Summary

Induktion af Leptomeningeal Celler Modifikation Via Intracisternal Injection

Published: May 07, 2020
doi:

Summary

Vi beskriver en intracisternal injektion, der beskæftiger en nål bøjet på spidsen, der kan stabiliseres på kraniet, hvilket eliminerer risikoen for skader på den underliggende parenkym. Tilgangen kan bruges til genetisk skæbne kortlægning og manipulationer af leptomeningeal celler og til sporing cerebrospinalvæske bevægelse.

Abstract

Den protokol, der er skitseret her beskriver, hvordan man sikkert og manuelt injicere løsninger gennem cisterna magna samtidig fjerne risikoen for skader på den underliggende parenkym. Tidligere offentliggjorte protokoller anbefaler at bruge lige nåle, der bør sænkes til maksimalt 1-2 mm fra duraloverfladen. Det pludselige fald i modstanden, når duralmembranen er punkteret, gør det vanskeligt at holde nålen i en stabil position. Vores metode, i stedet, beskæftiger en nål bøjet på spidsen, der kan stabiliseres mod occipital knoglen i kraniet, hvilket forhindrer sprøjten i at trænge ind i vævet efter perforering af duralmembranen. Proceduren er ligetil, reproducerbar, og forårsager ikke langvarig ubehag i de opererede dyr. Vi beskriver intracisternal injektion strategi i forbindelse med genetiske skæbne kortlægning af vaskulære leptomeningeal celler. Den samme teknik kan desuden udnyttes til at løse en bred vifte af forskningsspørgsmål, såsom sondering rolle leptomeninges i neurodevelopment og spredning af bakteriel meningitis, gennem genetisk ablation af gener angiveligt impliceret i disse fænomener. Derudover kan proceduren kombineres med et automatiseret infusionssystem til en konstant levering og bruges til sporing af cerebrospinalvæskebevægelse via injektion af fluorescerende mærkede molekyler.

Introduction

Leptomeningeal celler er en fibroblast-lignende population af celler organiseret i et tyndt lag overliggende hjernen og udtrykke gener impliceret i kollagen crosslinking (f.eks Dcn og Lum), og i etableringen af en hjerne-meningeal barriere (f.eks Cldn11)1,2. Leptomeningeal celler er impliceret i en bred vifte af fysiologiske funktioner, fra streng kontrol over cerebrospinalvæske dræning3 til vejledning af neurale forfædre i udviklingslandene hjernen4,5. En nylig undersøgelse har også foreslået, at leptomeninges i den nyfødte kan havnen radiale glia-lignende celler, der migrerer ind i hjernen parenkym og udvikle sig til funktionelle kortikale neuroner6.

Leptomeningeal celler er placeret i nærheden af overfladen astrocytter og dele med dem, samt andre parenkymal astroglia, udtryk for connexin-30 (Cx30)7. Den kirurgiske procedure, der er skitseret nedenfor, giver mulighed for udbredt og specifik mærkning af disse meningeale celler via en engangs-levering af endoxifen i cisterna magna af transgene mus betinget udtrykker tdTomato i Cx30+ celler (dvs. ved hjælp af en CreER-loxP system til skæbne kortlægning). Endoxifen er en aktiv metabolit af Tamoxifen og inducerer rekombination af CreER-ekstynde celler på samme måde som Tamoxifen gør. Det er dog den anbefalede løsning til lokal anvendelse, fordi det opløses i 5-10% DMSO, i stedet for høje koncentrationer af ethanol. Derudover krydser endoxifen ikke hjerne-meningeal barrieren, hvilket muliggør specifik rekombination af leptomeningeale celler uden mærkning af den underliggende Cx30+ astrogliale population (se repræsentative resultater).

Den teknik, der præsenteres her sigter mod manuelt og sikkert at injicere forbindelsen i cerebrospinalvæsken, via direkte adgang til cisterna magna. I modsætning til andre, mere invasive procedurer, der kræver kraniotomi, denne tilgang gør det muligt at indgyde forbindelser uden at forårsage skade på kraniet eller hjernen parenkym. Således er det ikke forbundet med induktion af inflammatoriske reaktioner udløst af aktivering af parenkymale glia celler. Svarende til andre injektion strategier beskrevet før8,9,10, den nuværende tilgang er afhængig af kirurgisk eksponering af atlanto-occipital duralmembran, der dækker cisterna magna, efter stump dissektion af overliggende nakkemuskler. I modsætning til andre procedurer anbefaler vi dog brug af en nål bøjet på spidsen, som kan stabiliseres mod occipital knoglen under administration. Dette vil forhindre risikoen for nålen trænge for dybt og beskadige den underliggende lillehjernen og medulla.

Denne kirurgiske procedure er kompatibel med afstamning sporing undersøgelser, der har til formål at kortlægge ændringer i celle identiteter og migration ruter gennem parenkymale lag. Det kan også tilpasses til genetiske ablation undersøgelser, der har til formål at sonde rolle leptomeningeal celler i sundhed og sygdom, såsom deres bidrag til kortikal udvikling5 eller spredning af bakteriel meningitis3,11. Endelig kan det bruges til at spore cerebrospinalvæske bevægelse, når det kombineres med levering af fluorescerende sporstoffer i vilde type dyr.

Protocol

De kirurgiske procedurer, der blev forelagt hermed, blev godkendt af Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd og udført efter aftale med specifikationer fra forskningsinstituttet (Karolinska Institutet, Sverige). BEMÆRK: Intracisternal injektion kan fleksibelt tilpasses til flere forskningsformål. Vi præsenterer nedenfor en procedure udviklet til effektivt at mærke leptomeningeal celler til skæbne kortlægning baseret på injektion af endoxifen i en transgene mus linj…

Representative Results

Intracisternal injektion af endeoksifen i transgene mus, der udtrykker CreER under Cx30-promotor13, og en inducible fluorescerende reporter giver mulighed for specifik rekombination af leptomeningeale celler uden at mærke den nærliggende Cx30-ekspresningsoverflade og parenkymale astrocytter i cortex (figur 1). For at få adgang til cisterna magna, er det bestøvede dyr placeret med sin krop og hovedet i en vinkel på ca 120°, såled…

Discussion

Den protokol, der er skitseret her præsenterer en enkel og reproducerbar procedure til mærkning leptomeningeal celler til skæbne kortlægning. Vi bruger intracisternal injektion af endoxifen, en aktiv metabolit af Tamoxifen, at fremkalde udtryk for tdTomato fluorescerende reporter i Cx30-CreER; R26R-tdTomato mus12,13.

Sammenlignet med andre protokoller, der anvendes til at få adgang til cerebrospinalvæsken gennem cisterna magna<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Det Svenske Forskningsråd, Det Svenske Kræftselskab, Den Svenske Fond for Strategisk Forskning, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse og det strategiske forskningsprogram i stamceller og regenerativ medicin ved Karolinska Institutet (StratRegen).

Materials

Anesthesia unit Univentor 410 8323102 Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder
Anesthesia (Isoflurane) Baxter Medical AB 000890
Betadine Sigma-Aldrich PVP1
Carprofen Orion Pharma AB 014920 Commercial name Rymadil
Cyanoacrylate glue Carl Roth 0258.1 Use silk 5-0 sutures, in alternative
Medbond Tissue Glue Stoelting 50479
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Endoxifen Sigma-Aldrich E8284
Ethanol 70% Histolab 01370
Hamilton syringe (30G beveled needle) Hamilton 80300
Lidocaine Aspen Nordic 520455
Mouse head holder Narishige International SGM-4 With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame
Scissors Fine Science Tools 15009-08
Shaver Aesculap GT420
Sterile absorption spears Fine Science Tools 18105-01 Sterile cotton swabs are also a good option
Surgical separator World Precision Instrument 501897
Tweezers Dumont 11251-35
Viscotears Bausch&Lomb Nordic AB 541760

References

  1. Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
  2. Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
  3. Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
  4. Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
  5. Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
  6. Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
  7. De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
  8. Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
  9. Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  10. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
  11. Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
  12. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
  13. Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
  14. Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
  15. Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
  16. Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).

Play Video

Cite This Article
Zamboni, M., Santopolo, G., Frisén, J. Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection. J. Vis. Exp. (159), e61009, doi:10.3791/61009 (2020).

View Video