Vi beskriver en intracisternal injektion, der beskæftiger en nål bøjet på spidsen, der kan stabiliseres på kraniet, hvilket eliminerer risikoen for skader på den underliggende parenkym. Tilgangen kan bruges til genetisk skæbne kortlægning og manipulationer af leptomeningeal celler og til sporing cerebrospinalvæske bevægelse.
Den protokol, der er skitseret her beskriver, hvordan man sikkert og manuelt injicere løsninger gennem cisterna magna samtidig fjerne risikoen for skader på den underliggende parenkym. Tidligere offentliggjorte protokoller anbefaler at bruge lige nåle, der bør sænkes til maksimalt 1-2 mm fra duraloverfladen. Det pludselige fald i modstanden, når duralmembranen er punkteret, gør det vanskeligt at holde nålen i en stabil position. Vores metode, i stedet, beskæftiger en nål bøjet på spidsen, der kan stabiliseres mod occipital knoglen i kraniet, hvilket forhindrer sprøjten i at trænge ind i vævet efter perforering af duralmembranen. Proceduren er ligetil, reproducerbar, og forårsager ikke langvarig ubehag i de opererede dyr. Vi beskriver intracisternal injektion strategi i forbindelse med genetiske skæbne kortlægning af vaskulære leptomeningeal celler. Den samme teknik kan desuden udnyttes til at løse en bred vifte af forskningsspørgsmål, såsom sondering rolle leptomeninges i neurodevelopment og spredning af bakteriel meningitis, gennem genetisk ablation af gener angiveligt impliceret i disse fænomener. Derudover kan proceduren kombineres med et automatiseret infusionssystem til en konstant levering og bruges til sporing af cerebrospinalvæskebevægelse via injektion af fluorescerende mærkede molekyler.
Leptomeningeal celler er en fibroblast-lignende population af celler organiseret i et tyndt lag overliggende hjernen og udtrykke gener impliceret i kollagen crosslinking (f.eks Dcn og Lum), og i etableringen af en hjerne-meningeal barriere (f.eks Cldn11)1,2. Leptomeningeal celler er impliceret i en bred vifte af fysiologiske funktioner, fra streng kontrol over cerebrospinalvæske dræning3 til vejledning af neurale forfædre i udviklingslandene hjernen4,5. En nylig undersøgelse har også foreslået, at leptomeninges i den nyfødte kan havnen radiale glia-lignende celler, der migrerer ind i hjernen parenkym og udvikle sig til funktionelle kortikale neuroner6.
Leptomeningeal celler er placeret i nærheden af overfladen astrocytter og dele med dem, samt andre parenkymal astroglia, udtryk for connexin-30 (Cx30)7. Den kirurgiske procedure, der er skitseret nedenfor, giver mulighed for udbredt og specifik mærkning af disse meningeale celler via en engangs-levering af endoxifen i cisterna magna af transgene mus betinget udtrykker tdTomato i Cx30+ celler (dvs. ved hjælp af en CreER-loxP system til skæbne kortlægning). Endoxifen er en aktiv metabolit af Tamoxifen og inducerer rekombination af CreER-ekstynde celler på samme måde som Tamoxifen gør. Det er dog den anbefalede løsning til lokal anvendelse, fordi det opløses i 5-10% DMSO, i stedet for høje koncentrationer af ethanol. Derudover krydser endoxifen ikke hjerne-meningeal barrieren, hvilket muliggør specifik rekombination af leptomeningeale celler uden mærkning af den underliggende Cx30+ astrogliale population (se repræsentative resultater).
Den teknik, der præsenteres her sigter mod manuelt og sikkert at injicere forbindelsen i cerebrospinalvæsken, via direkte adgang til cisterna magna. I modsætning til andre, mere invasive procedurer, der kræver kraniotomi, denne tilgang gør det muligt at indgyde forbindelser uden at forårsage skade på kraniet eller hjernen parenkym. Således er det ikke forbundet med induktion af inflammatoriske reaktioner udløst af aktivering af parenkymale glia celler. Svarende til andre injektion strategier beskrevet før8,9,10, den nuværende tilgang er afhængig af kirurgisk eksponering af atlanto-occipital duralmembran, der dækker cisterna magna, efter stump dissektion af overliggende nakkemuskler. I modsætning til andre procedurer anbefaler vi dog brug af en nål bøjet på spidsen, som kan stabiliseres mod occipital knoglen under administration. Dette vil forhindre risikoen for nålen trænge for dybt og beskadige den underliggende lillehjernen og medulla.
Denne kirurgiske procedure er kompatibel med afstamning sporing undersøgelser, der har til formål at kortlægge ændringer i celle identiteter og migration ruter gennem parenkymale lag. Det kan også tilpasses til genetiske ablation undersøgelser, der har til formål at sonde rolle leptomeningeal celler i sundhed og sygdom, såsom deres bidrag til kortikal udvikling5 eller spredning af bakteriel meningitis3,11. Endelig kan det bruges til at spore cerebrospinalvæske bevægelse, når det kombineres med levering af fluorescerende sporstoffer i vilde type dyr.
Den protokol, der er skitseret her præsenterer en enkel og reproducerbar procedure til mærkning leptomeningeal celler til skæbne kortlægning. Vi bruger intracisternal injektion af endoxifen, en aktiv metabolit af Tamoxifen, at fremkalde udtryk for tdTomato fluorescerende reporter i Cx30-CreER; R26R-tdTomato mus12,13.
Sammenlignet med andre protokoller, der anvendes til at få adgang til cerebrospinalvæsken gennem cisterna magna<su…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Det Svenske Forskningsråd, Det Svenske Kræftselskab, Den Svenske Fond for Strategisk Forskning, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse og det strategiske forskningsprogram i stamceller og regenerativ medicin ved Karolinska Institutet (StratRegen).
Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
Shaver | Aesculap | GT420 | |
Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |