אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר
Summary
אנו מתארים הזרקה תאיים כי מעסיקה מחט כפוף בקצה כי ניתן לייצב את הגולגולת, ובכך לחסל את הסיכון של נזק על הבסיס הבסיסי. הגישה יכולה לשמש למיפוי הגורל הגנטי ומניפולציות של תאים לטומאנעיים ולמעקב אחר תנועת נוזל מוחי שדרתי.
Abstract
הפרוטוקול המתואר כאן מתאר כיצד להזריק בביטחה ובאופן ידני פתרונות דרך הcisterna מגנה תוך סילוק הסיכון לנזק על הבסיס הבסיסי. פרוטוקולים שפורסמו בעבר ממליצים באמצעות מחטים ישר כי יש להוריד למקסימום של 1-2 מ”מ מהמשטח ריר. ירידה פתאומית התנגדות פעם קרום ריר כבר נוקב מקשה לשמור על המחט במצב קבוע. השיטה שלנו, במקום זאת, מעסיקה מחט כפופה לקצה שניתן לייצב כנגד עצם העורף של הגולגולת, ובכך למנוע ממזרק לחדור לתוך הרקמה לאחר ניקוב הקרום הריר. הנוהל הוא פשוט, מנוכל, ואינו גורם לאי נוחות ארוכת טווח בבעלי החיים המופעלים. אנו מתארים את אסטרטגיית ההזרקה תאיים בהקשר של מיפוי הגורל הגנטי של תאי כלי דם ללפטואנגים. אותה טכניקה יכולה, יתר על כן, להיות מנוצל כדי להתמודד עם מגוון רחב של שאלות מחקר, כגון בדיקה את התפקיד של לטומאנטינוגים ב-נוירופיתוח והתפשטות של דלקת קרום המוח בקטריאלי, באמצעות צריבה גנטית של גנים מעורבים בתופעות אלה. בנוסף, ההליך יכול להיות משולב עם מערכת אינפוזיה יצרנית עבור מסירה קבועה משמש למעקב אחר התנועה נוזל מוחי באמצעות הזרקה של מולקולות המסומנת באופן פלואורוסקופים.
Introduction
תאים לטומאננטאל הם האוכלוסייה הדומה ביותר של תאים מאורגנים בשכבה דקה על ידי הנחת המוח וביטוי גנים מעורבים קולגן הקישור (g., dcn ו לאם), ובהקמת מחסום מאנקרום המוח (g, Cldn11)1,2. תאים לטומניניאל מעורבים במגוון רחב של תפקודים פיזיולוגיים, החל משליטה קפדנית על ניקוז נוזל השדרה השדרתי3 להדרכה של ושלתי עצביים במוח המתפתח4,5. מחקר שנערך לאחרונה הציע גם כי לפטטואנגים ב היילוד עשוי הנמל הרדיאלי של התאים הרדיאליים להגר למוח בתוך מתוך מעגל ולהתפתח נוירונים בקליפת כליה6.
תאים לטומאנציטים ממוקמים בסמיכות לפני השטח אסטרוציטים ולשתף איתם, כמו גם בנוסף astrochymal אסטרוגליה, ביטוי של קונשין-30 (Cx30)7. הליך כירורגי המתואר להלן מאפשר התוויות נרחב וספציפי של התאים האלה מנאינטיים באמצעות מסירה חד פעמי של אנקסיפן לתוך cisterna מגנה של עכברים טרנסגניים מותנית ביטוי tdTomato ב Cx30+ תאים (כלומר, באמצעות creer-loxp מערכת עבור מיפוי הגורל). אנדוקסיפן הוא מטבוליט פעיל של טמוקסיפן ומעורר שילוב של תאים של מבטא CreER באותו אופן כמו טממוקסיפן. זה, עם זאת, את הפתרון המומלץ עבור יישום אקטואלי כי הוא מתמוסס ב 5-10% DMSO, במקום ריכוזים גבוהים של אתנול. בנוסף, אנדוקסיפן אינו חוצה את מחסום המוח, ובכך מאפשר שילוב מיוחד של תאי לפטומאל, ללא תיוג של אוכלוסיית Cx30+ astroglial המשמשת כבסיס (ראה תוצאות מייצגות).
הטכניקה המוצגת כאן מכוונת באופן ידני ובטוח להזריק את המתחם בנוזל השדרתי, דרך גישה ישירה לcisterna מגנה. שלא כמו אחרים, הליכים פולשניים יותר הדורשים פתיחת גולגולת, גישה זו מאפשרת להשרות תרכובות מבלי לגרום נזק לגולגולת או המוח מכימומה. כך, הוא אינו משויך אינדוקציה של תגובות דלקתיות המופעל על ידי הפעלת תאים של המוקף מעקב. בדומה לאסטרטגיות הזרקה אחרות שתוארו לפני8,9,10, הגישה הנוכחית מסתמך על חשיפה כירורגית של קרום ריר העורף של atlanto-העורפית המכסה את cisterna מגנה, לאחר ניתוח קהה של שרירי הצוואר כיסה נחת. עם זאת, בניגוד להליכים אחרים, אנו ממליצים על שימוש במחט כפופה לקצה, אשר ניתן לייצב נגד עצם העורף במהלך הממשל. זה ימנע את הסיכון של המחט חודר עמוק מדי ופוגע המוח החלק האחורי ואת לשד.
הליך כירורגי זה תואם לחקירות מעקב אחר שושלת היוחסין המטרתן לבצע מיפוי שינויים בזהויות תאים ובנתיבי הגירה באמצעות שכבות של מסלולים. זה יכול גם להיות מותאם למחקרים הגנטי אבלציה שבכוונתך לחקור את התפקיד של תאים לטומאנאינאל בריאות ומחלות, כגון תרומתם להתפתחות קורטיקלית5 או התפשטות של דלקת קרום העין של חיידקים3,11. לבסוף, זה יכול להיות מנוצל כדי לעקוב אחר תנועת נוזל השדרה השדרתי כאשר בשילוב עם משלוח של מעוקב פלורסנט בחיות מסוג wildtype.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מציג הליך פשוט וברור לתייג תאים לטומאנציאל מיפוי הגורל. אנו משתמשים הזרקה תאיים של אנדוקסיפן, מטבוליט פעיל של טממוקסיפן, כדי לגרום לביטוי של כתבת פלורסנט tdTomato ב Cx30-CreER; . R26R. עכברים12,13–
לעומת פרוטוקולים אחרים המשמשים לקבלת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מן המועצה למחקר שוודי, האגודה לסרטן שוודי, הקרן השבדית למחקר אסטרטגי, קנוט ו אליס וולנברגים Stiftelse ואת תוכנית המחקר האסטרטגי בתאי גזע ורפואה רגנרטיבית Karolinska (StratRegen).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
