Vi beskriver en intracisternal injektion som använder en nål böjd vid spetsen som kan stabiliseras på skallen, vilket eliminerar risken för skador på den underliggande parenkym. Metoden kan användas för genetisk öde kartläggning och manipulationer av leptomeningeal celler och för att spåra ryggmärgsvätskan rörelse.
Det protokoll som beskrivs här beskriver hur man säkert och manuellt injicera lösningar genom cisterna magna samtidigt som risken för skador på den underliggande parenkym. Tidigare publicerade protokoll rekommenderar att du använder raka nålar som ska sänkas till maximalt 1-2 mm från hamburgytan. Den plötsliga minskningen av motståndet när hamburgmembranet har punkterats gör det svårt att hålla nålen i en stadig position. Vår metod använder istället en nål böjd vid spetsen som kan stabiliseras mot skallens occipitalben, vilket förhindrar att sprutan tränger in i vävnaden efter perforering av hamburgmembranet. Förfarandet är enkelt, reproducerbart och orsakar inte långvarigt obehag hos de opererade djuren. Vi beskriver intracisternal injektion strategi i samband med genetiska öde kartläggning av vaskulära leptomeningeal celler. Samma teknik kan dessutom användas för att ta itu med ett brett spektrum av forskningsfrågor, såsom sondering av rollen som leptomeninges i neuroutveckling och spridning av bakteriell hjärnhinneinflammation, genom genetisk ablation av gener som är förmodat inblandade i dessa fenomen. Dessutom kan proceduren kombineras med ett automatiserat infusionssystem för en konstant leverans och användas för att spåra cerebrospinalvätska rörelse via injektion av fluorescerande märkta molekyler.
Leptomeningeal celler är en fibroblast-liknande population av celler organiserade i ett tunt lager överlagring hjärnan och uttrycka gener inblandade i kollagen crosslinking (t.ex., Dcn och Lum), och i inrättandet av en hjärna-meningeal barriär (t.ex., Cldn11)1,2. Leptomeningeal celler är inblandade i ett brett spektrum av fysiologiska funktioner, från strikt kontroll över ryggmärgsvätskan dränering3 till vägledning av neurala förfäder i den utvecklande hjärnan4,5. En färsk studie har också föreslagit att leptomeninges hos nyfödda kan hysa radiella glia-liknande celler som migrerar in i hjärnan parenkym och utvecklas till funktionella när nervceller6.
Leptomeningeal celler ligger i närheten av ytan astrocyter och dela med dem, liksom andra parenkymala astroglia, uttryck för connexin-30 (Cx30)7. Det kirurgiska ingrepp som beskrivs nedan tillåter utbredd och specifik märkning av dessa meningeal celler via en engångsleverans av endoxifen i cisterna magna av transgena möss villkorligt uttrycker tdTomato i Cx30+ celler (dvs. med hjälp av en CreER-loxP system för öde kartläggning). Endoxifen är en aktiv metabolit av Tamoxifen och inducerar rekombination av CreER-uttrycksceller på samma sätt som Tamoxifen gör. Det är dock den rekommenderade lösningen för lokal applicering eftersom det löser sig i 5-10% DMSO, i stället för höga koncentrationer av etanol. Dessutom korsar endoxifen inte hjärnhinnebarriären, vilket möjliggör specifik rekombination av leptomeningeal celler, utan märkning av den underliggande Cx30+ astroglial befolkningen (se Representativa resultat).
Den teknik som presenteras här syftar till att manuellt och säkert injicera föreningen i ryggmärgsvätskan, via direkt tillgång till cisterna magna. Till skillnad från andra, mer invasiva förfaranden som kräver craniotomy, detta tillvägagångssätt gör det möjligt att ingjuta föreningar utan att orsaka skador på skallen eller hjärnan parenkym. Således är det inte förknippat med induktion av inflammatoriska reaktioner som utlöses av aktivering av parenkymala gliaceller. I likhet med andra injektion strategier som beskrivs före8,9,10, förlitar sig den nuvarande metoden på kirurgisk exponering av atlanto-occipital hamburg membranet som täcker cisterna magna, efter trubbig dissekering av överliggande hals muskler. Men till skillnad från andra förfaranden rekommenderar vi användning av en nål böjd vid spetsen, som kan stabiliseras mot occipitalbenet under administrering. Detta förhindrar risken för att nålen tränger in för djupt och skadar det underliggande lillhjärnan och medulla.
Detta kirurgiska ingrepp är kompatibelt med härstamningsspårningsundersökningar som syftar till att kartlägga förändringar i cellidentiteter och migreringsvägar genom parenkymala lager. Det kan också anpassas till genetiska ablation studier som avser att undersöka rollen av leptomeningeal celler i hälsa och sjukdom, såsom deras bidrag till kortikal utveckling5 eller spridning av bakteriell hjärnhinneinflammation3,11. Slutligen kan den användas för att spåra cerebrospinalvätska rörelse i kombination med leverans av fluorescerande spårämnen i wildtype djur.
Det protokoll som beskrivs här presenterar en enkel och reproducerbar procedur för att märka leptomeningeal celler för öde kartläggning. Vi använder intracisternal injektion av endoxifen, en aktiv metabolit av Tamoxifen, för att inducera uttryck av tdTomato fluorescerande reporter i Cx30-CreER; R26R-tdTomato möss12,13.
Jämfört med andra protokoll som används för att få tillgång till ryggmärgsvätskan genom cisterna magn…
The authors have nothing to disclose.
Studien har fått stöd av anslag från Vetenskapsrådet, Cancerfonden, Stiftelsen för strategisk forskning, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse och det strategiska forskningsprogrammet för stamceller och regenerativ medicin vid Karolinska Institutet (StratRegen).
Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
Shaver | Aesculap | GT420 | |
Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |