，在测量前可以清除任何水蒸气。
    4. 如果需要石英作为其他示例的参考，请单击"扫描设置"下的"清除参考"选项卡。这样可以清除空气参考。然后单击"测量参考"选项卡，将石英测量值记录为新参考。
  2. 将切片的肿瘤部分放在液体样品支架内的两个石英窗之间，并将支架放置在腔室内，以便对组织进行单点传输测量。要记录测量值，请重复步骤 3.6.3。
  3. 测量完成后，将液体样品支架带出腔室，并将其带到指定用于组织处理的区域。拆开液体样品支架，用纸巾从石英窗擦拭肿瘤部分，并将用过的纸巾放在同一托盘中，与其他生物危害废物一起处理生物危害袋中。
  4. 根据需要重复步骤 2.2、3.7 和 3.8，以表征额外的肿瘤切片。测量完成后，转到主窗口并单击"文件"选项卡以保存测量数据。关闭软件窗口。

4. 处理用于THz反射模式成像的新鲜乳腺癌肿瘤

  1. 从 DMEM 和抗生素溶液中取出新鲜的肿瘤样本，并将其放在培养皿上。使用毛检查，选择肿瘤的一侧被成像足够平坦，血液很少，血管很少。如果可能，避免用血液或血管成像组织。
  2. 将肿瘤与要成像的侧面放在 1 级滤纸上，以干燥多余的 DMEM，并从肿瘤中清除液体或分泌物的组织，如图4A所示。当纸张饱和时，将滤纸上的肿瘤重新定位到干燥点。将肿瘤干燥 5 分钟。

Figure 4
图4：用于THz成像的新鲜肿瘤样品制备。（A） 肿瘤放在滤纸上晾干。（B） 用纸巾垫放在聚苯乙烯板上的肿瘤，以吸收多余的液体。（C） 肿瘤从下面查看，以跟踪方向并检查气泡。请点击此处查看此图形的较大版本。

  1. 卸载传输光谱模块，并将反射成像模块 （RIM） 镜像底座设置在 THz 核心系统上，如图5A所示。设置后视镜后，将 RIM 扫描阶段安装在后视镜底座上方，并将其拧入核心系统（参见图 5B）。
  2. 在成像程序之前，在 5 LPM 处用干氮气净化系统 30 分钟，以去除样品舱中的水蒸气。30分钟后，在系统使用余下时间内，将干氮气量降至3 LPM。
  3. 将厚度为 ±1.2 mm 的聚苯乙烯板放在直径 ±37 mm 的扫描窗口上。将扫描窗口与聚苯乙烯板一起放在样品舞台上。

Figure 5
图 5：用于反射成像的系统设置。（A） 反射成像模块镜像模块镜像底座。（B） 扫描阶段。请点击此处查看此图形的较大版本。

注：其他厚度和板材适用于步骤 4.5，但应具有均匀的厚度和足够低的吸收，不会妨碍 THz 信号。

  1. 从连接到 THz 系统的桌面打开 THz 反射成像测量软件。将弹出一个窗口，显示特定函数的几个对话框图标和 THz 字段图的两个子窗口（任意单位 a.u.）分别针对时间和频率。
  2. 要设置 RIM 设置的参数，请单击窗口顶部的图像参数对话框图标。将弹出图像采集参数窗口。从"模板"选项卡的下拉菜单中选择RIM，以便设置反射成像。点击确定，然后返回软件的主窗口。
  3. 在主窗口中，单击定点扫描图标。这将激活 THz 天线，开始发送事件 THz 信号，并从聚苯乙烯板上的单个点接收反射 THz 信号。
  4. 单击主窗口顶部的"电机舞台对话框"图标。电机控制窗口将打开。通过单击正向/后退方向箭头来调整光学延迟轴，以将来自主窗口中聚苯乙烯的反射脉冲居中。
    注：调整光学延迟轴后，窗口上应出现两个脉冲，如图6所示：一个来自聚苯乙烯板的下接口（主要反射），另一个来自聚苯乙烯板的上部接口（二次反射）。
  5. 从聚苯乙烯板向外窗口，并将二次反射保持在窗口中，这将有助于在成像过程中组织反射。这分两步完成。
    1. 首先，单击主窗口顶部的DAQ 设置按钮以打开 DAQ 设置对话框窗口。将光学延迟值从 5 V（默认）更改为 4 V。
    2. 其次，在扫描阶段使用微米比例调整扫描阶段的垂直位置，直到次脉冲的最小度最强。调整电机控制窗口中轴的光学延迟，将主反射置于要测量的反射信号范围之外。
      注：对于 1.2 mm 厚的聚苯乙烯板，当时域窗口的光学延迟轴上二次反射最小峰值约为 -0.3 mm 时，主反射会向外窗口窗口。

Figure 6
图 6：聚苯乙烯板下部和上部接口的 THz 反射。（A） THz 信号事件，并从 1.2 毫米厚的聚苯乙烯板中反射。（B） 测量来自聚苯乙烯的主和次 THz 时域信号。请点击此处查看此图形的较大版本。

  1. 调平采样阶段并记录参考信号。
    1. 在每个轴上选择两个点（A 轴和 B 轴），表示靠近采样窗口边缘的聚苯乙烯板上的位置。例如，对于从 -15 mm +15 mm 的 A 轴，两个位置点可以是 -10 mm 和 10 mm;对于 -15 mm+15 mm 的 B 轴，两个位置点可以是 -10 mm 和 10 mm。
    2. 单击"电机控制对话框"按钮以打开电机控制窗口。重新定位电机控制窗口和主软件窗口，以便在调整电机位置时看到时域信号。将 A 轴和 B 轴设置为 0 mm。
    3. 使用以下步骤对 A 轴进行级别。以 -10 mm=10 mm 范围为例。
    4. 在电机控制窗口中，将 A 轴的值从 0 更改为 -10 并命中Enter。舞台移动到 A 轴上的 -10 mm 位置，并观察到主窗口上信号位置的偏移。
    5. 在图 5B所示的扫描阶段使用可调节的微米刻度将信号的最小峰值移回步骤 4.10.2 中设置的位置。
    6. 将 A 轴值更改为 +10 并点击输入。舞台现在将从 -10 mm 位置移动到 A 轴上的 +10 mm 位置，并再次观察到信号的偏移。注意信号从上一个位置移动的方向和距离，并再次将 A 轴值更改为 -10。信号将返回步骤 4.11.5 中设置的位置。
    7. 在扫描阶段的 A 轴上旋转调平螺钉，如图5B所示，并将信号移以双倍距离，使其距离与从原始位置移动的方向相同。使用扫描台上的千分尺将信号移回原始位置（1.2 mm 聚苯乙烯为-0.3 mm）。
    8. 重复步骤 4.11.6~4.11.7，直到 +10 和 -10 处的信号相等，并且两个位置的峰值都聚焦在原始位置（光轴上的-0.3 mm）。
  2. 实现 A 轴的平位后，将 A 轴值更改为 0，然后对 B 轴重复相同的过程。首先，将电机控制窗上的 B 轴值从 0 更改为最正值（例如 ±10 mm）。此外，在平位时，请使用扫描阶段的 B 轴上的平位螺钉，如图5B所示。
  3. 两个轴调平后，将 A 轴和 B 轴都返回到 0 mm。关闭电机控制窗口并验证信号是否处于原始位置，以防信号稍微移动一下。
  4. 将此信号记录为参考。
    1. 转到设置的DAQ 属性窗口。将平均值更改为 5，并将所有其他参数保留为默认值。
    2. 单击"新参考"。窗口右上角的平均计数器将从 0-20 计数。一旦计数器达到 20，将平均值更改为 1，然后单击"确定"。聚苯乙烯的反射信号将保存为以后进行的任何扫描的参考。
      注：如果只执行 THz 成像过程，则最好在将肿瘤组织从 DMEM 溶液中取出之前执行步骤 4.3-4.14。
  5. 将肿瘤安装在覆盖扫描舞台窗口的聚苯乙烯板上。
    1. 从扫描阶段取下成像窗口，并将其带到组织处理区域。将肿瘤放在聚苯乙烯板上，如图4B所示。
    2. 确保板和肿瘤之间没有明显的气泡。如果观察到气泡，用钳子压压肿瘤或抬起肿瘤，轻轻将其滚动到聚苯乙烯上，直到气隙最小化。
    3. 在测试样品周围定期放置吸收间隔器，如图 4B所示。将另一块聚苯乙烯板放在肿瘤上方，轻轻按压，以使肿瘤表面尽可能平。在样品窗口上胶带放下这种聚苯乙烯-肿瘤-聚苯乙烯排列。
  6. 翻转示例窗口，如图4C所示，并拍摄肿瘤的照片，以保持其方向记录。将带有肿瘤的样本窗口返回到扫描阶段。
  7. 单击"图像参数对话框"按钮以打开图像采集参数窗口。设置轴值 1 分钟、轴 1max、轴2 分钟和轴2max的值，以完全封闭肿瘤在成像窗口中的位置
    注： 默认情况下，轴 1 是 A 轴，轴 2 是 B 轴。
  8. 将轴1步和轴2步设置为 0.2 mm 进行成像扫描。
    注：设置轴1步和轴2步将在扫描过程中将步进电机的步进尺寸设置为 200 μm 增量。总扫描时间可在图像采集参数窗口中进行估计。
  9. 单击主窗口中的"度量"选项卡，然后选择"飞回 2D 扫描"选项。在弹出的窗口中，指示保存扫描数据的目录和文件名。

5. 为组织病理学程序做准备的新鲜组织后处理

  1. 完成扫描过程后，从核心 THz 系统中拆下样品窗口、聚苯乙烯板和样品，并将其移动到指定用于危险废物的区域。从聚苯乙烯板上取出肿瘤，放在一块与肿瘤相当的平纸板上。确保肿瘤的方向与聚苯乙烯的方向相同，成像面接触纸板。
  2. 在红色组织染料中浸渍棉签，将肿瘤的左侧染色到肿瘤边缘接触纸板的地方。同样，用蓝色组织染料染色肿瘤的右侧。用一行黄色组织染料将红色污渍与蓝色污渍连接起来，以表示样品背面，以染色肿瘤的暴露表面，如图7A所示。
    注：为了防止油墨染色形式溶液，请仅对组织涂一层薄层。这可以通过在染色组织之前在不同表面上涂抹棉签，或使用干净的棉签擦掉多余的染料来实现。避免让染料接触皮肤或衣服。这种肿瘤染色过程作为参考，提供有关肿瘤成像方面及其方向给病理学家的信息。

Figure 7
图7：THz成像后肿瘤的后处理。（A） 肿瘤正面朝下放在纸板支架上，并染上组织标记染料。（B） 过滤纸放在肿瘤上并贴上胶带以保持接触。（C） 染色肿瘤固定在纸板上，浸入10%中性缓冲形式溶液中，用副膜密封。请点击此处查看此图形的较大版本。

  1. 让墨水干燥约 3⁄4 分钟。 切割一张与纸板尺寸相同的滤纸。把它放在肿瘤上，把一块胶带完全包裹在滤纸和纸板上，如图7B所示。胶带和过滤纸应保护肿瘤对纸板，而无需施加任何重大压力。
  2. 将贴在纸板上的染色组织浸入 10% 中性缓冲形式溶液中，并使用石蜡膜密封离心管，如图7C所示。在管标签上指定样品的样本编号、日期、组织类型和肿瘤编号。将肿瘤发送给病理学家进行进一步组织病理学处理。

6. 危险废物处置

  1. 从组织处理托盘收集所有废物以及用于盖住托盘的生物危害袋，并将其放入新的生物危害袋中，如图8所示。将袋子带到建筑物中指定的生物危险废物区，并预约环境健康与安全 （EH&S） 部门进行废物拾取。使用 10% 漂白溶液和乙醇清洁桌上的组织处理托盘和周围区域。

Figure 8
图8：生物危险废物袋的照片。请点击此处查看此图形的较大版本。

  1. 取带垫片和石英窗的液体样品支架、肿瘤安装的取样窗口、聚苯乙烯板和实验室钳子到洗涤区。用水冲洗所有材料，然后用10%漂白液，根据需要用纸巾擦拭，以清除组织碎片。再次用水冲洗，用阿康酮溶液擦洗，彻底冲洗。对于玻璃和塑料制品，用70%的等丙醇冲洗，并放在一边晾干。
    注：一旦肿瘤处于正式状态，样品空间清洁，数据处理可以同时处理成像或以后处理。

7. 数据处理以构造 THz 图像

  1. 从 THz 系统导出保存的 .tvl 数据文件。从系统获取的原始数据文件以 Python 编写，最好在保存为 MATLAB 数据文件之前在 Python 中读取。
  2. 要构造扫描的新鲜组织的 THz 图像，请使用原始数据矩阵第三维度（即时间维度）上的 Fourier 变换将原始时域反射成像数据转换为频域。还采用参考数据的傅立叶转换。
    注：典型的频域频谱应提供 0.1 THz-4 THz 的数据。
  3. 使用参考数据规范化样本数据，并根据从 f1 = 0.5 THz 到 f2 = 1.0 THz 的频率范围内的规范化数据集成执行功率光谱：
    Equation 1
    注：此处E样本是组织样本的频率域反射成像数据，E参考是参考信号单点反射数据的频率域。
  4. 通过绘制由 A 轴和 B 轴定义的矩阵中每个点的计算出的功率光谱数据来构造二维图像。这称为功率光谱 THz 图像。
    注：获得地形THz图像的方法在步骤 7.5_7.7 中进行了详细说明。
  5. 对于表征，使用以下方程18计算一系列潜在组织属性的理论频率相关反射：
    Equation 2
    注：此处αT，jj是区域i与区域j之间的j复杂菲涅尔反射系数是区域j的厚度;和αj是区域j中传播角度与斯内尔定律的入射角度有关。Equation 3是区域j中的复杂传播系数，其中α是角频率，c是真空中光速，nj是折射率的实际部分，βabs，j是吸收系数18。区域 1 是空气，区域 2 是聚苯乙烯板，区域 3 是组织。
  6. 计算公式 （2） 中区域3（n3和αabs，3）的用户定义的折射率和吸收系数范围的反射，并与每个点的测量信号进行比较，以计算幅度和相的合并平均平方误差。
    注：折射率和吸收系数的解决方案是误差最低的一对值。
  7. 构造每个像素的反射率和吸收系数数据（n3和βabs，3）的地形THz图像。通过与病理学家获得的病理幻灯片图像进行比较，分析肿瘤区域。图9显示了具有代表性的结果，其中举例说明了图 10和图11中对协议的遵守不足。

8. 利用透射光谱数据提取组织电性能

  1. 在 THz 传输光谱测量软件的主窗口中，转到"文件"选项卡并单击"导出"选项。将弹出一个窗口以选择要导出的数据类型和示例。为石英和组织样品测量选择传输和传输相数据类型。
  2. 使用以下方程15计算一系列潜在组织的物理频率相关传输：
    Equation 4
    注：以下是Icon 3样本和参考设置的菲涅尔传输系数之间的比率;*1和#3分别是空气和组织的复杂传播常数;d是组织的厚度。传播常量通常定义为Equation 5。*是定义为Equation 6的复式折射率，其中 n是折射率的实际部分;c是光速;*是角频率;和αabs是吸收系数15。
  3. 计算方程 （3） 中传输的幅度和相位与系统测量数据的合并均方误差，以测量用户定义的n和#absabs值范围。
    注：折射率和吸收系数的解决方案是误差最低的一对值。
  4. 根据频率范围从0.15~3.5 THz绘制提取的折射率和吸收系数数据。代表结果如图12所示。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

图9中介绍了根据上述人类乳腺癌肿瘤标本#ND14139从生物库接收的THz成像结果。根据病理报告，#ND14139肿瘤是I/II级渗透导管癌（IDC），通过左乳房结块切除术手术从一名49岁的妇女那里获得。肿瘤的照片如图9A所示，图9B中的病理图像，以及协议中使用方程（1）获得的THz功率光谱图像，如图9C所示。病理图像的评估是由俄克拉荷马州立大学的咨询病理学家完成的。在将THz图像与病理图像关联后，很明显，癌症区域（即图9C中的红色区域）比脂肪区域（即图9C中的蓝色区域）表现出更高的反射率。图9C中靠近癌症中心的蓝色圆圈是由于在成像过程中肿瘤下方存在气泡。

还介绍了基于使用上述模型获取的肿瘤的电像图像，每个像素（共2，477像素）。图9D、9E、9F和9G分别显示了基于肿瘤吸收系数（cm-1）数据（+-图像）和折射率（n-图像）数据的地形图像。随着频率的增加，癌症和脂肪像素的计算吸收系数（cm-1）值增加，癌症像素在两个频率上都显示比脂肪更高的值。相反，两个组织的折射率随着频率的增加而降低。需要注意的是，随着频率的增加，测量相在成像级调平、聚苯乙烯板厚度和步进电机抖动中受到微米级变化的影响。例如，图 9E和9G中观察到的水平线是由于步进电机在扫描过程中引入的小相移，在较低频率下未观察到。

Figure 9
图9：使用THz成像技术对乳腺癌肿瘤#ND14139分析。（A） 肿瘤的照片.（B） 肿瘤的低功耗病理图像。（C） 频率范围内的 THz 功率光谱图像在 0.5 THz 下获得 0.5 THz+1.0 THz.（D） THz 光度吸收系数图像。此图像是使用肿瘤原始反射成像数据中每个像素提取的吸收系数数据构建的。（E） 在 1.0 THz（F） 折射率图像（n- 图像） 获得 0.5 THz 的吸收系数图像.此图像是使用从肿瘤的原始反射成像数据中提取的折射率数据构建的。（G） 折射率图像（n- 图像） 获得在 1.0 THz. 图重新公布从 T. 鲍曼等人18获得获得 SPIE 的许可.请点击此处查看此图形的较大版本。

图 9中讨论的 THz 结果是通过成功遵循所述协议获得的。组织处理不当会导致成像结果误导。例如，图10中的THz成像结果对人类乳腺癌肿瘤#ND10405显示干燥不足的影响。组织中多余的DMEM溶液主导了图10B28中肿瘤的THz功率光谱图像，其高反射与图10A28所示的病理图像无关。这导致了一个假阳性的结果，表明肿瘤中癌症的存在更大。DMEM对水的折射率和吸收系数同样高，如图10C 19和10D 10D19所示，因此强烈建议在成像前正确干燥肿瘤。19

Figure 10
图10：使用滤纸从DMEM溶液中取出的肿瘤成像效果，（A） 肿瘤的低功耗病理图像#ND10405。（B） 在频率范围内肿瘤#ND10405的 THz 功率光谱图像 0.5 THz=1.0 THz. （C） DMEM、PBS 和水的传输折射率图范围为 0.15 THz~3.5 THz.（D ） DMEM 的传输吸收系数 （cm+1）图， PBS和水范围从0.15 THz~3.5 THz.图10A，10B从T.Bowman等人28号重新发布，获得IEEE和图10C的许可，图10D由N.Vohra等人19重新发布，请点击此处查看此图的较大版本。 10B

图11显示了肿瘤#ND11713不遵循协议的另一个例子。在这种情况下，当肿瘤被放置在板上进行成像程序时，聚苯乙烯板和肿瘤之间的气泡没有去除。这导致图11B中THz图像的反射率低，从而无法与图11A中的病理学进行准确的比较。因此，如果将肿瘤放在板上后观察到任何气泡，请用钳子按压肿瘤或抬起肿瘤，轻轻将其滚到聚苯乙烯上，直到气隙被移除。

Figure 11
图11：聚苯乙烯板和肿瘤之间存在气泡引起的THz图像中的伪影。（A） 肿瘤#ND11713的低功耗病理图像。（B） 肿瘤#ND11713的THz功率光谱图像频率范围为0.5~1.0 THz。请点击这里查看此图的较大版本。

同一样品（# ND14139）的透镜光谱结果18如图12所示。肿瘤部分取自点Icon 1和Icon 1图12A，并按照协议进行特征。根据图12B中的病理图像，两个选定的点都是从肿瘤中的肿瘤组织区域取出来的。图12C、D给出了两个肿瘤部分的提取吸收系数和折射率。这两个点对整个频率范围都表现出良好的一致。图 12C和图12D中的 0.15⁄2 THz 的黑色曲线表示从文献23中获取的数据，用于比较我们作品中获得的结果。

Figure 12
图12：使用THz透镜#ND14139乳腺癌肿瘤的表征。（A） 肿瘤的照片有两个选定点Icon 1标记Icon 1，从中切割肿瘤的 0.5 毫米厚部分用于传输光谱测量。（B） 肿瘤的低功耗病理图像。（C） 在点Icon 1和Icon 1下，传输吸收系数 （cm+1）的图范围为 0.15×3.5 THz。（D） 传输折射率图在点Icon 1和Icon 1时范围为 0.15~3.5 THz。图重新公布从T.鲍曼等人18在得到SPIE的许可。请点击此处查看此图形的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

新鲜组织的有效THz反射成像主要取决于两个关键方面：1） 正确考虑组织处理（第 2 节和第 4.15 节）;和 2） 舞台设置（主要是第 4.11 节）。由于 DMEM 和其他液体的高反射，组织干燥不足会导致反射增加，无法可视化区域。同时，与成像窗口的不良组织接触会在 THz 反射图像中产生环或低反射点，从而掩盖结果。应作出额外努力，确保组织与成像窗口有良好的接触，包括重新定位组织以获得更好的界面。对于组织表征，必须仔细实施阶段设置的其他注意事项。即使几微米的阶段平衡不当，也可能导致计算出的折射率和组织吸收系数发生显著变化。这也是由于在将组织安装到成像窗口时对组织施加了过大的压力，这可能导致聚苯乙烯板的弓形。为了进行准确的计算，还必须从图像的同一相平面获得为表征选择的参考信号，以避免人为相移。

可以修改协议的主要区域是用于安装组织的介电材料，如石英（第 3.6-3.7 节）和聚苯乙烯（从第 4.5 节开始）。只要所选窗口材料均匀厚，吸收度低，与肿瘤具有良好的信号相互作用，其他材料就可以替代。应提前评估材料，以确定它们是否提供了适当的相平面。或者，对于将修复成像窗口的系统，可以通过描述从空窗口扫描计算的相移来解决不均匀的窗口厚度。在如何安装组织以运送到病理学家方面，还有一些修改的余地。虽然组织标记染料在这里使用不合时宜，但重要的是有一种方法，使THz成像和病理学进行比较。该协议的主要故障排除问题将涉及获得良好的 THz 信号和建立适当的窗口，这将取决于所使用的特定系统。

任何新鲜组织处理技术的主要限制是组织暴露在空气中的时间。这种协议的设计，使组织可以保持暴露不超过1小时，以避免分解之前病理评估。这也反映在图像的步长大小的选择中。该协议中的 THz 系统可以以 50 μm 的增量达到 50~500 μm 的任何步长大小，但由于 THz 信号的光谱含量，系统的最大空间分辨率约为 80 μm。协议中的200μm步长提供了足够的细节，同时保持了30分钟的合理扫描时间。 我们的咨询病理学家对肿瘤样本的评估确定，这种空气暴露量不会在细胞水平上以可观察的方式对组织造成损害。然而，明胶等材料可用于提供清晰的THz成像，而不会过度干燥，并可能研究未来对协议29的更新。为了有效地利用时间，在将组织从DMEM中取出之前，可以执行使用干氮清除系统、设置成像或光谱等步骤。这对将来的术中应用也很重要，因为成像所花时间是将 THz 成像实现到手术工作流程的关键因素。

术中使用这种协议意味着在评估肿瘤的手术边缘从几天或几周到几分钟的时间可能会显著减少。将来，当 THz 系统的硬件改进以使用 THz 摄像机而不是步进电机扫描仪时，将实现此目的。目前术中采用的最相似的方法是标本放射成像，它采用切除肿瘤的X射线传输图像，由放射科医生进行解释，以确定组织表面是否存在癌症。所述的成像协议提供了一种直接成像组织表面的方法。新切除的乳腺癌肿瘤的治疗方案也可用于任何其他类型的新鲜切除固体肿瘤898，9，10，1110,11的表征和成像。,虽然这份手稿侧重于按照所述协议对新切除的乳腺肿瘤进行成像，但相关正式固定石蜡嵌入组织块的THz成像也已成功验证为病理学14、15、16、17、19。14,15,16,17,19成像协议类似于这里提出的，可以开发病理支持分析嵌入式组织。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

提交人声明他们没有利益冲突。

Acknowledgments

这项工作由国家卫生研究院（NIH）奖（R15CA208798）资助，部分由美国国家科学基金会（NSF）奖1408007资助。脉冲THz系统的资金是通过NSF/MRI奖1228958获得的。我们承认使用国家疾病研究交流会 （NDRI） 在 NIH 赠款 U42OD11158 的支持下采购的纸巾。我们还感谢与俄克拉荷马州立大学俄克拉荷马动物疾病诊断实验室合作，对本工作处理的所有组织进行组织病理学程序。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% isopropyl alcohol VWR 89108-162 Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water
Alconox powder detergent VWR 21835-032 Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass
Bio Hazard Bags Fisher Scientific 19-033-712 Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags
Cardboard holder N/A N/A Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin
Centrifuge Tubes VWR 10026-078 Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line
Cotton Swabs Walmart 551398298 Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue
Ethyl Alcohol VWR 71002-426 KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol
Eye protection goggles VWR 89130-918 Kimberly-clark professional safety glasses
Face Mask VWR 95041-774 DUKAL Corporation surgical masks
Filter paper Sigma Aldrich Z240087 Whatman grade 1 cellulose filters
Formalin solution Sigma Aldrich HT501128-4L 10% neutral buffered formalin
Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) National Disease Research Interchange (NDRI biobank N/A A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required
IRADECON Bleach solution VWR 89234-816 Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution
KIMTECH SCIENCE wipes VWR 21905-026 Kimberly-clark professional Kim wipes
Laboratory Coat VWR 10141-342 This catalog number is for medium size coat
Laboratory tweezers/Forceps VWR 82027-388 Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue
Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) TeraView, Ltd N/A 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows
Nitrile hand gloves VWR 82026-426 This catalog number is for medium size gloves
Nitrogen cylinder Airgas NI UHP300 NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300
Paper towel VWR 14222-321 11" x 8.78" Sheets, 1 Ply
Parafilm VWR 52858-076 Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion.
Petri Dish VWR 470210-568 VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom)
Polystyrene Plate Home Depot 1S11143A ~ 10 cm x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet
ScanAcquire Software TeraView, Ltd N/A System Software for THz reflection imaging measurements
Stainless steel low-profile blade (#4689) VWR 25608-964 Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades
Stainless steel metal tray Quick Medical 10F Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays
Tissue Marking Dyes Ted Pella, Inc Yellow Dye #27213-1
Red Dye #27213-2
Blue Dye #27213-4		 Used to orient excised tissue samples
sent to the histopathology laboratory
TPS Spectra 3000 TeraView, Ltd N/A THz imaging and spectroscopy system
TPS Spectra Software TeraView, Ltd N/A System Software for THz transmission spectroscopy measurements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burford, N. M., El-Shenawee, M. O. Review of terahertz photoconductive antenna technology. Optical Engineering. 56 (1), 010901 (2017).
  2. Sun, Q., et al. Recent advances in terahertz technology for biomedical applications. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 7 (3), 345-355 (2017).
  3. Wilmink, G. J., et al. In vitro investigation of the biological effects associated with human dermal fibroblasts exposed to 2.52 THz radiation. Lasers in Surgery and Medicine. 43 (2), 152-163 (2011).
  4. Arbab, M. H., et al. Terahertz spectroscopy for the assessment of burn injuries in vivo. Journal of Biomedical Optics. 18 (7), 077004 (2013).
  5. Sy, S., et al. Terahertz spectroscopy of liver cirrhosis: investigating the origin of contrast. Physics in Medicine and Biology. 55 (24), 7587-7596 (2010).
  6. Yu, C., Fan, S., Sun, Y., Pickwell-Macpherson, E. The potential of terahertz imaging for cancer diagnosis: A review of investigations to date. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 2 (1), 33-45 (2012).
  7. El-Shenawee, M., Vohra, N., Bowman, T., Bailey, K. Cancer detection in excised breast tumors using terahertz imaging and spectroscopy. Biomedical Spectroscopy and Imaging. 8 (1-2), 1-9 (2019).
  8. Yamaguchi, S., et al. Brain tumor imaging of rat fresh tissue using terahertz spectroscopy. Scientific Reports. 6 (30124), 1-6 (2016).
  9. Rong, L., et al. Terahertz in-line digital holography of human hepatocellular carcinoma tissue. Scientific Reports. 5 (8445), 1-6 (2015).
  10. Park, J. Y., Choi, H. J., Nam, G., Cho, K., Son, J. In Vivo Dual-Modality Terahertz / Magnetic Resonance Imaging Using Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles as a Dual Contrast Agent. IEEE Transactions on Terahertz Science and Technology. 2 (1), 93-98 (2012).
  11. Ji, Y. B., et al. Feasibility of terahertz reflectometry for discrimination of human early gastric cancers. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1413-1421 (2015).
  12. Bowman, T., et al. A Phantom Study of Terahertz Spectroscopy and Imaging of Micro- and Nano-diamonds and Nano-onions as Contrast Agents for Breast Cancer. Biomedical Physics and Engineering Express. 3 (5), 055001 (2017).
  13. Chavez, T., Bowman, T., Wu, J., Bailey, K., El-Shenawee, M. Assessment of Terahertz Imaging for Excised Breast Cancer Tumors with Image Morphing. Journal of Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves. 39 (12), 1283-1302 (2018).
  14. Bowman, T. C., El-Shenawee, M., Campbell, L. K. Terahertz Imaging of Excised Breast Tumor Tissue on Paraffin Sections. IEEE Transactions on Antennas and Propagation. 63 (5), 2088-2097 (2015).
  15. Bowman, T., El-Shenawee, M., Campbell, L. K. Terahertz transmission vs reflection imaging and model-based characterization for excised breast carcinomas. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3756-3783 (2016).
  16. Bowman, T., Wu, Y., Gauch, J., Campbell, L. K., El-Shenawee, M. Terahertz Imaging of Three-Dimensional Dehydrated Breast Cancer Tumors. Journal of Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves. 38 (6), 766-786 (2017).
  17. Bowman, T., et al. Pulsed terahertz imaging of breast cancer in freshly excised murine tumors. Journal of Biomedical Optics. 23 (2), 026004 (2018).
  18. Bowman, T., Vohra, N., Bailey, K., El-Shenawee, M. Terahertz tomographic imaging of freshly excised human breast tissues. Journal of Medical Imaging. 6 (2), 023501 (2019).
  19. Vohra, N., et al. Pulsed Terahertz Reflection Imaging of Tumors in a Spontaneous Model of Breast Cancer. Biomedical Physics and Engineering Express. 4 (6), 065025 (2018).
  20. Jacobs, L. Positive margins: the challenge continues for breast surgeons. Annals of Surgical Oncology. 15 (5), 1271-1272 (2008).
  21. Moran, M. S., et al. Society of Surgical Oncology--American Society for Radiation Oncology Consensus Guideline on Margins for Breast-Conserving Surgery With Whole-Breast Irradiation in Stages I and II Invasive Breast Cancer. International Journal of Radiation Oncology. 88 (3), 553-564 (2014).
  22. Fitzgerald, A. J., et al. Terahertz Pulsed Imaging of human breast tumors. Radiology. 239 (2), 533-540 (2006).
  23. Ashworth, P. C., et al. Terahertz pulsed spectroscopy of freshly excised human breast cancer. Optics Express. 17 (15), 12444-12454 (2009).
  24. Doradla, P., Alavi, K., Joseph, C., Giles, R. Detection of colon cancer by continuous-wave terahertz polarization imaging technique. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 090504 (2013).
  25. Reid, C. B., et al. Terahertz pulsed imaging of freshly excised human colonic tissues. Physics in Medicine and Biology. 56 (1), 4333-4353 (2011).
  26. Teraview. Teraview.com. , Available from: https://teraview.com (2019).
  27. Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 1-9 (2018).
  28. Bowman, T., et al. Statistical signal processing for quantitative assessment of pulsed terahertz imaging of human breast tumors. 2017 42nd International Conference on Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves (IRMMW-THz). , Cancun 1-2 (2017).
  29. Gavdush, A. A., et al. Terahertz spectroscopy of gelatin-embedded human brain gliomas of different grades: a road toward intraoperative THz diagnosis. Journal of Biomedical Optics. 24 (2), 027001 (2019).

Tags

工程， 第158期， 癌症研究， 太赫兹反射成像， 太赫兹透镜， 人类乳腺癌肿瘤， 折射率， 吸收系数
新切除乳腺癌肿瘤的Terahertz成像和表征协议
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vohra, N., Bowman, T., Bailey, K.,… More

Vohra, N., Bowman, T., Bailey, K., El-Shenawee, M. Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (158), e61007, doi:10.3791/61007 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter