Summary
Acyl-RAC（阿西尔-树脂辅助捕获）是一种高度敏感、可靠且易于执行的方法，用于检测各种生物样品中半胱氨酸残留物（S-acycyy）的可逆脂改性。
Abstract
蛋白质S-囊化，也称为S-Palmiyyyy化，是通过小链脂肪酸，通过小链脂肪酸对半胱氨酸残留物进行可逆的转化后修饰。S-acy化正在成为一种广泛的调节机制，它可以调节蛋白质生物活性的所有方面，从复杂的形成到蛋白质的贩运和蛋白质的稳定性。最近对蛋白质S-脱化生物功能的理解取得了进展，这主要是因为新型生化工具的开发，使各种生物样品中蛋白质S-脱化能够进行可靠和灵敏的检测。在这里，我们描述了乙基树脂辅助捕获（Acyl-RAC），这是一种最近开发的方法，基于通过硫醇反应性Sepharose珠选择性捕获内质S-囊肿蛋白。与现有方法相比，Acyl-RAC 需要较少的步骤，当与质谱法相结合以识别新型 S-循环目标时，可以产生更可靠的结果。该技术的一个主要限制是缺乏通过同一硫酯键区分附着在半胱氨酸上的脂肪酸物种的能力。
Introduction
S-脱硫是一种可逆的翻译后修饰，涉及通过拉迪尔硫酯键1在靶蛋白上加入一个脂肪酸酶链到目标蛋白上的内半胱氨酸残留物。它最初被报道为用棕榈酸，一种饱和脂肪酸2的蛋白质的修饰，因此这种修饰通常被称为S-棕榈酸。除了棕榈酸盐，蛋白质可以通过各种更长和较短的饱和（硫酸和凝结酸）、单不饱和（油酸盐）和多不饱和（烷基酮和异氨酯酸）脂肪酸33、4、5、6、74,5,6,7可逆性地改变。在真核细胞中，S-acycye是由一种称为DHHC蛋白酶的酶家族催化的，半胱氨酸脱硫酶的反向反应被蛋白硫酯酶催化，其中大多数仍然保持神秘的8。
硫化物键的可浸性使这种脂质修饰可逆，使其能够动态调节蛋白质簇簇、血浆膜定位、细胞内贩运、蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质稳定性9,9、10。因此，S-囊肿与亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病和几种癌症（前列腺、胃癌、膀胱癌、肺癌、结肠直肠癌）等疾病有关，因此需要开发可靠的方法来检测这种转化后蛋白修饰11。
代谢标记与放射性（[3H]，[14C]或[125I]）棕榈酸是最早开发的方法之一，以测定蛋白质S-囊14化12，13，14。12,13,14然而，基于放射性标签的方法存在健康问题，不是很敏感，耗时，只检测高丰富的蛋白质15的脂质化。一种更快、非放射性的放射性替代无线电标签是代谢标签与生物正交脂肪酸探针，这是例行用于检测蛋白质S-囊肿16的动态。在这种方法中，含有化学报告器（烷基或阿齐德组）的脂肪酸通过蛋白质转质酶被结合到S-青化蛋白中。Azide-alkyne Huisgen环增反应（点击化学）然后可用于将一个功能化组，如氟磷或生物素，连接到一体化脂肪酸，允许检测S-囊青蛋白17，18，19。17,18,19
Acyl-生物锡交换（ABE）是广泛采用的生物化学方法之一，用于捕获和鉴定S-囊肿蛋白，绕过代谢标记的一些缺点，如不适合组织样本15。该方法可用于分析各种生物样品的S-化，包括组织和冷冻细胞样本20、21。20,该方法基于中性羟基胺对酸基组和半胱氨酸残留物之间的三酯键的选择性裂解。然后，用三醇反应生物组子捕获。生成的生物微化蛋白然后使用链球菌加罗丝进行亲和力纯化，并通过免疫凝血进行分析。
一种称为乙基树脂辅助捕获（Acyl-RAC）的替代方法后来被引入，用游脱反应树脂22，23,23取代生物微化步骤，直接结合游自由半胱氨酸。与ABE相比，这种方法的步骤较少，同样可用于检测各种样品1的蛋白质S-青化。
Acyl-RAC 由 4 个主要步骤（图 1） 组成 。
1. 阻止自由三醇组;
2. 选择性地裂解半胱氨酸-酸酯结合与中性羟基胺（HAM），以暴露半胱氨酸硫醇群;
3. 用三醇反应性树脂捕获脂质化半胱氨酸;
4. 洗脱后选择性富集S-青化蛋白，减少缓冲。
然后，通过免疫凝血或进行基于质谱（MS）的质谱（MS）分析捕获的蛋白质，以评估不同种类和组织22、24、25的S-cycytttome。22,24,25通过对捕获的蛋白质的胰蛋白消化和LC-MS/MS22分析产生的肽，也可以识别个别S-青化位点。在这里，我们演示了如何使用 acyl-RAC 同时检测细胞系和组织样本中多个蛋白质的 S-acy 化。
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Protocol
根据NIH准则，该协议中使用的小鼠被安乐死。休斯敦得克萨斯大学健康科学中心的动物福利委员会批准了所有动物工作。
1. 细胞水球的制备
- 准备如表 1中所述的集塞缓冲区。到 10 mL 的 PBS 中，加入 0.1 克 n-多代乙酯 +D-麦芽糖洗涤剂 （DDM）并旋转以溶解。加入100 μL磷酸酶抑制剂鸡尾酒2、ML211（10μM）、PMSF（10 mM）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1倍），并在使用前将缓冲液冷却在冰上。
- 将包含细胞从培养箱中携带细胞的介质转移到15 mL或50 mL锥形管和旋转细胞350 x g，5分钟，吸气以清除任何细胞碎片。
注：我们使用1 x 107细胞进行每个乙基RAC反应。 - 将颗粒重新悬浮在 5 mL PBS 中，以 350 x g旋转 5 分钟，以冲洗颗粒。
注：快速执行步骤 1.3，以避免由于 PBS 中延长孵育而导致的细胞性水球。 - 将步骤 1.1 制备的 600 μL 的压网缓冲液添加到颗粒中，并在 4°C 下在热摇床中以 1500 rpm 的转速摇动 30 分钟，将其压碎。
- 在4°C下以20，000 x g的速度进行离心，以30分钟清除除状剂-不溶性材料。在预冷却的 1.5 mmfuge 管中收集清除的液化液，并将其保存在冰上。
- 执行布拉德福德/BCA测定，以估计蛋白质浓度。在进行实验之前，确保不同样品中的蛋白质含量相同至关重要。我们建议每次反应至少使用500μg的蛋白质。
注：在描述的实验中，我们使用小鼠组织的培养细胞和原发性全球。上述的lysis方法也可以用于其他细胞类型。上述细胞类型获得的平均蛋白质浓度约为每 1 x 107细胞 500 μg。Jurkat细胞保存在RPMI-1640介质中，改性为含有2 mM L-谷氨酰胺，10 mM HEPES，1 mM丙酮钠，4，500毫克/升葡萄糖，1，500毫克/L碳酸氢钠补充10%的FBS在37°C与5%的CO2。我们每次反应使用1 x 107 Jurkat细胞。原发性性囊肿从小鼠脾脏组织中分离出来，如26日所述。简单地说，脾组织在冰上被浸渍，然后是低毒溶液中的红细胞裂解，通过离心与淋巴细胞分离。我们每次反应使用1 x 107原细胞。
2. Acyl-RAC：阻止自由硫醇组
注：所有后续步骤都可以在室温 （RT） 下执行。
- 将电解质转移到新鲜的1.5mL微熔管中，并执行氯仿甲醇（CM）沉淀，如下所述。
- 将甲醇 （MeOH） 和氯仿 （CHCl3） 添加到以最终液化成比的液化酶中：MeOH：CHCl3的 2：2：1，并大力摇动以创建均匀的悬浮液。
- 在水相和有机相间以 10，000 x g旋转 5 分钟，形成颗粒（"煎饼"）。
- 使用针头或凝胶装载尖端倾斜管并吸吸尽可能多的溶剂。
- 空气干燥蛋白质颗粒几分钟，并通过加入600μL的MeOH轻轻清洗，并轻轻混合，以避免分解颗粒
- 小心地取出剩余的 MeOH，并将蛋白质颗粒干燥约 5 分钟。
- （可选）执行额外的离心步骤，在 MeOH 洗涤后旋转任何破碎的颗粒，以避免样品丢失。
注： CM 沉淀步骤后，可以停止实验。获得颗粒后，可在 -20 °C 下储存在 500 μL 的 MeOH 中，长达一周。- 通过在热振动器中以 42°C/1500 rpm 的转速涡旋，将蛋白质颗粒溶解在 2SHB 缓冲液的 200 μL 中，直到颗粒溶解。
- （可选）在声波水浴中孵育5~10分钟以溶解颗粒。
注：声波的长度因材料的溶解度而异。然而，长时间的声波会导致蛋白质降解。
- 通过在2SHB中加入2μLMMTS到998μL的2SHB缓冲液，在2SHB中制备0.2%的甲基甲烷硫化硫化物（v/v）。
注：每次实验均使用新鲜准备的0.2%MMTS。 - 将200 μL 0.2% MMTS添加到每个管，最终浓度为0.1%MMTS。在42°C下孵育15分钟，在1500rpm的热振动器中摇动。
3. 阿基-RAC：羟基胺（HAM）裂解和S-青化蛋白的捕获
- 重复上述 3-4 倍 CM 沉淀以删除 MMTS。MMTS 的去除可以通过缺少明显的彩信气味来估计。每次沉淀后，通过在热振动器中以42°C/1500 rpm的涡旋将颗粒溶解在2SHB缓冲液的100 μL中，直到颗粒溶解，然后用300μL的缓冲液A稀释。
- 最终沉淀后，如上文所述，将样品溶解在200μL的2SHB缓冲液中，用240μL的缓冲液A稀释。
- 在比较S-acycy在响应多种治疗条件的变化的情况下，再次测量蛋白质浓度，并为每个情况进行等量的蛋白质。
- 将每个样品中的 40 μL 保留为输入控制。
- 将样品分成200μL的两个相等部分，并将管标记为"+HAM"和"-HAM"。将50 μL的新鲜制备中性2 M HAM（pH 7.0-7.5）的最终浓度添加到其中一个管（+HAM）和50 μL中性2 M NaCl到第二管（- HAM），后者将用作负控制。继续添加硫丙基-塞帕罗斯（TS）珠子。
注： 实验可以在任何 CM 沉淀步骤后停止。获得颗粒后，可在 -20 °C 下储存在 500 μL 的 MeOH 中，长达一周。2 M HAM 的中性 pH 可确保其选择性为乙基-半胱氨酸键，应仔细调整。在 2SHB 缓冲液中处理样品时应小心谨慎，以避免因过度发泡而丢失样品。所有以下步骤对于 - HAM 和 + HAM 样品都是相同的。 - 在每个管中加入 30 μL TS 珠浆，在 RT 处旋转管 1-2 小时。
- 在缓冲 A 中用 1% SDS 清洗 TS 珠 4x，去除残留的 HAM。
- 使用微熔胶轻轻旋转所有珠子样品 1 分钟，并小心吸气上清液。
- 在缓冲 A 中重新挂起 500 μL 1% SDS 的珠子。
- 重复步骤 3.7.1~3.7.2 三次。
注：活性硫丙基-塞帕罗斯（TS）在添加剂存在的情况下提供冷冻干燥，在耦合前必须在中性pH下冲走。建议蒸馏水用于肿胀和洗涤。称重 0.1 克珠子，重新悬浮在 1 mL 蒸馏水中，使其在 RT. Wash 珠 1x 与缓冲液 A 的洗涤珠 1x 旋转时膨胀，并准备具有缓冲 A 的泥浆，比例为 50% 稳定介质至 50% 缓冲液。在4°C至一周内，在20%乙醇存在的情况下，膨胀TS可储存在中性pH值。不要使用氧化钠作为细菌活性剂，因为紫酰离子与2-二硫化物组发生反应。为提高效率，请准备新鲜的珠子。在处理珠子时，P200移液器尖端的尖端可以稍微切割，以防止任何损坏。
注：在 CM 沉淀后，可以在任何阶段停止实验。颗粒可储存在 -20 °C 至一周的 500 μL 中。
4. S-青化蛋白的排泄和检测
- 最后一次洗涤后，轻轻旋转上文所述的珠子，在不影响珠子的情况下尽可能吸气上清。
- 使用 DTT 使用 4x SDS 样品缓冲液从珠子中回收蛋白质。
- 将 50 μL 的 4x SDS 样品缓冲液添加到珠子中，并在 80°C 下孵育 1500 rpm，在热摇床中孵育 15 分钟。让管子冷却。
- 将珠子离心 5，000 x g 3 分钟，以完全颗粒珠子，并使用凝胶加载尖端将洗脱的蛋白质转移到新鲜的 1.5 mL 管中。
- 运行SDS-PAGE，并通过西方印迹分析感兴趣的蛋白质的S-acy化。
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Representative Results
按照上述协议，我们首先使用acyl-RAC同时检测Jurkat细胞中几种蛋白质的S-化，这是一种不朽的T细胞系，最初来自T细胞白血病患者27的外周血。先前被鉴定为S-acy化99、28、2928,29的调节性T细胞蛋白被选择来证明这种方法的效用。如图2A所示，酪氨酸激酶Lck可以在用中性2 M羟基胺治疗的碱液中检测到，以在半胱氨酸残留物和脂肪酸乳酸（+HAM通道）之间割出硫化物键。用2 M NaCl（-HAM通道）处理的样本代表一个重要的负控制，表明检测硫化物键的测定的选择性。输入通道进一步确认信号的特异性，如果感兴趣的蛋白质未S-囊化，则可作为正控制。然后，膜被剥离，然后用抗体对蛋白Fyn和LAT进行重新探测，以证明acyl-RAC测定可用于同时分析多种蛋白质的S-囊肿（图2A）。
为了证明该方法在组织样品中检测蛋白质S-青化的效用，我们在小鼠脾脏上应用了acyl-RAC协议。如图2B所示，在原鼠性囊中很容易检测到Lck、Fyn和LAT的S-acycy，表明这种修饰在两个物种之间被保存。
图 1.acyl-RAC 的原理图表示。该方法包括4个主要步骤：（1）用甲基甲烷硫化硫化物（MMTS）阻断自由硫醇群;（2）选择性裂解半胱氨酸-乙酰硫化物结合中性羟基胺（HAM），以暴露半胱氨酸硫醇群， （3） 通过直接结合与thiol反应树脂进行捕获新暴露的半胱氨酸thiol蛋白，（4） 使用减少洗脱缓冲液回收捕获的蛋白质，然后进行免疫印注或MS分析。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2.检测S-青化蛋白。一种乙酰-RAC测定法用于检测Jurkat T细胞（A）和鼠脾组织（B）中T细胞信号蛋白的S-化。使用Lck、Fyn和LAT特异性抗体进行免疫膨胀，显示这些蛋白质在羟基胺处理样品（+HAM通道）中具有S-acy。用氯化钠（-HAM通道）处理的样品作为负控制。输入通道中将显示未经处理的解功能。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 缓冲区 | 组成 | 笔记 |
| 电解缓冲液 （LB） | DPBS 中的 1% DDM;10 μM ML211;磷酸酶抑制剂鸡尾酒2（1：100）;蛋白酶抑制剂鸡尾酒 （1X）， PMSF （10 mM） | 使用前在4°C下准备新鲜、冷藏。 |
| SDS 缓冲区 （2SHB） | 2% SDS;5 mM EDTA;100 mM HEPES;pH 7.4 | |
| 缓冲区 A | 5 mM EDTA;100 mM HEPES;pH 7.4 | |
| 羟基胺 （HAM） | 蒸馏 H20 中的 2 M 库存溶液 | 准备新鲜。当第一次溶解时，HAM的pHH非常低。使用 5 M NaOH 将 PH 到 7-7.5。 |
| 4X SDS 样品缓冲区 | 200 mM 三酯-Cl （pH 6.8）， 8% SDS （硫酸钠） 0.01% 溴酚蓝， 10% 甘油 | 使用前补充5 mM DTT。 |
表 1：协议中要求的常见缓冲区的缓冲区的缓冲区组成。2SHB 缓冲液和缓冲区 A 可以提前准备，但必须定期检查其 pH。Lysis 缓冲液和 HAM 必须在实验当天做好准备。
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Discussion
在这里，我们成功地利用acyl-RAC测定检测培养的人类细胞和从小鼠组织中提取的原发细胞中选定蛋白质的S-化。该方法简单、灵敏，使用标准生物化学技术，在设备要求极小的情况下，易于执行。该方法已被证明能够成功地识别新的S-囊肿蛋白，如蛋白质转移系统（Sec61b）、核糖蛋白S11（Rps11）和微体谷胱甘肽-S-转移酶3（MGST3）22。22acyl-RAC的敏感性和适应性使其适合在各种生物样品中研究蛋白质S-青化。
S-囊肿蛋白的相当一部分可能与血浆膜中富含糖磷脂的部分有关，也称为脂质筏。因此，如果使用轻度洗涤剂，如Triton X-100、NP-40或Brij58，用于lysis30，一些S-囊化蛋白可能无法完全提取。离子洗涤剂（如SDS）或基于麦芽侧的非离子洗涤剂（如n-多代乙酰β-D-麦芽糖（DDM））可用于确保脂质筏的分离和感兴趣的蛋白质完全回收30，31，32。30,31,32在该协议中，我们使用DDM，一种温和的，脂质类的非离子洗涤剂，已被证明是有效的膜蛋白提取，并保持其稳定的原生状态在很长一段时间33。
样品的滑酶在分解过程中不受监管的硫化物活性可能导致TS下拉步骤后蛋白质产量下降，从而影响S-青化蛋白的检测。可添加硫酯酶抑制剂，如ML211，一种用于阿基蛋白硫化物酶1（APT1，LYPLA1）和Acyl-蛋白硫化物2（APT2，LYPLA2）的双抑制剂，以防止在碱化34，35,35中蛋白质的滥杀解。
对半胱氨酸残留物的不完全封锁会导致非青化蛋白与TS结合，从而产生高背景，在_HAM样品中出现高信号。背景结合可以通过额外的孵育与硫醇交联剂-2，2'-二恶二磷酰胺，如周等人36在修改的ABE协议所述， 大幅减少。
与代谢标记相比，acyl-RAC 并不限于活细胞，可以检测新鲜分离或冷冻组织样本中的蛋白质 S-青化。由于acyl-RAC协议避免了免疫沉淀步骤，它可用于同时检测同一检测中感兴趣的多种蛋白质的脂质化，从而有可能减少单个实验所需的生物材料量。然而，基于代谢标签的测定更适合用于旨在专门检测脱离S-acycy或测量感兴趣的蛋白质上的脂肪酸周转率的实验。acyl-RAC的另一个重要限制是，这种技术无法区分不同的脂肪酸，这些脂肪酸可以通过相同的硫化物键33、4、5、6、74,5,6,7与半胱氨酸残留物同时结合。
acyl-RAC 和 ABE 测定均基于半胱氨酸残留物和脂肪酸之间的硫化物键的选择性裂解，以揭示自由硫醇组。由于 acyl-RAC 使用硫醇反应树脂直接下拉 S-囊化蛋白，与 ABE 相比，此方法所需的步骤更少。虽然类似的，蛋白质全范围的S-青化研究表明，使用这两种方法检测到的蛋白质有一些变化，很可能是由于技术差异。例如，在大鼠大脑同质化中，基于ABE的分析确定了241种S-囊肿蛋白，而基于acyl-RAC的分析则确定了14425个。大鼠脑蛋白酶体的61种蛋白质通常通过这两种方法检测，强调需要使用多种技术来确定蛋白质的S-囊肿状态。
acyl-RAC 和 ABE 方法的另一个潜在缺点是无法可靠地评估 S-acycyeee 的血型，并确定脂质化半胱氨酸的数量。为了解决这些限制，开发了一种称为acyl-PEG交换或PEG移位测定的技术37,修改方法。在这种方法中，羟基苯胺裂解后的下拉步骤被用PEG-maleimid质量标记的孵育取代。通过SDS-PAGE，可以观察到暴露的自由半胱氨酸残留物的培化。
总之，acyl-RAC是一种快速、灵敏、可靠的方法，可在各种生物样品中为各种生物样品中各种生物样本中生理和病理生理条件下蛋白质S-脱硫动力学提供有价值的见解。考虑到上述方法的局限性，建议将acyl-RAC与其他技术相结合，以充分描述感兴趣的蛋白质的S-acy化。
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Disclosures
未声明任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院提供的5R01GM115446和1R01GM130840的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| Hydroxylamine (HAM) | Sigma | 159417 | |
| Methyl methanethiosulfonate (MMTS) | Sigma | 64306 | |
| Mini tube rotator | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm Cool-Heat-Shake | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) | Sigma | D641 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
| Thiopropyl-Sepharose 6B (TS) | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex Sonicator | L & R |
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